JP2003504049A - ニトリラーゼ活性を安定化し、そして微生物細胞を保存するための方法 - Google Patents

ニトリラーゼ活性を安定化し、そして微生物細胞を保存するための方法

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JP2003504049A JP2001509482A JP2001509482A JP2003504049A JP 2003504049 A JP2003504049 A JP 2003504049A JP 2001509482 A JP2001509482 A JP 2001509482A JP 2001509482 A JP2001509482 A JP 2001509482A JP 2003504049 A JP2003504049 A JP 2003504049A
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Abstract

(57)【要約】 ニトリラーゼ活性を有する固定化された、または固定化されていない微生物細胞を保存し、固定化された、または固定化されていない微生物細胞のニトリラーゼ活性を安定化する方法が開発された。固定化されていない、または固定化された微生物細胞は、重炭酸塩または炭酸塩のアンモニウム、ナトリウムおよびカリウム塩を含む重炭酸塩または炭酸塩の約0.10Mから飽和濃度を含む水溶液中に保存される。少なくとも100mMの重炭酸塩または炭酸塩を含む水性懸濁液は、保存した酵素触媒の微生物混入を制限し、ならびに固定化されていない、または固定化された細胞の所望のニトリラーゼ活性を安定化する。ニトリラーゼ活性を特徴とし、本発明の方法により安定化および保存される微生物には、アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72-PF-15（ATCC 55747）、アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facil is）72-PF-17（ATCC 55745）、アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W（ATCC 55746）、およびニトリラーゼ活性を有する形質転換した微生物細胞、好ましくはアシドボラックス ファシリス(Acidovorax f acilis）72Wニトリラーゼ活性で形質転換した大腸菌（E.coli）SS1001（ATCC PTA-1177）を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 発明の分野 本発明は、微生物学および分子生物学の分野に関する。より詳細には固定化さ
れていない、または固定化された微生物細胞のニトリラーゼ活性を安定化し、そ
して微生物細胞の完全性を保存するための方法が開発され、ここで固定化されて
いない、または固定化された微生物細胞は、重炭酸塩または炭酸塩のアンモニウ
ム、ナトリウムおよびカリウム塩を含む、重炭酸塩または炭酸塩の無機塩の約0.
100Mから飽和濃度を含有する水溶液に保存される。
【０００２】 発明の背景 ニトリル加水分解酵素の存在は、広く記載されてきた。この酵素ファミリーの
中で、２つの主要な種類が一般に認識されている。１つ目はニトリルヒドラター
ゼであり、この酵素は１分子の水をニトリルに付加することを触媒し、対応する
アミドの形成をもたらす： 反応１ R-CN ＋ H2O → RCONH2 ２つ目の群は、２分子の水をニトリルに付加することを触媒し、対応するアミ
ドを形成せずに対応するカルボン酸に加えてアンモニアの直接形成をもたらすニ
トリラーゼを含む： 反応２ R-CN ＋ 2H2O → RCOOH ＋ NH3 芳香族または脂肪族ニトリラーゼを含む細胞は、アミドの中間体を形成せずに
水溶液中でニトリルを対応するカルボン酸アンモニウム塩に直接転換するために
使用された（Kobayashi et al.,FEMS Microbiol.Lett.120:217-234(1994)）。ニ
トリラーゼ活性を有する細胞には、ロドコッカス ロドクロス（Rhodococcus rh odochrous ）K22（Kobayashi et al.,Tetrahedron 46:5587-5590(1990)：Kobayas
hi et al.,J.Bacteriology 172:4807-4815(1990)）、コマモナス テストステロ
ニ(Comamonas testosteroni）（米国特許第5,629,190号および同第5,635,391号
明細書；Levy-Schil et al.,Gene 161:15-20(1995))、ロドコッカス ロドクロ
ス（Rhodococcus rhodochrous）NCIMB 11216（Gradley et al.,Biotechnology L ett .16:41-46(1994)：Bengis-Garber et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.32:11
-16(1989))、およびロドコッカス ロドクロス（Rhodococcus rhodochrous）J1
（Kobayashi et al.,Eur.J.Biochem.182:349-356(1989)）を含む。配列が決定さ
れたそのようなニトリラーゼの中で、独特な保存された活性部位のシステインが
酵素的なニトリル水和の原因である官能基として同定された（Levy-Schil et al
.,Gene 161:15-20(1995))。システイン−触媒化ニトリラーゼ活性を安定化する
ための典型的な方法は、mM濃度のジチオスレイトール（DTT）および／またはエ
チレンジアミン四酢酸（EDTA）を、単離された酵素または全細胞を含有する水性
バッファーに包含することであった。
【０００３】 細胞または固定化された細胞の懸濁液を保存する方法は、欧州特許出願公開第
0707061号明細書に記載され、ここで保存溶液はリン酸塩、硼酸塩、硫酸塩、亜
硫酸塩および塩酸塩から成る群から選択される少なくとも１つの無機塩を含む。
包含される塩の種類は、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウム塩である。こ
れらの塩の濃度は、約100mMから無機塩の飽和濃度の範囲である。ゴルドナ テラ
（Gordona terrae）MA-1のニトリラーゼ活性を保存するためのこれらの無機塩の
使用が示された。日本国特許出願第10042885-A2号明細書は、ニトリルをニトリ
ル−加水分解活性を有する微生物に由来する培養基、細胞、細胞調製物、酵素ま
た酵素調製物を用いて、H2CO3または炭酸塩を含む水性反応混合物中で処理する
ことによるアミドおよび／または有機酸の生産を記載し、ここでH2CO3または炭
酸塩の包含がニトリルに対するニトリル−加水分解酵素の観察された活性を増す
と報告され；保存した時に時の経過による細胞のニトリル-加水分解活性の安定
性の向上は開示していない。
【０００４】 ニトリルヒドラターゼを含む細胞のニトリル水和活性の保存法は（ここで脂肪
族ニトリルは、続いてアミドを対応するカルボン酸アンモニウム塩に転換するこ
となく酵素的にアミドに転換される）、米国特許第4,931,391号および同第4,900
,672号明細書に記載されている。これらの固定化されていない、または固定化さ
れた微生物のニトリルヒドラターゼ活性の安定な保存法は、ニトリル、アミドま
たは有機酸から成る群から選択される少なくとも１つの化合物を、固定化されて
いない、または固定化された細胞の懸濁液に加える。
【０００５】 米国特許第4,343,900号明細書は、反応混合物中にアルカリ金属炭酸塩または
重炭酸塩を含むニトリラーゼの（nitrilasic）活性（すなわち、ニトリルヒドラ
ターゼ）を有する微生物を使用して、アクリロニトリルからアクリルアミドを生
産する方法を記載する。アルカリ金属炭酸塩または重炭酸塩は、反応中に固定さ
れた細胞の膨潤により起こる酵素活性の損失を防止するために加えられ、そして
この活性の損失は通常、反応混合物に生理食塩水またはリン酸バッファーを加え
た時には観察されない。この同じ方法で、アクリロニトリルからアクリルアミド
の生産のためにアルカリ金属炭酸塩または重炭酸塩を反応混合物に加えることは
