JP2000516810A

JP2000516810A - アミノ酸の製造およびそれに使用される酵素

Info

Publication number: JP2000516810A
Application number: JP10508610A
Authority: JP
Inventors: イヴァンページ，マイケル; マークベアード，ティモシー
Original assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Current assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2000-12-19
Also published as: US20020012975A1; GB9615852D0; AU3701897A; US6268185B1; CA2262016A1; WO1998004733A1; EP0910661A1

Abstract

(57)【要約】 α−アミノアミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）を含む出発物質からα−アミノ酸を製造するための方法であり、該方法においては、エナンチオマー（Ａ）がエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換され、変換時間に非依存的に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９８％のエナンチオマー過剰率が与えられる。反応は、アミダーゼにより触媒される。アミダーゼは、特に、特定のロードコッカス（Rhodococcus）種により産生されたものである。

Description

【発明の詳細な説明】アミノ酸の製造およびそれに使用される酵素本発明は、α−アミノアミド、α−メチルアミドおよびα−アミノメチルアミドをそれらの対応する酸へとエナンチオ選択的に変換する新規な方法、ならびにこれらの方法において有用な新規な微生物および酵素に関する。 α−アミノアミドは、加水分解によりα−アミノ酸へと変換されうることが知られている。この加水分解はアミダーゼ酵素により触媒されうる。水和によりニトリルをまずアミドに変換することにより、α−アミノニトリルをα−アミノ酸へと変換することも知られている。このニトリル−アミド水和は、ニトリルヒドラターゼ酵素触媒を用いて行うことができる。これらのトランスフォーメーションは、適当な酵素を選択することにより、エナンチオ選択的に実施できることが知られている(即ち、生成したα−アミノ酸が一方のエナンチオマーを過剰に有する)。例えば、Appl．Microbiol．Biotechn ol．（1994）42:1-7（Bauer et al）には、α−アミノフェニルアセトニトリルのα−アミノフェニル酢酸への変換が開示されている。その変換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の株により触媒される。そのニトリルは、ほぼ化学量論的な量でそのアミドに変換される。それから、徐々にそのアミドがその酸へと加水分解される。Ｓエナンチオマーが優先的に形成される。そのアミドが４３％変換された後に、最も高いエナンチオマー過剰率（９７％）に達するようである。高いエナンチオマー過剰率を達成するには、この時点で反応を停止させる必要があるようである。即ち、この変換は、時間非依存性のエナンチオ選択性を与えない。このように、最も高いエナンチオマー過剰率を達成するためには、特定の時点で反応を停止させる必要があることは、アミドから酸へのエナンチオ選択的な加水分解においてよく知られている。一般的に、上記のアミドをそれらの対応する酸へと変換する既知の触媒は、一方のアミド・エナンチオマーをもう一方よりも迅速に加水分解し、最終的には好ましくない方のエナンチオマーを相当量変換する傾向がある。高い変換率およびエナンチオ選択性を与えるが、時間非依存性のエナンチオ選択性は示さないらしい、他の変換反応が開示されている。例えば、ＥＰ−Ａ−３３２，３７９は、様々なアミノ酸の製造を開示している。これらは、様々な微生物への曝露によりニトリルから製造される。有効な酵素触媒がニトリラーゼであるのか、またはニトリルヒドラターゼとアミダーゼの組み合わせであるのかは、記載されていない。反応を、８から１２のpH、またはアルデヒドの存在下で行うことが必要であることが記載されている。米国特許第４，０８０，２５９号は、様々なアミドを加水分解し、アミノ酸を生成するアミダーゼ酵素を開示している。反応混合物のpHを示すとすれば、それは約８から約１０までであるようである。米国特許第４，３６６，２５０号およびＦＲ−Ａ−２，６２６，２８７号は、様々な天然アミノ酸の酵素による加水分解を開示している。米国特許第３，９７１，７００号は、フェニルグリシンを得るためのフェニルグリシンアミドの選択的な加水分解を開示している。これらの参照の中で、記載された反応が時間非依存性のエナンチオ選択性を与えると主張しているものは一つもない。米国特許第５２４８６０８号は、様々なα−置換カルボン酸アミドのエナンチオ選択的な加水分解を開示している。その加水分解は、オクロバクトラム・アントロピ（Ochrobactrum anthropi）またはクレブジエラ種（Klebsiella sp.）により産生されたアミダーゼ酵素を用いて行われる。この引用文献は、極めて高い変換率およびエナンチオマー過剰率が得られることを主張している。過去の文献に記載されたエナンチオ選択的な変換に関する一般的な理論が、米国特許第５２４８６０８号に開示された方法に当てはまることが説明されている。その参照文献では、高いエナンチオマー過剰率を得るためには、特定の時点で反応を停止させることが必要であるとされている。すなわち、その反応は、時間非依存的なエナンチオ選択性を与えない。この文献には、様々な例が開示されている。いくつかはα−アミノアミドの加水分解の例であるが、大部分は他のα−置換アミドの例である。一つだけ、時間非依存的なエナンチオ選択性を示す例が存在する。この唯一の例は、Ｎ−ヒドロキシ置換α−アミノアミドの加水分解を示している。いくつかの例が、α−アミノアミドの加水分解を示しているが、これらはいずれも時間非依存的なエナンチオ選択性を示さない。さらに、これらの例に示された反応の最大時間は８時間である。反応は全て回分反応として行われる。米国特許第５２１５８９７号も、主にＬ−アミノ酸を製造する、アミノ酸アミドのエナンチオ選択的な加水分解を開示している。ここでも、開示されている反応は、最大３時間にわたり行われる回分反応のみである。ほとんどの反応において収率は出発物質に対して５０％未満であり、反応が時間非依存的なエナンチオ選択性を与えるか、またはその可能性があることは全く示されていない。