、好ましくは有機カルボン酸の添加と組み合わせて行われ、これによりアクリロ
ニトリルがアクリルアミドに転換される間、長期間、酵素活性が維持される。
【０００６】 解決すべき問題は、ニトリラーゼ活性を安定化し、そして固定化されていない
、または固定化された細胞の懸濁液中の微生物の混入または腐敗を減らすことで
ある。様々な方法がニトリルヒドラターゼまたはニトリラーゼ活性のいずれかを
有する細胞を安定化するために使用され、ここでこれら２つの酵素活性はそれぞ
れアミドまたは酸へのニトリル加水分解を触媒するための異なるメカニズムを有
する異なる種類の酵素により生成される。種々のカルボン酸塩がニトリラーゼ活
性の保存安定性に及ぼす効果の調査では、ニトリルヒドラターゼで見られるよう
に時間の経過と共にニトリラーゼ活性の損失を防止しなかった。同様に、微生物
のニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼを保存するとしてこれまでに開示さ
れた種々の無機塩の使用は、水性懸濁液として保存した時に本発明の微生物細胞
のニトリラーゼ活性を安定化しなかった。
【０００７】 発明の要約 本発明は、述べた問題を解決する。これはニトリラーゼ活性を有する微生物細
胞の保存法およびそれらのニトリラーゼ活性を安定化する方法であり、この方法
はニトリラーゼ活性を有する固定化された、または固定化されていない微生物細
胞の水性懸濁液に、無機炭酸塩および無機重炭酸塩から成る群から選択される少
なくとも１つの化合物を加えることを含んで成り、ここで生成した水性懸濁液中
の無機塩の全濃度は100mMから無機塩の飽和濃度の範囲である。ニトリラーゼ活
性を有する微生物細胞は、アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）
72W（ATCC 55746）、アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72-PF
-15（ATCC 55747）およびアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）7
2-PF-17（ATCC 55745）から成る群から選択される。さらにニトリラーゼ活性を
含む形質転換した微生物細胞が本発明に有用である。そのような形質転換した微
生物細胞は、エイ．ファシリス(A. facilis）72Wニトリラーゼ活性を含む大腸菌
（E.coli）SS1001（ATCC PTA-1177）である。無機炭酸塩および重炭酸塩（１つ
または複数）は、好ましくは重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭
酸カリウムから成る群から選択される１以上である。この方法の条件には、ニト
リラーゼ活性を有する微生物細胞の水性懸濁液のpHが約pH６から約pH10であり、
そして微生物細胞の水性懸濁液の温度が約０℃から約45℃の範囲である場合を含
む。微生物細胞は好ましくはポリアクリルアミドゲル、アルギン酸塩またはカラ
ギーナンに固定化されている。好適な態様では、微生物細胞はカラギーナンに固
定化され、無機重炭酸塩が重炭酸アンモニウムおよび重炭酸カリウムから成る群
から選択され、そして生成した水性懸濁液中の無機重炭酸塩（１つまたは複数）
の全濃度が約100mMから約1000mMの範囲である。この方法の別の好適な態様では
、微生物細胞が固定化されず、化合物が重炭酸ナトリウムであり、そして生成し
た水性懸濁液中の重炭酸ナトリウムの全濃度が約100mMから約1000mMの範囲であ
る。別の好適な態様では、微生物細胞がアルギン酸塩に固定され、水性懸濁液に
加える化合物が重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウムか
ら成る群から選択される１以上の員であり、そして方法がさらにカルシウム塩（
好ましくは酢酸カルシウムの状態で）を水性懸濁液に約２mMから約５mMの範囲で
加える工程を含む。
【０００８】 生物寄託の簡単な記載 出願人はプタペスト条約に基づき、以下の生物寄託を行った：
【０００９】
【表１】
【００１０】 本明細書で使用するように、“ATCC"とは米国、20110-2209バージニア州、マ
ナッサス、10801ブルヴァール大学にある国際機関のアメリカン タイプ カルチ
ャー コレクションを称する。“Int'l"寄託番号は、ATCCに寄託したカルチャー
に対して割り当てられた番号である。
【００１１】 発明の詳細な説明 固定化されていない、または固定化された微生物細胞のニトリラーゼ活性を安
定化する方法を開発し、ここで細胞は限定するわけではないが、重炭酸塩または
炭酸塩のアンモニウム、ナトリウムおよびカリウム塩を含む少なくとも１つの重
炭酸塩または炭酸塩の無機塩の約0.100Mから飽和濃度を含有する水性バッファー
中に保存される。少なくとも100mMの重炭酸または炭酸塩を含有する保存溶液は
、微生物の混入または保存した酵素触媒の腐敗を有意に制限し、そしてまた固定
化されていない、または固定化された細胞の所望するニトリラーゼ活性を安定化
する。ニトリラーゼ活性を特徴とし、そしてこの方法により安定して保存される
微生物は、限定するわけではないがアシドボラックス ファシリス(Acidovorax f acilis ）72-PF-15（ATCC 55747）、アシドボラックス ファシリス(Acidovorax f acilis ）72-PF-17（ATCC 55745）およびアシドボラックス ファシリス(Acidovor ax facilis）72W（ATCC 55746）、ならびにニトリラーゼ活性を含むように形質
転換した微生物（例えばアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72
W（ATCC PTA-1177）のニトリラーゼを持つ形質転換した大腸菌（E.coli）SS1001
））を含む。
【００１２】 本開示では、多数の用語および略号を使用する。以下の定義を提供する。
【００１３】 「高圧液体クロマトグラフィー」は、HPLCと略する。
【００１４】 「ポリアクリルアミドゲル」とは、PAGと略する。
【００１５】 用語「ニトリラーゼ」とは、アミドの中間体を形成せずに、水溶液中でニトリ
ルを対応するカルボン酸に直接転換するために使用することができる酵素を称す
る（R-CN ＋ 2H2O → RCOOH ＋ NH3）。
【００１６】 用語「安定化する」とは、最初の酵素触媒活性と比べて、時の経過による酵素
活性の連続的損失が無いように、固定化されていない、または固定化された全微
生物細胞中の酵素触媒の活性を維持することを称する。この効果は、酵素触媒の
有用な寿命が延長するように、酵素触媒の調製後の酵素活性レベルを０日で観察
されるレベルと同様に維持することを称する。
【００１７】 用語「保存する」または「保存」とは、ニトリラーゼを含有する微生物細胞の
腐敗（微生物混入または細胞溶解）を防止または制限することを称する。この効
果は、この方法により処理されなかった細胞に比べて、溶解なしに細胞の完全性
を維持することにより、固定化されていない、または固定化された細胞の水性懸
濁液への混入を有意に限定することである。
【００１８】 米国特許第5,814,508号および同第5,858,736号明細書は、脂肪族α,ω-ジニト
リルから５員環ラクタムまたは６員環ラクタムの製造法を記載し、ここで脂肪族
α,ω-ジニトリルが最初に、脂肪族ニトリラーゼ（EC 3.5.5.7）活性を有する微
生物細胞を使用して水溶液中でω-シアノカルボン酸アンモニウム塩へ転換され
、続いて水溶液中での水素添加によりω-シアノカルボン酸のアンモニウム塩が
対応するラクタムへ直接的に転換される。例えばリン酸バッファーまたは生理食
塩水を含有する水溶液中の懸濁液として、この方法にニトリラーゼ活性を有する
固定化されていない、または固定化された細胞を調製しそして保存する過程にお
いて、これらの多くの溶液が約５℃から30℃の範囲の温度では微生物の混入また
は保存した触媒の腐敗を防止しないことが分かった。微生物混入または腐敗が観
察されない場合でも、ニトリラーゼ活性の有意な損失が保存中に起こった。固定
化された細胞触媒の凍結は、典型的には固定化マトリックスの破壊をもたらし、
一方固定化されていない細胞は有意な活性の損失なしに何カ月も凍結保存するこ
とができたが、この方法にはかなりの経費がかかった。このような微生物触媒を
調製した後、酵素活性の損失および腐敗なしに使用前に数週間から数カ月保存す
ることが望ましいので、保存において固定化されていない、または固定化された
微生物細胞触媒の水性懸濁液を安定に保存する方法が考えられた。
【００１９】 種々の無機塩の、固定化されていない、または固定化されたアシドボラックス
ファシリス(Acidovorax facilis）72W（ATCC 55746）のニトリラーゼ活性の保
存安定性に及ぼす効果の調査（ゴルドナ テラ（Gordona terrae）MA-1のニトリ
ラーゼ活性の安定な保存に関する欧州特許第0707061号明細書に記載されたもの
を含む）を行った。リン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム
を種々の濃度で含有する保存溶液は、時の経過によるニトリラーゼ活性の損失を
防止しなかった（添付する実施例を参照にされたい）。ニトリルヒドラターゼお
よびニトリラーゼ酵素は、それぞれアミドまたは酸へのニトリル加水分解を触媒
する異なるメカニズムを持つ異なる種類の酵素ではあるが、以前に微生物細胞の
ニトリルヒドラターゼ活性を安定化すると報告された酢酸塩またはプロピオン酸
塩のような有機酸の塩も調査した。添付する実施例に開示するように、酢酸アン
モニウムまたはプロピオン酸アンモニウムは、固定化されていない、または固定
化されたアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞のニトリ
ラーゼ活性の保存に効果は無かった。
【００２０】 限定するわけではないが、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭
酸カリウムを含む炭酸塩および重炭酸塩が、１）ニトリラーゼ活性を含む固定化
されていない、または固定化された細胞（特にアシドボラックス ファシリス(Ac idovorax facilis）72W細胞および例えばエイ．ファシリス(A. facilis）72Wの
ニトリラーゼ活性を保有するように形質転換された微生物）の懸濁液の有意な微
生物混入または腐敗を防止し、しかも２）添付する実施例に開示する結果により
示されるように、これらの懸濁液のニトリラーゼ活性を安定化する両方に効果的
であることが見いだされた。
【００２１】 ニトリラーゼ遺伝子を発現する可能性がある生物： 多くの異なる属がニトリラーゼ活性を発現するか、またはニトリラーゼタンパ
ク質を発現すると考えられている遺伝子を含むことが知られている。ニトリラー
ゼ活性を発現するグラム陰性（例えば、コマモナス（Comamonas）、アシドボラ
ックス(Acidovorax）、クレブシーラ（Klebsiella）[McBride et al.,Appl.Envi ron.Microbiol .52:325-330(1986)]、アシネトバクター（Acinetobacter）[Yamam
oto et al.,Agric.Biol.Chem.55:1459-1466(1991)]、アルカリゲネス（Alcalige nes ）［Yamamoto et al.,J.Ferm Bioeng 73:425-430(1992)]）、およびグラム陽
性（例えば、ロドコッカス（Rhodococcus)[Bhalla et al.,Acta Biotechnol 15:
297-306(1995)］、アースロバクター（Arthrobacter）[Bandyopadhyay et al.,A ppl.Envirion.Microbiol .51:302-306(1986)]、ゴルドナ（Gordona）［ゴルドナ
テラ(Gordona terrae)に由来する新規ニトリラーゼをコードするDNA。NCBI Gene
Bank ACCESSION E12616、特許：日本国特許出願第1997037788-A1 10-FEB-1997号
明細書］、バチルス（Bacillus)［Cramp et al.,Microbiol.143:2313-2320(1997
)]）の両方の細菌が知られている。植物からの多くの報告も知られている（ニコ
チアナ タバカム（Nicotiana tabacum)[Tsunoda,NCBI GeneBank,ACC.#D83078]、
アラビドプシス サリアナ（Arabidopsis thaliana）［Zhou et al.,Plant Physi ol .110,1048(1996)])、および菌類（例えばフサリウム ソラニ（Fusarium solan i )[Harper,Biochem.J.167:685-692(1977b)])。
【００２２】 高等生物（ショウジョウバエ(Drosophila)、シーノルハビディティス(Caenorh abiditis )、ホモ サピエンス(Homo sapiens)では、遺伝子はニトリラーゼタンパ
ク質をコードするらしいことが分かった［Pekarsky et al.,Proc.Natl.Acad.Sci .USA .95(15),8744-8749(1998)]。このような遺伝子について、明らかな機能は報
告されなかった。しかしそれらは既知のニトリラーゼ遺伝子との高い相同性を保
持し、そして典型的なニトリル水和活性を示すと予想される。これまでに配列決
定されたニトリラーゼ遺伝子は、活性部位に共通のモチーフを保持し（Novo et
al.,(1995)FEBS Lett.367:275-279)、すなわち本発明による保存に感受性を有す
ると期待される。
【００２３】 ニトリラーゼ遺伝子の形質転換および発現： 形質転換した宿主からのニトリラーゼ活性のヘテロロガスな発現が報告された
（Kobayashi et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.90:247;Kobayashi et al.,1992,
J.Biol.Chem.267:20746;Kobayashi et al.,1992,Biochem.31:9000-9007;米国特
許第4,810,648号明細書）。幾つかの場合では、宿主は良好な酵素活性を発現す
るために特別に修飾されなければならない（Levy-Schil et al.,1995.Gene 161:
15-20；米国特許第5,830,693号；同第5,635,391号明細書）。良好なニトリラー
ゼ活性が見いだされた場合、形質転換した宿主により発現された酵素は天然酵素
のニトリル水和活性を保持する。本発明はアシドボラックス ファシリス(Acidov orax facilis）72Wのニトリラーゼが大腸菌（E.coli）に形質転換された実施例
１１のデータにより示されるような、形質転換した宿主により発現されるニトリ
ル水和活性を保存する。
【００２４】 ヘテロロガスな宿主細胞： 活性なアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wのニトリラー
ゼタンパク質が、ヘテロロガスな宿主細胞、好ましくは微生物宿主中で生成され
得る。本発明において特に有用であるのは、大規模な発酵法に容易に適応するこ
とができる細胞である。そのような微生物は工業的なバイオプロセスでは周知で
あり、その例は「工業的および農業的応用のための組換え微生物（Recombinant Microbes for Industrial and Agricultural Applications ）」、Murooka et al
.編集、マルセルデッカー社（Marcel Dekker,Inc.）、ニューヨーク、ニューヨ
ーク州、(1994)に見いだされ、そして発酵用細菌ならびに酵母および糸状菌を含
む。宿主細胞は限定するわけではないが、コマモナス種（Comamonas sp.）、コ