高いエナンチオマー過剰率を有するα−アミノアミドを製造できることが望ましい。これは、エナンチオマーに関して純粋な非天然のα−アミノ酸の製造にとって特に望ましい。また、そのようなエナンチオマーの純度を、関連するアミド・エナンチオマーの高い変換率と共に達成することが望ましい。また、工業的な規模に便利に適用できる製造法が提供されるように、これを実施できることが望ましい。本発明の第一の面に従い、本発明者らは、アミダーゼ酵素により触媒される変換反応を行うことを含む、α−アミノアミドをα−アミノ酸へと変換する方法を提供する。該方法において、α−アミノアミド出発物質には、アミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）が含まれ、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）はエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される。該方法は、変換時間に非依存的に少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率を与えるように、アミダーゼ酵素がエナンチオマー（Ａ）を変換できることを特徴とする。本明細書において、エナンチオマー過剰率が変換時間に非依存的に与えられると述べる場合には、反応を優先的に行うエナンチオマー（Ａ）が充分に存在する間中、即ち、エナンチオマー（Ａ）の大部分が変換されるまで、高いエナンチオマー過剰率が保持されることを意味する。例えば、これは、エナンチオマー（Ａ）の９０％変換されるまでであるかもしれない。一般的に、時間非依存的なエナンチオマー過剰率は、エナンチオマー（Ａ）が９５％、多くの場合には１００％変換されるまで維持される。エナンチオマー（Ａ）が１００％変換された後も、時間非依存的なエナンチオマー過剰率が維持される場合もあるが、これは重要ではない。エナンチオマー過剰率は、酸生成物のエナンチオマー過剰率である。したがって、本発明において、本発明者らは、一方のエナンチオマーの高い選択性を達成する。既知の方法のほとんどにおいて、生成物のエナンチオマー過剰率は、変換反応が進行するにつれ変化し、最も高いエナンチオマー過剰率を得るためには適当な時点で反応を停止させる必要があることが多い。しかし、本発明においては、反応中の全ての時点において、即ち、反応時間に非依存的に、高いエナンチオマー過剰率が達成される。これは、出発物質の一方のエナンチオマーに対するアミダーゼの極めて高い選択性のためであると考えられる。既知の反応においては、通常、アミダーゼが一方のエナンチオマーをもう一方よりも迅速に変換することが観察されるため、反応が進行するにつれ、エナンチオマー過剰率は減少する傾向がある。本方法は、反応の間中、少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率が維持される程度に、選択的である。本発明の方法の変換反応における出発物質は、α−アミノアミドである。加水分解されたとき、所望のα−アミノ酸を与えるようなアミドが選択される。出発物質として使用される適当なα−アミノアミドは、以下のような式Ｉを有する。この好ましい式において、Ｒは、適宜、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アルカリール(alkaryl)、アラルキル、Ｒ¹ＮＨＣＯＲ¹、Ｒ¹ＣＯＮＨＲ¹、ＳＯ₂Ｒ¹もしくはＳＯ₂ＮＨＲ¹(ここで、Ｒ¹は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アルカリールまたはアラルキルである)またはこれらのいずれかの置換体である。特に、ＲはＣ₄〜Ｃ₉、例えばＣ₄〜Ｃ₇、直鎖状もしくは分岐状のアルキルもしくはアルケニル、環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、または置換されたフェニル（ここで、置換基は、パラ−ＣＨ₃、メタ−ＣＨ₃、オルト−ＣＨ₃、パラ −ＣＦ₃、パラ−Ｅｔ、パラ−(ＣＨ₃)₃Ｃ、パラ−Ｃｌ、パラ−ＣＨ₃(ＣＨ₂)₃Ｏおよびパラ−ＯＨから選択される）である。メタ位およびオルト位の、これらの置換基、およびその他を使用することもできる。式Ｉに従い、Ｒがアルキルまたはアルケニルである場合には、ＲがＣ₄からＣ₉ 、例えばＣ₄からＣ₇、直鎖状のアルキルまたはアルケニル、または特に環状のアルキルであることが特に好ましい。Ｒがフェニルである場合には、Ｒが置換されたフェニルであり、特に置換基がパラ−ＣＨ₃、メタ−ＣＨ₃、パラ−ＣＦ₃、オルト−ＣＨ₃、パラ−Ｅｔ、パラ−(ＣＨ₃)₃Ｃ、パラ−Ｃｌおよびパラ−ＣＨ₃( ＣＨ₂)₃Ｏから選択されることが好ましい。したがって、変換反応は、以下のような式IIのα−アミノ酸を生成する。本発明の方法は、非天然のアミノ酸の製造に特に適している。アミド出発物質には、エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）が含まれる。エナンチオマー（Ａ）は、変換反応において、対応する酸へと優先的に変換されることが望まれているものである。エナンチオマーＡは、通常、変換されたときにＬアミノ酸を与えるＬアミノ酸アミドである。エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）は、実質的に等モル量で存在してもよい。すなわち、出発物質は好ましくはラセミ混合物である。しかし、本発明の方法は、ゼロより大きいエナンチオマー過剰率を有する出発物質にも適用可能である。本方法は、エナンチオマー（Ａ）が過剰である出発物質にもエナンチオマー（Ｂ）が過剰である出発物質にも適用することができる。本方法は、対応する酸へと優先的に変換されることが望まれていない、エナンチオマー（Ｂ）が過剰に存在する系において、特に有用である。この型の反応において、エナンチオマー（Ａ）に対するエナンチオマー（Ｂ）の比率は、反応中、対応する酸への変換によりエナンチオマー（Ａ）の量が減少するにつれ、着実に増大する。他の型の反応において、エナンチオマー（Ｂ）に対するエナンチオマー（Ａ）の比率が反応の過程で上方にも下方にも変動するように、エナンチオマー（Ａ）を定期的または連続的に補充することもできる。好ましくは、反応時間の少なくとも一部、好ましくは少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも１または２時間、エナンチオマー（Ｂ）の量は、エナンチオマー（Ａ）の量の少なくとも１２５％または１５０％、好ましくは少なくとも２００％、より好ましくは少なくとも２５０％である。