リネバクテリウム種（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム種（breviba cterium sp.）、ロドコッカス種（Rhodococcus sp.)、アゾトバクター種（Azoto bacter sp.)、シトロバクター種（Citrobacter sp.)、エンテロバクター種（Ent erobacter sp.)、クロストリジウム種（Clostridium sp.）、クレブシーラ種（K lebsiella sp.）、サルモネラ種（Salmonella sp.)、ラクトバチルス種（Lactob acillus sp.)、アスペルギルス種（Aspergillus sp.)、サッカロミセス種（Sacc haromyces sp.)、チゴサッカロミセス種（Zygosaccharomyces sp.)、ピヒア種（ Pichia sp.)、クルイベロミセス種（Kluyveromyces sp.）、カンジダ種（Candid a sp.)、ハンセヌラ種（Hansenula sp.）、ドゥナリイラ種（Dunaliella sp.)、
デバリオミセス種（Debaryomyces sp.）、ケカビ種（Mucor sp.）、トルロプシ
ス種（Torulopsis sp.）、メチロバクテリア種（Methylobacteria sp.)、バチル
ス種（Bacillus sp.)、大腸菌種（Escherichia sp.)、シュードモナス種（Pseud omonas sp.）、根粒菌種（Rhizobium sp.）およびストレプトミセス種（Strepto myces sp.)を含む。特に好適であるのは大腸菌（E.coli)である。外来タンパク
質の高レベルの発現を支配する調節配列を含む微生物の発現系および発現ベクタ
ーは、当業者には周知である。
【００２５】 特定の株： アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W（ATCC 55746）を、
テキサス州、オレンジで集めた土壌から単離した。以下の培地（E2 基礎培地、p
H7.2）を用いて標準的な強化法を使用した：
【００２６】
【表２】
【００２７】 上記の培地を強化するために、E2 基礎培地に以下を補充した：株 強化 窒素源 他の補充物 エイ．ファシリス 0.2（容量／容量）％ 0.3（容量／容量）％ (A.facilis）72W エチルスクシノニトリル グリセロール 株は最初に、強化ニトリルでの成長およびアンモニア生産に基づき選択した。
単離物は、Bacto(商標)Brain Heart Infusion Ager（ディフコ(DIFCO)、デトロ
イト、ミシガン州）を繰り返し通し、続いて強化ニトリルからのアンモニア生産
をスクリーニングすることにより精製した。精製した株は、グラム陰性試験プレ
ートを使用して、Biolog(商標)試験系（ヘイワード、カリフォルニア州）でそれ
らの株の炭素源利用プロフィールに基づき同定した。
【００２８】 ニトリラーゼ活性： ニトリラーゼ活性を試験するために、10g/リットルのグルコースを含むE2 基
礎培地を使用してアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wを成
長させた。培地に25mM(±)-2-メチルグルタロニトリルを補充した。10mL容量の
補充したE2培地に0.1mLの凍結ストックカルチャーを接種した。室温（22〜25℃
）にて250rpmの振盪器で一晩成長させた後、10mLの接種物を２リットルのフラス
コ中の990mLの新たな培地に加えた。細胞は、培地に気泡を生じるために十分に
高い速度で撹拌しながら室温で一晩成長させた。細胞を遠心により回収し、50mM
リン酸バッファー(pH7.2）／15％グリセロールで１回洗浄し、そして濃縮した
細胞ペーストを直ちにドライアイス上で凍結し、そして-65℃で保存した。アジ
ポニトリル、10mMも１リットルの発酵に使用した。発酵は16〜20時間成長させた
後に止めた。細胞懸濁液を４℃に冷却し、遠心により回収し、そして0.05M リン
酸バッファー(pH7.2）中の15％グリセロールで１回洗浄した後-60℃で保存した
。
【００２９】 解凍した細胞ペーストは、ニトリラーゼ活性を試験するために使用した。微生
物の所望の特性は、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性の妨害の不存在
下で、ジニトリル化合物の位置特異的水和が可能なニトリル加水分解活性である
。微生物は突然変異を受ける傾向がある。突然変異の中には所望のニトリル転換
に都合がよい可能性がある。すなわち天然株の突然変異体も本発明の方法を行う
ために使用することができる。
【００３０】 本発明は上に述べた特定の微生物に限定されず、所望の特性を保持するそれら
の変異体および突然変異体の使用を含む。そのような変異体および突然変異体は
、ｘ−線照射、UV-照射および化学的な突然変異源のような様々な既知の手段に
より親株から生産することができる。
【００３１】 2-メチルグルタロニトリルから4-シアノペンタン酸の加水分解中に、望ましく
ない2-メチルグルタル酸副産物を生じる能力が低下したアシドボラックス ファ
シリス(Acidovorax facilis）72Wの突然変異体を、それらが炭素およびエネルギ
ー源として2-メチルグルタロニトリルを利用することができないことに基づき選
択した。具体的には、LB/スクシネート培地（１(重量／容量)％ Bacto-トリプト
ン（ディフコ、デトロイト、ミシガン州)、0.5(重量／容量)％ Bacto-酵母エキ
ス（ディフコ)、１(重量／容量)％ NaCl、0.5(重量／容量)％ コハク酸ナトリウ
ム６水和物）で成長させたアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）
72W株の一晩のカルチャーを、100μg／mLのN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグア
ニジン、突然変異誘発剤に約30分間暴露した。これによりカルチャー中、目に見
える細胞の99.9％が減少した。突然変異した細胞は、滅菌した１Mのリン酸ナト
リウムバッファー(ｐＨ7.2）中で遠心することにより突然変異原を洗い出した。
洗浄した細胞をLB/コハク酸塩培地に再懸濁し、そして30℃で一晩成長させた。
次いで細胞は滅菌した50mMのリン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ7.2）中で遠心す
ることにより洗浄し、そして0.2（容量／容量）％の2-メチルグルタロニトリル
および抗生物質、シクロセリン、0.2mg/mLおよびピペラシリン、40μg/mLを含む
E2最少培地（グルコースを含まない)に再懸濁した。細胞を30℃で一晩インキュ
ーベーションし、そして再度、滅菌した50mMのリン酸ナトリウムバッファー(ｐ
Ｈ7.2）中で洗浄した。洗浄した細胞は、非−選択培地：E2最少培地（グルコー
スを含まない）に0.2（容量／容量）％の2-メチルグルタロニトリルおよび0.5（
重量／容量）％のコハク酸ナトリウム６水和物を加えたものを含む寒天プレート
に、プレートあたり40〜100コロニー形成単位の濃度で塗った。プレートを30℃
で約48時間インキューベーションして、コロニーを発生させた。発生したコロニ
ーは選択培地：E2最少培地（グルコースを含まない）に0.2（容量／容量）％の2
-メチルグルタロニトリルを加えたものを含む寒天プレート上でレプリカを作成
した。プレートを30℃で48時間インキューベーションして、コロニーを発生させ
た。所望の性質を持つ突然変異体は選択培地で十分に成長しない。したがって48
時間後、レプリカのプレートを比較し、そして非−選択培地でのみ成長を示す株
をさらなる試験に使用した。
【００３２】 全部で約5,120個のコロニーを89プレートから検査し、そして所望の性質を持
つ19株を同定した。これらの突然変異体株は、0.2（容量／容量）％の2-メチル
グルタロニトリルを加えた液体のE2最少培地（グルコースを含まない）でさらに
成長を試験した。この培地で成長をほとんど示さないか、または成長しない株を
、0.2（容量／容量）％の2-メチルグルタロニトリルおよび0.5（重量／容量）％
のコハク酸ナトリウム６水和物を加えたE2最少培地（グルコースを含まない）か
ら成る液体培地中での成長中に、2-メチルグルタル酸を生成するそれらの能力に
ついてスクリーニングした。この方法の結果として、アシドボラックス ファシ
リス(Acidovorax facilis）72-PF-15（ATCC 55747）およびアシドボラックス フ
ァシリス(Acidovorax facilis）72-PF-17（ATCC 55745）と同定された２つの突
然変異体株を、それらの大いに減少した2-メチルグルタル酸を生産する能力から
、さらなる増殖に選択した。
【００３３】 安定化実験用の生物触媒を生成するために、以下の培地を使用することができ
る。株 培地 72-PF-15 Lauria-Bertani 培地（Bacto(商標)トリプトン、10g/L＋ Bacto(商標)酵母エキス、5g/L＋NaCl、10g/L）＋0.5 （重量／容量）％コハク酸ナトリウム・6H2O 72W E2＋１（重量／容量）％グルコース＋0.4（重量／容量）％ アジパミド 成長を開始するために、10mLの適当な培地に0.1mLの凍結ストックカルチャー
を接種した。250rpmで振盪しながら28℃で一晩成長させた後、成長している細胞
懸濁液を２リットルのフラスコ中１リットルの同培地に移し、そして振盪しなが
ら28℃で成長を続行させた。１リットルの成長している細胞懸濁液を10リットル
の発酵容器中９リットルの同培地に加え、ここで成長を続行させた。発酵器の公
式条件は：＞80％酸素飽和、25℃、pH7.2および300〜1000rpm。20〜91時間後、
容器を８〜12℃に冷却し、そして細胞を遠心により回収した。濃縮した細胞ペー
ストはドライアイス上で直ちに凍結し、そして使用するまで-70℃で保存した。
細胞の成長に炭素および窒素源として役立つE2基礎培地中の多くの他の補充物は
当業者に知られている。これらならびに複合栄養培地は、生物触媒を生産するた
めに使用することができる。上記の特定の培地を限定的であると見るべきではな
い。
【００３４】 ニトリラーゼ活性を有し、そして細胞懸濁液で保存するために、または後に懸
濁状で保存するために固定化された細胞の調製に使用するために、カルチャーブ
ロスから集められた細胞は、保存または固定化に使用する前に洗浄することなく
直接使用することができるか、または保存または固定化に先立ち保存バッファー
で洗浄することができる。細胞はカルチャーブロスから集め、そして細胞懸濁液
で、または固定化された細胞の懸濁液で保存する前に凍結することができる。
【００３５】 ニトリラーゼアッセイ： 固定化されていない細胞のニトリラーゼ活性は、245nmの吸収の増加により分
光光学的に測定するベンゾニトリルから安息香酸への転換により、あるいはHPLC
により測定される2-メチルグルタロニトリルから4-シアノペンタン酸アンモニウ
ム塩への転換によるいずれかで測定した。ベンゾニトリルに基づくニトリラーゼ
アッセイについては、５mgの凍結した湿潤細胞ペースト／mLを0.1M リン酸バッ
ファー(pH7.0)に懸濁した。ベンゾニトリルを１mMの最終濃度で加えた。懸濁液
は30℃で250rpmにて振盪し、そしてサンプルは0.5、１、２および４分に0.04Mリ
ン酸停止溶液の４×容量で集めた。15,800×gで５分間遠心した後、生成した上
清を分光光学的に分析した。実験的に決定したバッファーおよび停止溶液中のベ
ンゾニトリルおよび安息香酸の吸光係数に基づき、ニトリラーゼの単位活性を以
下の式により計算し、ここでｘはセンチメートルでの細胞路長（cell path leng
th）である（希釈に関する補正を含む）： ΔＣ（モル）＝ΔO.D.245／1.81モル-1cm-1(ｘ) 2-メチルグルタロニトリルに基づくアッセイについては、0.100M KH2PO4(pH7.
0)バッファー中の１mLの50mg乾燥細胞重量／mL細胞懸濁液（約200mgの凍結細胞
ペースト／mL）を、3.0mLの0.40M 2-メチルグルタロニトリル（脱イオン水中）
に25℃で加えた。反応混合物を25℃に撹拌しながら維持し、そして0.180mLのア
リコートを取り出し、そして５μlの6.0N HClおよび20μlの外部標準溶液（0.75
MのN-メチルプロピオンアミド）（脱イオン水中）と混合した。生成した混合物
を直ちに混合し、次いで12,000rpmで２分間遠心した。この上清をHPLCにより屈
折率検出器およびSupelcosil LC-18-DBカラム（25cm×4.6mm直径）を使用して、
10mM 酢酸ナトリウム、10mM 酢酸および7.5％メタノールを使用して分析した。
【００３６】 固定化された細胞のニトリラーゼ活性は、16.5gの固定化された細胞触媒を10.
8gの2-メチルグルタロニトリルおよび72.1mLの20mM リン酸カリウムバッファー
（pH7.5）と25℃で混合することにより測定した。アリコート（0.180mL）を取り
出し、そして５μLの6.0N HClおよび20μLの外部標準溶液（0.75M N-メチルプロ
ピオンアミド）と脱イオン水中で混合した。生成した溶液は直ちに混合し、次い
で12,000rpmで２分間遠心し、そして上清を上記のようにHPLCにより4-シアノペ
ンタン酸アンモニウム塩について分析した。
【００３７】 固定化： ニトリラーゼを含有する細胞は、当業者に既知の任意の方法および手順を使用
して固定化することができる。これらの方法は限定するわけではないが、アルギ
ン酸塩、カラギーナン、ポリビニルアルコールまたはポリアクリルアミドゲル中
での固定化、ならびにイオン交換樹脂、珪藻土（セライト）、活性炭、シリカ、
多孔性ガラスビーズ、アルミナ、ジルコニア、チタニア等への吸着または付着に
よる固定化を含む。
【００３８】 安定化化合物： ニトリラーゼ活性を安定化し、そして固定化されていない、または固定化され
た細胞の完全性を保存（微生物混入または溶解の防止）するために本発明で使用
する化合物（１つまたは複数）は、炭酸塩もしくは重炭酸塩の無機塩から成る群
から選択される。無機塩の種類は限定するわけではないが、ナトリウム塩、カリ
ウム塩およびアンモニウム塩を含む。この群から選択された１つの化合物をニト
リラーゼ安定化剤として使用することができ、あるいはこの群から選択された２
以上の化合物を保存溶液中に一緒に含んでもよい。炭酸塩または重炭酸塩を含む
溶液は、さらに適当なpHに調整して、二酸化炭素を含有するバッファー溶液を散
布することにより所望の塩をその場で調製することができる。カラギーナンに固
定化された細胞の場合は、アンモニウムまたはカリウム塩のカチオンがカラギー
ナンゲルの架橋の程度を有利に上昇させるので、これらの塩が好ましい。アルギ
ン酸塩に固定化された細胞の場合、カルシウムイオンがアルギン酸塩ゲルの架橋
の程度を有利に上昇させるので、任意にさらに５mMまでのカルシウムイオン（例
えば酢酸カルシウムの状態で）を炭酸塩または重炭酸塩に加えることが好ましい
。カルシウムイオンの添加は好ましくは約２mMから約５mMまでの範囲である。固
定化されていない、または固定化された細胞のニトリラーゼ活性を安定化するこ
とに加えて、重炭酸塩または炭酸塩の使用はさらに固定化されていない、または
固定化された細胞の懸濁液の微生物混入または腐敗を防止する。
【００３９】 固定化されていない微生物細胞（米国特許第4,288,522号および同第4,355,105
号明細書）、および固定化された微生物細胞（Takata et al.,Bioprocess Techn ol. 16:53-65(1993)；Tosa et al.,Biotechnol.Bioeng.21:1697-1709(1979)；Bah
uleker et al.,Enzyme Microb.Technol.13:858-868(1991)；Chao et al.,Biotec hnol.Bioeng. 28:1289-1293(1986)）の化学的架橋のためのグルタルアルデヒドお
よびポリエチレンイミンの使用は、高濃度のカルボン酸塩の生産を含め多くの応
用における反応条件下でこのような触媒の酵素活性を有意に安定させることがす
でに報告された。固定化されていない細胞または固定化された細胞の化学的架橋
、および続いて炭酸塩または重炭酸塩を含まない水性バッファー中での保存は、
時の経過に伴うニトリラーゼ活性の損失を防止しないことがわかった。炭酸塩ま
たは重炭酸塩（１つまたは複数）も、グルタルアルデヒドおよびポリエチレンイ
ミンで化学的に架橋した固定化されていない、または固定化された細胞のニトリ
ラーゼ活性を安定化し、そして完全性を保存する（微生物の混入または溶解を防
ぐ）ために使用することができる。
【００４０】 水性保存溶液中の無機炭酸塩または重炭酸塩（１つまたは複数）の濃度は、約
0.10Ｍから該無機塩の飽和濃度の範囲であることができる。各塩の飽和濃度は温