アミド出発物質は、任意の適当な方法で作製されうる。アミドは、特にニトリル出発物質から、酵素触媒反応により作製されることが好ましい。したがって、本発明の好ましい方法において、第一工程には、ニトリル・ヒドラターゼ酵素により触媒される、α−アミノニトリルのその対応するα−アミノアミドへの変換が含まれる。ニトリル・ヒドラターゼ酵素は、一方のニトリル・エナンチオマーを他方よりも優先的に変換するものであってもよい。しかし、一般的に、ニトリル・ヒドラターゼは非選択的に作用し、両方のニトリル・エナンチオマーを実質的に同じ速度で変換する。本発明の方法において使用されるアミダーゼ酵素は、変換時間に非依存的に少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率を与えるよう、エナンチオマー（Ａ）を優先的に変換できるアミダーゼ酵素である。好ましくは、時間非依存的なエナンチオマー過剰率は、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％であり、特に少なくとも９８％である。変換反応は、好ましくは、エナンチオマー（Ａ）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは少なくとも９５または９８％、実質的に１００％が、その対応する酸へと変換される程度に行われる。本発明の方法の変換反応において、アミダーゼはエナンチオマー（Ｂ）を極少量のみ変換するよう選択される。好ましくは、変換反応の終了時に、エナンチオマー（Ｂ）の１０％以下、より好ましくは５％または２％以下が、その対応する酸へと変換されており、実質的に全く変換されていない場合も多い。特に、本発明の方法において、アミダーゼは、エナンチオマー（Ａ）の濃度が検出可能なレベルを下回る場合ですら、エナンチオマー（Ｂ）の１０％未満、より好ましくは５％または２％未満を変換することが好ましく、実質的に全く変換しないことがより好ましい。アミド−酸変換反応の実施にとって適当な任意の条件を使用することができる。一般的には、アミダーゼ酵素の作用にとって至適な条件が選択される。本発明において使用される酵素は、特定の変換を行うことができる酵素である。至適なエナンチオマー過剰率を与えない条件下で変換反応を行うことが望ましいという場合もある。例えば、変換の経済性を至適化する場合には、高い温度で行うことが望ましい。いくつかの酵素は、温度が上昇するにつれ基質に対する選択性が減少する傾向がある。したがって、選択性と生産性とを比較検討することが必要である場合もある。しかし、本発明においては、アミダーゼ酵素が、少なくともいくつかの条件下で、特定の変換を行うことができるということが重要である。好ましくは、酵素は、１０から５０℃、多くの場合に約３０℃の温度において、高度に選択的な変換を行うことができる。本発明において使用される極めて選択的な酵素の利点は、標準的なアミダーゼ酵素よりも高い温度で作用することができ、したがって、標準的なアミダーゼ酵素よりも高い選択性を保持しつつ、生産性が高いという点である。変換反応中の温度は、通常１０から５０℃、好ましくは１５から３５℃、多くの場合２０または３０℃である。任意の適当なpHを変換反応に使用できる。しかし、好ましくは８未満、特に６から７．５、または８のpHが使用され、約７のpHが使用されることが多い。これは、アルデヒドが存在しない場合には、８から１２のpHを使用することが必須である、ＥＰ−Ａ−３３２，３７９の方法とは対照的である。本発明の方法によれば、アルデヒドの非存在下で８未満のpHで変換反応を行うことが可能である。出発物質は、任意の望ましい濃度で反応混合物中に含まれる。１mMから２M、例えば５mMから１M、多くの場合約１０から５０mM、特に２０mMまでの濃度が特に好ましい。アミダーゼ酵素は、任意の適当な形態で反応混合物に含まれる。アミダーゼ酵素は、一般的には、微生物により産生される。アミダーゼ酵素は、例えば、触媒として使用される前に培養微生物から抽出された、純粋な形態で使用されうる。使用される抽出の方法は、アミダーゼの活性および安定性を損なわないようなものでなければならない。半純粋な形態で、例えば、液体培養物として、または完全な細胞もしくは破壊された細胞のような細菌細胞画分として、使用することもできる。精製されていない、純度の低い酵素溶液の形態で使用することもできる。架橋ポリマー・マトリックス、例えば架橋ポリビニル・アルコールもしくは架橋ポリアクリルアミドのような担体上に支持、または固定化されていてもよい。表面結合酵素を有する非膨張粒子の形態で使用することもできる。好ましくは、遊離の、または架橋ポリマー・マトリックスに支持された、完全な細菌細胞の形態で使用される。変換反応の時間は、使用される試薬、選択された条件および反応の型により異なる。反応は回分反応であってもよい。回分反応においては、変換反応の開始時に全ての試薬を混合し、反応を行わせる。この場合、反応は、最大、例えば４時間、例えば１〜３時間、継続することが好都合である。別法として、流加反応または連続反応として反応を行ってもよい。時間非依存的なエナンチオマー過剰率が得られるために、この型の反応を実施できることが、反応の利点の一つである。これらは、工業的な規模での使用にとって特に好ましい。流加反応においては、反応の開始時に反応容器に反応物を加え、反応を行わせる。反応中、出発物質が最終生成物へと変換されるにつれ、出発物質の濃度は減少する。したがって、反応中、出発物質を追加する。通常は、出発物質の濃度の下限および上限の両方を設定し、最初に上限レベルの濃度で出発物質を供給し、そして低いレベルへと減少させる。次に、反応が進行し、生成物が充分に生成するまで、そのレベルが上限などに上昇するよう、出発物質を追加する。連続反応においては、反応容器から反応混合物が除去されるのと同じ速度で出発物質を供給することにより、試薬は一定の状態に維持される。このような系においては、除去される反応混合物に多くの精製過程を施す必要がないように、極めて低レベルの出発物質および極めて高レベルの反応生成物を含む反応混合物を提供できることが特に望ましい。本発明の方法では、これも可能である。流加法においても連続法においても、高濃度の出発物質の存在下で行うことができる点が、本発明の特別な利点である。好ましくは、反応中、生成物アミノ酸とエナンチオマーＡ出発物質との比率は、少なくとも５：４、好ましくは少なくとも３：２、より好ましくは少なくとも２：１または３：１になる。好ましくは、この比率は反応中少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも１または２時間、維持される。流加反応および連続反応は、商業的な規模において極めて望ましい、長時間の実施に特に適している。