度および濃度で変動し、そして固定化触媒の安定化には好ましくは0.25M〜1.0M
の範囲である。固定化されていない細胞の場合は、重炭酸塩の濃度が0.50M以上
で細胞懸濁液は不均一になるがニトリラーゼ活性の損失は観察されず；したがっ
て固定化されていない細胞の安定化のための無機塩の好ましい濃度範囲は、0.10
M〜0.50Mである。
【００４１】 懸濁液のpHは好ましくは５〜10であり、より好適なpH範囲は6.5〜8.0である。
水性の保存懸濁液のpHは、酢酸、塩酸、硫酸またはリン酸のような適当な酸、あ
るいは水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような適
当な塩基を用いて調整することができる。
【００４２】 固定化されていないまたは固定化された細胞が重炭酸塩または炭酸塩の１以上
の無機塩を含む水溶液中で安定に保存される温度は、約０℃（または保存溶液の
凍結点よりわずかに上）から45℃の範囲であり、５℃から30℃が好適範囲であり
得る。
【００４３】 本発明を以下の実施例でさらに記載する。本発明の好適な態様を示しているこ
れらの実施例は、具体的な説明のためにのみ与えられると理解するべきである。
上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認する
ことができ、それらの精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用
途および条件に適応させるために本発明に様々な変更および修飾を行うことがで
きる。
【００４４】
【実施例】 実施例 細菌のカルチャーを維持そして成長させるために適当な材料および方法は、当
該技術分野では周知である。以下の実施例における使用に適する技法は、一般的
な細菌学に関する方法のマニュアル（Manual of Methods for General Bacterio logy ）(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N,Costilow,Eugene W.Nester,W
illis A.Wood,Nobel R.Krieg and G.Briggs Phillips、編集)、アメリカ微生物
学学会（American Society for Microbilogy）、ワシントン、DC.(1994)）また
はThomas D.Brock のバイオテクノロジー:工業用微生物学のテキストブック(Bio technology:A Textbook of Industrial Microbiology )、第２版で、シュナウア
ーアソシエイツ社（Sinauer Associates Inc.)、サンダーランド、マサチューセ
ッツ州、(1989)の説明に見いだすことができる。細菌細胞の成長および維持に使
用するすべての試薬および材料は、他に特定しない限りアルドリッチケミカルズ
（Aldrich Chemicals）(ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、ディフコ（DIFC
O）ラボラトリーズ（デトロイト、ミシガン州）、ギブコ／ビーアールエル（GIB
CO/BRL)（ゲチスバーグ、メリーランド州）、またはシグマ化学社（Sigma Chemi
cal Company)（セントルイス、モンタナ州）から得た。
【００４５】 略号の意味は以下の通りである：“sec"は秒（単数または複数）を意味し、“
min“は分（単数または複数）を意味し、“h"は時間（単数または複数）を意味
し、“ｄ”は日（単数または複数）を意味し、“μL”はマイクロリットル（単
数または複数）を意味し、“mL"はミリリットル（単数または複数）を意味し、"
Ｌ“はリットル（単数または複数）を意味し、“mM"はミリモルの、を意味し、
“Ｍ"はモルの、を意味し、“mmol"はミリモル（単数または複数）を意味する。
【００４６】 実施例１ 固定化されていないアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）細胞の ニトリラーゼ活性の保存安定性 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wは、遠心によりカル
チャーブロスから単離し、そして次いで１〜５乾燥細胞重量％濃度で水性リン酸
カリウム（0.10Mまたは1.00M)、酢酸ナトリウム（0.10Mまたは1.00M)、または重
炭酸ナトリウム（0.10Mまたは0.30M)、pH7.3に懸濁し、そして生成した懸濁液を
５℃でキャップ付きのガラス瓶に保存した。サンプルは継時的に細胞懸濁液から
取り出し、そしてサンプルのニトリラーゼ活性をアッセイした。表１は100％と
定めた０日のニトリラーゼ活性に対して、保存した細胞懸濁液の相対的ニトリラ
ーゼ活性を示す。0.10Mまたは0.30Mの重炭酸ナトリウムに92日間保存した細胞は
、0.10Mまたは1.0Mの酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムに保存したものと
比べた時、有意に高い割合の初期ニトリラーゼ活性を保持した。
【００４７】
【表３】
【００４８】 実施例２ アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wの カラギーナン粒子中への固定化 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W湿潤細胞ペースト（4
5グラム）を45mLの0.88％NaClと混合し、そして生成した懸濁液を50℃で１時間
加熱して望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を不活性化した。50℃の細胞懸
濁液を次いで135.0gの５重量％のPronova ISAGEL RG300カラギーナン溶液に55℃
で撹拌しながら加えた。生成した懸濁液は次いで氷／水浴で１時間、５℃に冷却
することにより直ちにゲル化した。生成したゲルは直径約２mmの粒子に切断し、
そして固定化した細胞粒子は450mLの0.30M KCl、20mM KH2PO4（KOHでpH7.0に調
整した）中で５℃にて18時間硬化した。硬化した溶液は、固定化した細胞粒子を
５℃で５mM KCl、20mM KH2PO4(pH7.0)で３回洗浄することにより取り出した。
【００４９】 実施例３ アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wの ポリアクリルアミドゲル粒子中への固定化 13.8gのアクリルアミドおよび12.0gのメチレンビスアクリルアミドの溶液（15
.0mLの水中）を25℃で、撹拌しながら30.0g（湿潤細胞重量）のアシドボラック
ス ファシリス(Acidovorax facilis）72W懸濁液（82mLの0.10M KH2PO4(pH7.0)）
、10℃に撹拌しながら加えた。生成した混合物に、テトラメチルエチレンジアミ
ン（0.45mL）および7.5mLの５（重量／容量）％過硫酸カリウムを25℃で加えた
。生成したポリアクリルアミドゲルを、10℃で氷浴中にて１時間保存し、次いで
粒子を直径約２mmの粒子に切断した。固定化した細胞粒子は５℃にて50mMのKH2P
O4(pH7.0)で２回洗浄した。
【００５０】 実施例４ 固定化したアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）の ニトリラーゼ活性の保存安定性 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞（５乾燥細胞重
量％）を、上記実施例２のようにPronova ISAGEL RG300カラギーナンに固定化し
、そして生成した触媒粒子を水性の1.0M リン酸カリウム、酢酸アンモニウム、
プロピオン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウムまたは硫酸アンモニウム、ある
いは1.0Mの塩化アンモニウムを含有する50mM リン酸カリウム、pH7.3に懸濁した
。生成した固定化触媒懸濁液を、５℃でキャップ付きのガラス瓶に保存し、そし
てサンプルは継時的に取り出し、そして固定化したアシドボラックス ファシリ
ス(Acidovorax facilis）72W細胞をニトリラーゼ活性についてアッセイした。
【００５１】 表２は、100％と定めた０日の活性に対して、保存した固定化細胞懸濁液の相
対的ニトリラーゼ活性を示す。1.0M重炭酸アンモニウムに保存した固定化細胞は
、1.0Mのリン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、プロピオン酸アンモニウム、あ
るいは1.0Mの塩化アンモニウムを含有する50mM リン酸カリウム、pH7.3で５℃に
て保存したものと比べた時、有意に高い割合の初期ニトリラーゼ活性を保持した
。
【００５２】
【表４】
【００５３】 実施例５ 固定化したアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）の ニトリラーゼ活性の保存安定性 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞（５乾燥細胞重
量％）を、上記実施例２のようにPronova ISAGEL RG300カラギーナン（3.0重量
％）に固定化し、そして生成した触媒粒子を水性の1.0M 重炭酸アンモニウム、p
H7.3に懸濁した。生成した固定化触媒懸濁液を、25℃でキャップ付きのガラス瓶
に保存し、そしてサンプルは継時的に取り出し、そして固定化したアシドボラッ
クス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞をニトリラーゼ活性についてア
ッセイした。
【００５４】 表３は、100％と定めた０日の活性に対して、保存した固定化細胞懸濁液の相
対的ニトリラーゼ活性を示す。
【００５５】
【表５】
【００５６】 実施例６ 固定化したアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）懸濁液 への微生物混入 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞（５乾燥細胞重
量％）を、上記実施例２のようにPronova ISAGEL RG300カラギーナン（3.0重量
％）に、または実施例３のようにポリアクリルアミドゲル（PAG、10重量％）に
固定化し、そして生成した触媒粒子を：ａ）50mM リン酸カリウム（pH7.0）；ｂ
）1.0M 酢酸アンモニウム（pH7.3)；ｃ）1.0M 重炭酸アンモニウム（pH7.3)；ま
たはｄ）50mM リン酸カリウム／1.0M 塩化アンモニウム（pH7.0）を含む水溶液
に懸濁した。生成した固定化触媒懸濁液を、５℃でキャップ付きのガラス瓶に保
存し、そして保存溶液のサンプルを継時的に取り出した。サンプルは600nmでの
光学密度（OD）における変化を測定することにより微生物混入について調査した
。
【００５７】 表４は、1.0M 重炭酸アンモニウム中に保存した固定化細胞が、1.0M リン酸カ
リウム、酢酸アンモニウム、プロピオン酸アンモニウム、または1.0M 塩化アン
モニウムを含有する50mM リン酸カリウム中にて５℃で保存した場合と比べた時
、初期ニトリラーゼ活性の有意に高い割合を保持したことを示す。継時的に測定
した保存バッファーの光学密度（OD）の上昇により示される微生物の混入は、50
mM リン酸カリウム中に保存した時にPAGまたはRG300カラギーナンのいずれかに
固定化した細胞で起こったが、1.0M 酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウムま
たは1.0M 塩化アンモニウム／50mM リン酸カリウム中に保存した細胞では有意な
微生物混入または腐敗は観察されなかった。微生物混入または腐敗が示されなか
った３つの保存懸濁液の中で、1.0M 重炭酸アンモニウム中に保存した固定化細
胞のみがニトリラーゼ活性の有意な損失を示さなかった（実施例４、表２を参照
にされたい）。
【００５８】
【表６】
【００５９】 実施例７ グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン−架橋を用いたカラギーナンビーズ へのアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wの固定化 磁気撹拌棒を備え、そして64gの水を含む250mLの培地ボトルに、50℃で3.38g
のカラギーナンを迅速に撹拌しながらゆっくりと加えた。混合物はカラギーナン
が完全に溶解するまで迅速に撹拌しながら75〜80℃に加熱し、そして生成した溶
液はサーモスタット付きの水浴で55〜65℃（ゲル化温度約52℃）に冷却した。23
.4gのエイ ファシリス(A facilis）72W細胞(湿潤細胞重量)懸濁液（21.56gの0.3
0M 重炭酸ナトリウムバッファー、pH7.3中）を、50℃に１時間加熱してニトリル
ヒドラターゼを不活性化した。50℃で細胞懸濁液を撹拌しながら55〜56Ｃのカラ
ギーナン溶液に加え、次いで細胞／カラギーナン混合物を直ちに、450mLのダイ
ズ油に50℃で頭頂撹拌機を使用して撹拌しながらゆっくりと加えた。所望のサイ
ズの細胞／カラギーナン液滴が、撹拌速度を制御することにより油中で生成した
後、油の温度を35℃に下げて液滴をゲル化し、そして生成したビーズから油をデ
カントした。ビーズを0.3M 塩化カリウム（50mMのリン酸カリウム、pH7.0中）で
洗浄し、次いで250mLのこの同じバッファーに再懸濁し、そして2.0gの25重量％
のグルタルアルデヒド（水中）を加え、そしてビーズを25℃で0.5時間混合した
。次いで混合物に9.0gの11重量％のポリエチレンイミン（BASF Lupasol PR971L
、平均 MW 約750,000）（水中）を加え、そしてビーズをさらに25℃で１時間混
合した。次いでビーズを0.3M 塩化カリウム（50mM リン酸カリウム、pH7.0中）
で洗浄し、そして同じバッファーで少なくとも18時間、５℃で保存して、さらに
ビーズを硬化した。
【００６０】 実施例８ グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミンで架橋化された 固定化アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wの ニトリラーゼ活性の保存安定性 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞（５乾燥細胞重
量％）を、実施例７に記載したようにPronova ISAGEL RG300カラギーナン（3.0
重量％）に固定化し、そして生成した触媒ビーズを水性の1.0M 重炭酸アンモニ
ウム、pH7.3に懸濁した。生成した固定化触媒懸濁液を、５℃でキャップ付きの
ガラス瓶に保存し、そしてサンプルを継時的に取り出し、そして固定化したアシ
ドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞をニトリラーゼ活性に
ついてアッセイした。
【００６１】 表５は、100％と定めた０日の活性に対して、保存した固定化細胞懸濁液の相
対的ニトリラーゼ活性を示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】 実施例９ グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミンで架橋化された 固定化アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wの ニトリラーゼ活性の保存安定性 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72W細胞（５乾燥細胞重
量％）を、実施例７に記載したようにPronova ISAGEL RG300カラギーナン（3.0
重量％）に固定化し、そして生成した触媒ビーズを水性の0.3M 重炭酸アンモニ
ウムまたは重炭酸カリウム、pH7.3のいずれかに懸濁した。生成した固定化触媒
懸濁液を、５℃でキャップ付きのガラス瓶に144日間保存し、次いで触媒ビーズ
のサンプルをニトリラーゼ活性についてアッセイした。0.3M 重炭酸アンモニウ
ムおよび0.3M 重炭酸カリウムに保存した触媒ビーズは、それぞれそれらの初期
活性の93％および97％を有した。