例えば、変換反応は、少なくとも８時間、好ましくは少なくとも９時間継続することができ、少なくとも１２〜１５時間、最大２４または４８時間、またはそれ以上継続することすら可能である。反応混合物中に存在する唯一の酵素触媒がアミダーゼであることが、本発明において得に望ましい(アミド出発物質を作製するために使用される場合には、ニトリル・ヒドラターゼが含まれていてもよい)。特に、変換反応混合物中にはラセマーゼが存在しないことが好ましい。ラセマーゼを、エナンチオ選択的であると言われているアミダーゼと共に使用しなければならない変換もいくつか知られている。しかし、これらは、優先的にラセミ混合物へと変換されないエナンチオマーを連続的に変換すると考えられるラセマーゼ酵素の存在下で行わなければならない。なぜなら、アミドから酸への変換は、時間非依存的ではなく、好ましくない未反応のエナンチオマーの濃度が増加するにつれ、それが対応するアミノ酸へと変換され始めるためであると本発明者らは考える。いかなる反応型を使用するにしても、反応の終了時には、エナンチオマーＡの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０または９５％、より好ましくは少なくとも９８％、多くの場合実質的に１００％が、その対応する酸へと変換されていることが好ましい。本発明の方法の終了時に達成されるエナンチオマー過剰率は、任意の標準的な方法により測定されうる。ニトリル−アミド変換反応が本発明の方法に含まれており、ニトリル・ヒドラターゼ酵素を用いて触媒される場合、アミド−酸変換反応のための反応条件が、概してニトリル−アミド変換反応にも適用されうるが、ただし、１〜１００mM、特に５〜５０または２０mMのニトリル濃度が好ましい。本発明の方法の終了時には、エナンチオマー（Ａ）からエナンチオマーに関して純粋なアミノ酸が生成している。変換されていないエナンチオマー（Ｂ）も、大量に反応混合物中に残存している。エナンチオマーに関して純粋な（Ｂ）アミドを使用することが必要な場合もあり、これも、変換反応の生成物である。変換されたエナンチオマー（Ａ）および変換されていないエナンチオマー（Ｂ）は、一般的に分離される。次に、エナンチオマー（Ａ）に由来するエナンチオマーに関して純粋なアミノ酸を、希望通りに使用することができる。変換されていないエナンチオマー（Ｂ）も、必要に応じて使用することができる。エナンチオマー（Ｂ）に由来するエナンチオマーに関して純粋なアミノ酸を得ることが望ましい場合には、変換されていないエナンチオマー（Ｂ）の化学的加水分解を既知の方法で行うことができる。エナンチオマー（Ｂ）が必要でない場合には、それをラセミ化し、得られたエナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）のラセミ混合物を、本発明の方法のためのアミド出発物質のさらなるバッチに加えることが特に有効である。ラセミ化は化学的に行ってもよい。別法として、ラセマーゼ酵素を用いて行ってもよい。エナンチオマー（Ｂ）をラセミ化し、得られたエナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）のラセミ混合物をさらに反応させれば、最初の出発物質の最大１００％の変換が達成されうる。本発明の第一の面の方法において、アミダーゼ酵素は、好ましくは、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)（23 St Machar Drive，Aberd een，Scotland，UK，AB21RY)に、受託番号ＮＣＩＭＢ４０７９５で寄託されているロードコッカス（Rhodococcus）属の微生物により産生されたものである。この寄託は、１９９６年４月１９日に、ブダペスト条約の規定に基づきなされた。この微生物は、本発明の方法における使用に適したアミダーゼ酵素に加え、ニトリル・ヒドラターゼ酵素を産生するため、特に好ましい。これは、非エナンチオ選択的に作用する。したがって、この単独の微生物ロードコッカスＮＣＩＭＢ４０７９５を用いて、α−アミドニトリルを、α−アミノアミドを経由してα− アミノ酸へとエナンチオ選択的に変換することが可能である。この微生物は、それ自体、新規な微生物株である。したがって、本発明の第二の面に従い、本発明者らは、ロードコッカスＮＣＩＭＢ４０７９５またはアミダーゼを産生する能力を有するその変異株である微生物を提供する。この新規な微生物は、ニトリルおよびアミドのα−アミノ酸への変換に有用である。本発明の第三の面に従い、本発明者らはまた、アミダーゼ酵素により触媒される変換反応を行うことを含む、α−アミノアミドをα−アミノ酸へと変換する方法を提供する。該方法において、α−アミノアミド出発物質は、アミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）を含み、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）はエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される。該方法は、アミダーゼ酵素がロードコッカスＮＣＩＭＢ４０７９５により産生されたものであることを特徴とする。この方法は、好ましくは、本発明の第一の面の方法に関して上述した特徴の一部または全部を有している。本発明のロードコッカス株は、この属の典型的な株ではないと考えられる。それは、グラム陽性であり、胞子を形成せず、非運動性である。３０℃でよく増殖し、３７℃および４１℃では増殖能が低下し、４５℃では増殖しない。カタラーゼ活性を示すが、オキシダーゼ活性は示さず、グルコースＯＦ中では発酵力をもたない。細胞壁ジアミノ酸はメソ（meso）ＤＡＰである。ミコール酸は存在しない。脂肪酸プロフィールには、以下のものが含まれる。テトラデカン酸、ペンダデカン酸、ヘキサデセン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデセン酸、ヘプタデカン酸、オクタデセン酸。ただし、ツベルクロステアリン酸またはその他の１０メチル分岐酸はほとんど含まない(それぞれ１％未満)。本発明は、新規なエナンチオ選択的なアミダーゼ酵素も提供する。本発明の第四の面のアミダーゼ酵素は、ロードコッカスＮＣＩＭＢ４０７９５またはアミダーゼを産生する能力を有するその変異株を培養することに得られる。本発明者らは、第二の特定の微生物株が、本発明の方法の実施において特に有用であることも見出した。これは、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collection of Industrial and Marine Bacteria）に、ツカムレラ・ラッツラビエンシス（Tsukamurella wr atslaviensis）なる名称で受託番号ＮＣＩＭＢ１３０８２で寄託されているロードコッカス・ラッツラビエンシス（Rhodococcus wratslaviensis）種の株である。