【００６４】 実施例１０ グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミン−架橋を用いたカラギーナンビーズ への大腸菌(E.coli）SS1001の固定化 磁気撹拌棒を備え、そして64gの水を含む250mLの培地ボトル、50℃に、3.38g
のカラギーナンを迅速に撹拌しながらゆっくりと加えた。混合物はカラギーナン
が完全に溶解するまで迅速に撹拌しながら75〜80℃に加熱し、そして生成した溶
液はサーモスタット付きの水浴で55〜65℃（ゲル化温度約52℃）に冷却した。24
.5gの大腸菌(E.coli）SS1001細胞(湿潤細胞重量)懸濁液（20.5gの0.30M リン酸
ナトリウムバッファー、pH7.3中）を、50℃に12分間加熱し、次いで撹拌しなが
ら55〜56Ｃのカラギーナン溶液に加えた。細胞／カラギーナン混合物は直ちに、
450mLのダイズ油に50℃で頭頂撹拌機を使用して撹拌しながらゆっくりと加えた
。所望のサイズの細胞／カラギーナン液滴が撹拌速度を制御することにより油中
で生成した後、油の温度を35℃に下げて液滴をゲル化し、そして生成したビーズ
から油をデカントした。ビーズを0.1M 重炭酸カリウム（pH7.0中）で洗浄し、次
いでこのビーズの35gの部分を83mLのこの同じバッファーに再懸濁し、そして0.8
75gの25重量％のグルタルアルデヒド（水中）を加え、そしてビーズを25℃で0.5
時間混合した。次いで混合物に3.5gの12.5重量％のポリエチレンイミン（BASF L
upasol PR971L、平均 MW 約750,000）（水中）を加え、そしてビーズをさらに25
℃で１時間混合した。次いでビーズを0.3M 重炭酸アンモニウム（pH7.3）で洗浄
し、そして同じバッファー中にて５℃で保存した。
【００６５】 実施例１１ グルタルアルデヒド／ポリエチレンイミンで架橋化された 固定化大腸菌(E.coli）SS1001のニトリラーゼ活性の保存安定性 大腸菌(E.coli）SS1001細胞（５乾燥細胞重量％）を、実施例１０のようにPro
nova ISAGEL RG300カラギーナン（3.0重量％）に固定化し、そして生成した触媒
ビーズを0.3M 重炭酸アンモニウム中にて５℃でキャップ付きのガラス瓶に70日
間保存した。この保存期間の後、ニトリラーゼ活性についてアッセイし、触媒ビ
ーズのサンプルは初期ニトリラーゼ活性の90％を有した。
【００６６】
【表８】
【００６７】
【表９】
【００６８】
【表１０】
【００６９】
【表１１】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月２日（２００２．７．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 11/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 11/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フアロン，ロバート・デイ アメリカ合衆国メリーランド州21901エル クトン・ブラツクオークドライブ104 Ｆターム(参考） 4B033 NA12 NA26 NA39 NB36 NB48 NB54 NB66 NC06 ND02 ND08 ND20 NF02 NF04 NF05 NG02 NG09 NH09 4B050 CC02 CC03 CC07 DD02 GG03 GG08 GG10 HH04 KK02 KK11 LL05

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ニトリラーゼ活性を有する固定化された、または固定化され
    ていない微生物細胞を保存し、そしてそれらのニトリラーゼ活性を安定化する方
    法であって、 ニトリラーゼ活性を有する固定化された、または固定化されていない微生物細
    胞の水性懸濁液に、無機炭酸塩および無機重炭酸塩から成る群から選択される少
    なくとも１つの化合物を加えることを含んで成り、ここで生成した水性懸濁液中
    の無機塩の全濃度が約100mMから無機塩の飽和濃度の範囲である上記方法。
  2. 【請求項２】 ニトリラーゼ活性を有する微生物細胞が、アシドボラックス
    ファシリス(Acidovorax facilis）72W（ATCC 55746）、アシドボラックス ファ
    シリス(Acidovorax facilis）72-PF-15（ATCC 55747）、アシドボラックス ファ
    シリス(Acidovorax facilis）72-PF-17（ATCC 55745）、およびアシドボラック
    ス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wニトリラーゼ活性で形質転換した微生
    物細胞から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 アシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）72Wニ
    トリラーゼ活性で形質転換した微生物細胞が、大腸菌（E.coli）SS1001（ATCC P
    TA-1177）である、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 無機重炭酸塩（１つまたは複数）が、重炭酸アンモニウム、
    重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウムから成る群から選択される１以上である
    、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ニトリラーゼ活性を有する固定化された、または固定化され
    ていない微生物細胞の水性懸濁液のpHが約pH６から約pH10である、請求項１に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】 固定化された、または固定化されていない微生物細胞の水性
    懸濁液の温度が約０℃から約45℃の範囲である、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 微生物細胞がポリアクリルアミドゲル、アルギン酸塩および
    カラギーナンに固定化されている、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 微生物細胞が最初にカラギーナンまたはアルギン酸塩に固定
    化され、次いでグルタルアルデヒドおよびポリエチレンイミンで架橋結合される
    、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 無機重炭酸塩が重炭酸アンモニウムであり、そして生成した
    水性懸濁液中の重炭酸アンモニウムの全濃度が約100mMから約1000mMの範囲であ
    る、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 微生物細胞がカラギーナンに固定化され、無機重炭酸塩（
    １つまたは複数）が、重炭酸アンモニウムおよび重炭酸カリウムから成る群から
    選択され、そして生成した水性懸濁液中の無機重炭酸塩の全濃度が約100mMから
    約1000mMの範囲である、請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 微生物細胞が固定化されず、無機重炭酸塩が重炭酸ナトリ
    ウムであり、そして生成した水性懸濁液中の重炭酸ナトリウムの全濃度が約100m
    Mから約1000mMの範囲である、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 さらにカルシウム塩を水性懸濁液に約２mMから約５mMの範
    囲で加え、そしてここで微生物細胞がアルギン酸塩に固定化され、そして無機重
    炭酸塩が重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウムから成る
    群から選択される１以上である、請求項７に記載の方法。
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