この微生物は、本発明の方法を実施できるアミダーゼを産生する。本発明はまた、α−メチルアミドおよびα−アミノメチルアミドがそれらの対応する酸へと変換される方法を提供する。したがって、本発明の第五の面に従い、本発明者らは、アミダーゼ酵素により触媒される変換反応を行うことを含む、 α−メチルアミドまたはα−アミノメチルアミドをα−メチル酸またはα−アミノメチル酸へと変換する方法を提供する。該方法において、α−メチルアミドまたはα−アミノメチルアミド出発物質は、アミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）を含み、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）はエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される。該方法は、アミダーゼ酵素が、変換時間に非依存的に少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率を与えるように、エナンチオマー（Ａ）を変換できることを特徴とする。本発明の第五の面のこの方法において、α−メチルアミドは、以下の式IIIを有することが適当である。式中、Ｒは、式ＩのＲに関して記載された基のいずれかでもよい。 α−アミノメチルアミドは、以下の式IVを有することが適当である。式中、Ｒは、式ＩのＲに関して示された意味のいずれかを有する。 α−メチルアミドおよびα−アミノメチルアミドの変換反応は、それぞれ以下の式ＶおよびＶＩのα−メチル酸およびα−アミノメチル酸を生成させる。本発明の第一の面の方法の特徴はいずれも、本発明の第五の方法に当てはまる。本発明者らは、α−メチルアミドおよびα−アミノメチルアミドは、特にロードコッカスＮＣＩＭＢ４０７９５由来のアミダーゼにより、α−アミノ酸よりも遅い速度で変換される傾向にあることを見出している。本発明のいずれの方法の生成物も、エナンチオマーに関して高度に純粋である。それらは、医薬および農薬、例えば抗生物質の調製における中間体として特に有用である。以下に、本発明のいくつかの実施例を示す。実施例１微生物の培養最初の単離物ロードコッカスＮＣＩＭＢ４０７９５を、５００mlの振とうフラスコを用いて軌道振とう（２００rpm）しながら、３０℃で培養した。培養培地は、以下に示すようにして調製した。特に断らない限り、全ての量が g/l単位である。リン酸水素二カリウム７．０リン酸二水素カリウム３．０酢酸ナトリウム５．０プロピオニトリル７１４μｌ硫酸マグネシウム^* １．０塩化カルシウム^* ０．２［^*別個にオートクレーブ処理した］ビタミン類（１ml／ｌで） g/l 塩酸チアミン０．１パントテン酸カルシウム０．１塩酸ピリドキシン０．１ビオチン０．０１イノシトール１０．０微量金属類（５ml/lで） g/l ＭｇＯ１０．７５ＣａＣＯ₃ ２．０ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ４．５ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１．４４ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ１．１２ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．２５ＣａＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２８Ｈ₃ＢＯ₃ ０．０６ＨＣｌ（６N）５１．３cm³ 対数増殖期の後期に、１０，０００rpmで２０分間遠心分離することにより細胞を収集した。細胞ペレットを、生理食塩水（２５０ml）で洗浄し、同条件下で再び遠心分離した。その後、変換反応における使用に必要となるまで、細胞ペレットを凍結させた。実施例２ α−アミノニトリルの変換フェニルグリシノニトリル（１６．８mg、０．１mmol）を、１０mMの濃度となるようにリン酸緩衝液（１０ml、pH７．０、５０mM）に溶解させた。その溶液を実施例１に記載されたようにして作製された完全な細胞と共に２０℃でインキュベートし(４．２g/L[乾燥細胞])、以下の概略に従い試料を採取した。５０μｌの試料を取り出し、４５０μｌの水で希釈した。細胞を微量遠心分離（１３，０００rpm、３０秒）により除去した。上清をデカンテーションにより取り出し、ＨＣｌ（１０μｌ、６N）を添加した。混合物をジクロロメタンで抽出し、ＨＰＬＣを妨害する、ニトリルの分解により形成されたアルデヒドを全て除去した。その後、水相をＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣは全て、ＵＶ検出器をもつ、ＬＤＣ／ミルトン・レイ・コンスタメトリック３（LDC/Milton Ray ConstaMetric 3）を用いて行った。カラムフェノメネックスＲＰセレクトＢ（Phenomenex RP select B）（２５cm×０．４６cm）流速１ml／分波長２５４nm 溶出９５％トリス／ＨＣｌ緩衝液(１０mM、pH３)：５％メタノール保持酸６．７分、アミド８．０分、ニトリル１３．６分１０％の変換後、試料（２００μｌ）を採取し、ジクロロメタンで抽出し、未反応のニトリルを全て除去した。ＨＰＬＣで全てのアミドが酸に変換されたことが示されるまで、これをＨＣｌ（６N）中で還流した。その後、以下の概略に従い、酸をキラルＨＰＬＣにかけた。カラムスミキラルＯＡ５０００（Sumichiral OA 5000）（１５cm×０．４６cm）流速１ml／分波長２５４nm 溶出９５％ＣｕＳＯ₄(３mM)：１０％メタノール保持エナンチオマー１：−１８分エナンチオマー２：−３０分生成したアミドはラセミであることが見出された。即ち、ニトリル・ヒドラターゼはエナンチオ選択的ではない。この場合、ニトリルの分解により生成するシアン化物により反応が阻害された。しかし、さらに細胞を追加することによりニトリルの１００％の変換を達成することが可能であった。実施例３ α−アミノアミドの変換４−クロロフェニルα−アミノアセトアミド(１１mg、０．０５mmol)を、１０ mMの濃度となるようにリン酸緩衝液（５ml、pH７．０、５０mM）に溶解させた。溶液を３０℃でインキュベートし、実施例１に記載されたようにして作製された完全な細胞を添加した(４．２ｇ（乾燥細胞）／ｌ)。以下の概略に従い様々な時間間隔で試料を採取した。時間＝０分における試料：１．５０μｌの試料を取り出し、４５０μｌの水で希釈した。細胞を微量遠心分離（１３，０００rpm、３０秒）により除去し、試料をＨＰＬＣにより分析した。カラムフェノメネックスＲＰセレクトＢ（Phenomenex RP select B）（２５cm×０．４６cm）流速１ml／分波長２５４nm 溶出８０％トリス／ＨＣｌ緩衝液(１０mM、pH３)：２０％メタノール保持酸６．７分、アミド８．０分２．２００μｌの試料を採取し、上記と同様にして遠心分離した。これを、以下の概略に従いキラルＨＰＬＣにかけた。カラムスミキラルＯＡ５０００（Sumichiral OA 5000）（１５cm×０．４６ｃｍ）流速１ml／分波長２５４nm 溶出７５％ＣｕＳＯ₄(３mM)：２５％メタノール保持エナンチオマー１：−２５分エナンチオマー２：−４０分その後、アミドの５０％が変換が達成されるのが観察されるまで、方法１により様々な時間で試料を分析した。この時、試料採取方法１および２を再び使用した。約１４０分間で、アミドの濃度が１０mMから約５．０mMへと減少するのが観察された。同じ時間で、４−クロロフェニルα−アミノ酢酸の濃度は０から約５．０mMにまで増加した。約１４５分後、速度が実質的にゼロとなり、反応が自然に終了するのが観察された。他の置換および非置換フェニルα−アミノアセトアミドならびに環状および非環状脂肪酸を用いて、同じ操作を行った。結果を以下の表１に示す。一般式Ｉ実施例４ α−フェニルα−アミノアセトアミド（７５mg、０．５mmol）を、１０mMの濃度となるようにリン酸緩衝液（５ml、pH７．０、５０mM）に溶解させた。溶液を３０℃でインキュベートし、実施例１に記載されたようにして作製された完全な細胞を添加した(４．２ｇ（乾燥細胞）／Ｌ)。以下の概略に従い様々な時間間隔で試料を採取した。時間＝０における試料１．４５μｌの試料を取り出し、４５０μｌの水で希釈した。細胞を微量遠心分離（１３，０００rpm、３０秒）により除去し、試料をＨＰＬＣにより分析した。カラム：フェノメネックスＲＰセレクトＢ（Phenomenex RP select B）（２５cm×０．４６ｃｍ）流速：１ml／分波長：２５４nm 溶出：９５％トリス／ＨＣｌ緩衝液(１０mM、pH３)：５％メタノール保持：酸４．７分、アミド５．８分２．２００μｌの試料を取り出し、上記のようにして遠心分離した。これを、以下の概略に従いキラルＨＰＬＣにかけた。カラム：スミキラルＯＡ５０００（Sumichiral OA 5000）（１５cm×０．４６ｃｍ）流速：１ml／分波長：２５４nm 溶出：９０％ＣｕＳＯ４(２mM)：１０％メタノール保持： α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマー−１８分 α−フェニルα−アミノ酢酸のＤエナンチオマー−３０分その後、アミドの５０％が変換が達成されるのが観察されるまで、方法１により様々な時間で試料を分析した。この時、試料採取方法１および２を再び使用した。約２４時間で、アミドの濃度が１０mMから約５．０mMへと減少するのが観察された。同じ時間で、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度は０から約５mMにまで増加した。４８時間後、アミドおよびα−フェニルα−アミノ酢酸の両方の濃度が依然として約５mMであった。したがって、約２４時間のインキュベーション時間で、反応が自然に終了することが明らかとなった。実施例５実施例１に記載されたようにして作製された完全な細胞を、５０mM、pH７．０のリン酸ナトリウム緩衝液３２mlに３５℃で添加した(４．２ｇ（乾燥細胞）／Ｌ)。α−フェニルα−アミノアセトアミド溶液（８ml、５０mM）を、１０mMの α−フェニルα−アミノアセトアミド濃度となるように細胞懸濁液に添加した。以下の概略に従い様々な時間間隔で試料を採取した。時間＝０における試料１．０．５mlの試料を取り出し、細胞を微量遠心分離（１３，０００rpm、３０秒）により除去した。上清を５倍に希釈し、実施例４に記載の条件を用いてＨＰＬＣにより分析した。２．２００μｌの試料を取り出し、上記と同様にして遠心分離した。上清を、実施例３の概略に従いキラルＨＰＬＣにかけた。その後、方法１により２０分間隔で試料を分析した。４時間後、アミドの３０％が変換が達成されるのが観察された。この時、試料採取方法１および２を使用した。約４時間後に、アミドの濃度が１０mMから約７mMへと減少し、α−フェニルα −アミノ酢酸の濃度が０から３mMにまで増加するのが観察された。上清を方法２により分析したところ、アミドが３０％変換された時点で、実質的に、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が達成されることが見出された。その後、さらに６mlの５０mMのα−フェニルα−アミノアセトアミドを細胞懸濁液に添加し、細胞懸濁液に３.５７ｇ(乾燥細胞)／Ｌの完全な細胞、２.５５mM のα−フェニルα−アミノ酢酸のエナンチオマー、および１３．４５mMのアミドが含まれるようにした。アミドの濃度が１３．４５mMから１０mMへと減少し、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が２．５５から６mMにまで増加するのが観察された。上清を方法２により分析したところ、実質的に、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が達成されていることが明らかとなった。実施例６実施例１に記載されたようにして作製された完全な細胞を、実施例５に記載の条件下で、１０mMのα−フェニルα−アミノアセトアミドと混合した。様々な時間間隔で試料を採取し、実施例５に記載のようにして分析した。９０分後に、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が０から３．２４mMにまで増加するのが観察された。この時点で、反応混合物中の濃度を１０mM増加させるため十分な量のα−フェニルα−アミノアセトアミドを添加した。さらに９０分後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が５．８６mMにまで増加しているのが観察された。この時点で、反応混合物中の濃度を１０mM増加させるため十分な量のα −フェニルα−アミノアセトアミドを添加した。方法１により分析したところ、さらに９０分後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が７．９８mMにまで増加しているのが観察された。その後、１３０００ｇで１０分間遠心分離することにより、細胞を反応混合物から分離した。上清を方法２により分析したところ、実質的に、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が達成されたことが明らかとなった。実施例７実施例６で作製された最終上清１７．２６ｇに、２０．７４ｇの水を添加し、Ｌ−α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度を３．７０mMに減少させた。この溶液に、実施例１に記載されたようにして作製された完全な細胞を０．６５ｇ添加した。４５分後に、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が３．７５mMにまで増加しているのが観察された。この時点で、反応混合物中の濃度を１２mM増加させるため十分な量のα−フェニルα−アミノアセトアミドを反応混合物に添加した。さらに１２０分後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が７．９８mMにまで増加しているのが観察された。上記と同様にして、さらにα−フェニルα−アミノアセトアミドを添加した後、２時間インキュベーションする操作を２回繰り返した。方法１により分析したところ、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が１４．８１mM にまで増加しているのが観察された。その後、実施例６に記載のようにして、細胞を反応混合物から分離し、方法２により分析した。実質的に、α−フェニルα −アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が達成されたことが明らかとなった。実施例８実施例１に記載のようにして作製された完全な細胞（０．５２ｇ）を、実施例７で作製された最終上清に添加した。３５℃で４０分間インキュベートした後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が１７．４６mMにまで増加しているのが観察された。３つの異なる状況で、濃度を１２mM増加させるため十分な量のα−フェニルα −アミノアセトアミドを反応混合物に添加した。各添加後、反応混合物を１２０分間インキュベートした。反応混合物を方法１により分析したところ、上記のような操作の完了後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が２６．６４mMにまで増加しているのが観察された。その後、実施例６に記載のようにして、細胞を反応混合物から分離し、方法２により分析した。実質的に、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が達成されたことが明らかとなった。実施例９実施例１に記載のようにして作製された完全な細胞（０．４８ｇ）を、実施例８で作製された最終上清に添加した。２つの異なる状況で、濃度を１０mM増加させるため十分な量のα−フェニルα −アミノアセトアミドを反応混合物に添加した。各添加後、反応混合物を３５℃ で１２０分間インキュベートした。反応混合物を方法１により分析したところ、上記のような操作の完了後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が３０．３８mM にまで増加しているのが観察された。その後、実施例６に記載のようにして、細胞を反応混合物から分離し、方法２により分析した。実質的に、α−フェニルα −アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が達成されたことが明らかとなった。実施例１０実施例１に記載のようにして作製された完全な細胞(１.０７ｇ)を、３６.９ml のα−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマー（アルドリッチ（Aldrich）から購入）に懸濁させた。 α−フェニルα−アミノアセトアミド濃度が５０mMとなるように充分な量の α−フェニルα−アミノアセトアミドを添加し、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーを４０mMに希釈した。その後、反応混合物を３０℃で３００分間インキュベートした。３００分後、アミドの約３０％の変換が達成されているのが観察された。この時、試料採取方法１および２を使用した。３００分後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が４０mMから５２．６mMにまで増加しているのが観察された。上清を方法２により分析したところ、アミドが約３０％変換された時点で、実質的に、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が観察されることが明らかとなった。さらに３５℃で９６０分間インキュベートした後、アミドの約４０％の変換が達成されているのが観察された。この時、試料採取方法１および２を使用した。９６０分後、α−フェニルα−アミノ酢酸の濃度が５８．３mMにまで増加しているのが観察された。上清を方法２により分析したところ、アミドが約４０％変換された時点で、実質的に、α−フェニルα−アミノ酢酸のＬエナンチオマーの＞９８％のエナンチオマー過剰率が観察されることが明らかとなった。これらの結果は、本発明を使用して達成されうる優れたエナンチオマー過剰率を示している。特に、出発物質の５０％の変換、即ちエナンチオマー（Ａ）の１００％の変換が達成される。この結果は、広範囲のα−アミノアミドでも達成される。このような結果は、変換されていないエナンチオマーＢ（この場合、Ｄエナンチオマー）が大過剰に存在し、生成物である酸が高濃度に存在する場合にも達成されうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ベアード，ティモシーマークイギリス国デヴォンティーキュー４６エイチアールペイントンブロードサンズロアーフォウデン 19

Claims

【特許請求の範囲】１．アミダーゼ酵素により触媒される変換反応を行うことを含む、α−アミノアミドをα−アミノ酸へと変換する方法であって、α−アミノアミド出発物質にアミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）が含まれ、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）がエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される方法において、アミダーゼ酵素が、ロードコッカス（Rhodococcus）ＮＣＩＭＢ４０７９５またはロードコッカス・ラッツラビエンシス（Rhodococcus wratslaviensis）ＮＣＩＭＢ１３０８２により産生されたものであることを特徴とする方法。２.アミダーゼ酵素が、変換時間に非依存的に少なくとも９８％のエナンチオマー過剰率を与えるように、エナンチオマー（Ａ）を変換できる、請求項１に記載の方法。３．α−アミノアミド出発物質が、エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）のラセミ混合物である、請求項１または２に記載の方法。４.変換反応中少なくとも３０分間、エナンチオマー（Ｂ）がエナンチオマー（Ａ）よりも過剰に存在する、請求項１または２に記載の方法。５．変換反応中少なくとも３０分間、エナンチオマー（Ｂ）の量が、エナンチオマー（Ａ）の量の少なくとも１５０％、好ましくは少なくとも２００％である、請求項４に記載の方法。６．α−アミノアミドが、式Ｉ：［式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アルカリール(alkaryl)、アラルキル、Ｒ¹ＮＨＣＯＲ¹、Ｒ¹ＣＯＮＨＲ¹ 、ＳＯ₂Ｒ¹もしくはＳＯ₂ＮＨＲ¹（ここで、Ｒ¹は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アリール、アルカリールまたはアラルキルである）またはこれらのいずれかの置換体であり、好ましくは、Ｃ₄〜Ｃ₉の直鎖状もしくは分岐状のアルキルもしくはアルケニル、環状のアルキルもしくはアルケニル、フェニル、または置換されたフェニル（ここで、置換基は、パラ−ＣＨ₃、メタ−ＣＨ₃、オルト−ＣＨ₃、パラ−ＣＦ₃、パラ−Ｅｔ、パラ−(ＣＨ₃)₃Ｃ、パラ−Ｃｌ、パラ−ＣＨ₃(ＣＨ₂)₃Ｏおよびパラ−ＯＨから選択される）である］を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。７．α−アミノ酸が非天然アミノ酸である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。８．エナンチオマー（Ａ）がＬ−エナンチオマーであり、Ｌ α−アミノ酸へと変換される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。９．少なくとも９８％のエナンチオマー過剰率が、変換時間に非依存的に与えられる、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。１０．流加（fed batch process）法である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。１１．変換反応が、少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間の長さである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。１２．変換反応中少なくとも３０分間、エナンチオマー（Ａ）に対応するα−アミノ酸がエナンチオマー(Ａ)よりも過剰に反応混合物中に存在する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。１３．エナンチオマー（Ａ）に対応するα−アミノ酸とエナンチオマー（Ａ）自体との比率が、少なくとも３：２、好ましくは少なくとも２：１である、請求項１４に記載の方法。１４．変換反応を行うことを含む、α−アミノアミドをα−アミノ酸へと変換する方法であって、α−アミノアミド出発物質にアミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）が含まれ、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）がエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される方法において、出発物質を、ロードコッカス（Rhodococcus）ＮＣＩＭＢ４０７９５またはロードコッカス・ラッツラビエンシス（Rhodococcus wratslaviensis）ＮＣＩＭＢ１３０８２由来の細胞物質と接触させることにより変換が行われることを特徴とする方法。１５．アミダーゼ酵素により触媒される変換反応を行うことを含む、α−メチルアミドまたはα−アミノメチルアミドをα−メチル酸またはα−アミノメチル酸へと変換する方法であって、α−メチルアミドまたはα−アミノメチルアミド出発物質にアミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）が含まれ、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）がエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される方法において、アミダーゼ酵素が、ロードコッカス（Rhodococcus）ＮＣＩＭＢ４０７９５またはロードコッカス・ラッツラビエンシス（Rhodococcus wratslaviensis）ＮＣＩＭＢ１３０８２により産生されたものであることを特徴とする方法。１６．アミダーゼ酵素により触媒される変換反応を行うことを含む、α−メチルアミドまたはα−アミノメチルアミドをα−メチル酸またはα−アミノメチル酸へと変換する方法であって、α−メチルアミドまたはα−アミノメチルアミド出発物質にアミド・エナンチオマー（Ａ）および（Ｂ）が含まれ、変換反応においてエナンチオマー（Ａ）がエナンチオマー（Ｂ）よりも優先的に変換される方法において、アミダーゼ酵素が、変換時間に非依存的に少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率を与えるように、エナンチオマー（Ａ）を変換でき、出発物質をロードコッカス（Rhodococcus）ＮＣＩＭＢ４０７９５またはロードコッカス・ラッツラビエンシス（Rhodococcus wratslaviensis）ＮＣＩＭＢ１３０８２由来の細胞物質と接触させることにより変換が行われることを特徴とする方法。１７．医薬または農薬の製造のための中間体としての、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法の生成物の使用。１８．請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法の生成物を中間体として使用することを含む、医薬または農薬の製造のための方法。１９．ロードコッカス（Rhodococcus）ＮＣＩＭＢ４０７９５またはアミダーゼを産生する能力を有するその変異株である微生物。２０.請求項１９に記載の微生物を培養することにより得られるアミダーゼ酵素。