JP6582040B2 - 7−β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体およびウルソデオキシコール酸の製造方法 - Google Patents
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Description
驚くべきことに、64位のアミノ酸アルギニンをアスパラギン酸に置換する試みの間に、この7β−HSDH変異体が顕著により高い活性を有することが分かった。このことは、その後も64位に変異を有する複数の別の変異体が野生型酵素よりも高い活性を示す限りにおいて確認された。さらに、均一に精製した酵素変異体を、対応して精製した実証された野生型酵素と比較すると、驚くべきことに、顕著により高い特異的酵素活性を示した。
1. 7−ケトステロイドから対応する7−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β−HSDH)であって、
該酵素は、配列番号2の酵素または当該配列を含む酵素[例えば、配列番号3(すなわち、1つのヒスチジンタグまたはヒスチジンアンカー配列によりN末端が伸長した配列番号2)を含む酵素]由来であり、
該酵素は、配列番号2(もしくは、例えば配列番号3)の位置17および/または64に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号2(もしくは、例えば配列番号3)と少なくとも80%(例えば、少なくとも85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99または99.5%)の配列同一性を有する。
配列番号2(もしくは、例えば配列番号3)のアミノ酸配列の変異によって修飾されたアミノ酸配列を有し、
該アミノ酸配列の変異が、(a)R64X1および/または(b)T17X2を含む単一または複数の変異の中から選択され、
X1は、アルギニン(R)以外のアミノ酸残基、特にタンパク質原性アミノ酸残基、特に任意の特異的活性を増加させるおよび/または基質阻害を減少させるおよび/または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸であり;そして、
X2はトレオニン(T)以外のタンパク質原性アミノ酸残基、特に任意の特異的活性を増加させるおよび/または基質阻害を減少させるおよび/または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸であり;
変異した(すなわち、修飾された)アミノ酸配列が、配列番号2(もしくは、例えば配列番号3)と80%以上100%未満(例えば、85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99または99.5%)、好ましくは少なくとも85%、特に少なくとも90%の配列同一性を有する。
X3は、グリシン(G)以外のアミノ酸残基、特にタンパク質原性アミノ酸残基、特に任意の特異的活性を増加させるおよび/または基質阻害を減少させるおよび/または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸である。
X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはVであり;
X2は、F、A、IまたはSであり;
X3は、S、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、特にSまたはAである。
R64A、R64S、R64D、R64V、R64T、R64P、R64N、R64E、R64Q、R64H、R64RL、R64K、R64C、R64G、R64I、R64Y、R64FおよびR64W、ならびに、T17F、T17A、T17I、T17S。
(G39S/R64E);(G39S/R64D);(G39S/R64T);(G39S/R64L);(G39S/R64S);(G39S/R64P);(G39S/R64V);(G39A/R64E);(G39A/R64D);(G39A/R64T);(G39A/R64S);(G39A/R64L);(G39A/R64P);(G39A/R64V)。
a)補因子としてNAD(P)H、特にNADPHを用いたデヒドロコール酸(DHCA)の酵素的還元における、DHCAに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);例えば、補因子NAD(P)H、特にNADPHの存在下で、非変異の酵素と比較して特異的活性(U/mg)が、少なくとも1,5,10,50または100%増加するか、特に少なくとも1倍、特に2〜100倍または3〜20倍または5〜10倍増加している。
b)補因子としてNAD(P)H、特にNADPHを用いたDHCAの酵素的還元における、NAD(P)H、特にNADPHに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);例えば、補因子NAD(P)H、特にNADPHの存在下で、非変異の酵素と比較して特異的活性(U/mg)が、少なくとも1,5または10%増加するか、特に少なくとも1倍、特に2〜10倍増加している。
c)低下したDHCAによる基質阻害、例えば、1mM以上、例えば1〜200mM、2〜150mM、2.5〜100mMの範囲のKi値;
d)NADHおよびNADPHに対する改変された補因子特異性、例えば広範な特異性、すなわち以前は使用されていない追加の補因子、特にNADPHの使用;
e)これらの特性a)〜d)は、個々にまたは任意の組み合わせで存在することができる。
(1)少なくとも上記特性a)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(2)少なくとも上記特性b)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(3)少なくとも上記特性c)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(4)少なくとも上記特性d)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(5)少なくとも上記特性a)とb)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(6)少なくとも上記特性a)とc)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(7)少なくとも上記特性a)とd)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(8)少なくとも上記特性b)とc)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(9)少なくとも上記特性b)とd)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(10)少なくとも上記特性a)〜d)を有する、単一の変異体R64X1(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、特に好ましくはEである)が、例として挙げられる。
(12)少なくとも上記特性b)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(13)少なくとも上記特性c)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(14)少なくとも上記特性d)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(15)少なくとも上記特性a)とb)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(16)少なくとも上記特性a)とc)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(17)少なくとも上記特性a)とd)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(18)少なくとも上記特性b)とc)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(19)少なくとも上記特性b)とd)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(20)少なくとも上記特性a)〜d)を有する、単一の変異体T17X2(X2は、T以外のアミノ酸残基、特にF、A、IまたはSである)が、例として挙げられる。
(22)少なくとも上記特性b)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(23)少なくとも上記特性c)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(24)少なくとも上記特性d)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(25)少なくとも上記特性a)とb)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(26)少なくとも上記特性a)とc)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(27)少なくとも上記特性a)とd)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(28)少なくとも上記特性b)とc)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(29)少なくとも上記特性b)とd)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
(30)少なくとも上記特性a)〜d)を有する、二重の変異体R64X1/G39X3(X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはN、特にE、D、T、L、S、PまたはV、好ましくはEであり、X3はS、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはR、好ましくはSまたはAである)が、例として挙げられる。
a)GDH、実施形態1〜6の1つである7β−HSDHおよび任意に3α−HSDHを同時にコードする核酸配列;
b)GDH、実施形態1〜6の1つである7β−HSDHおよび任意に3α−HSDHを含む融合タンパク質をコードする核酸配列:
当該コードする配列は、互いに独立して、コンストラクト中に単一または複数(例えば、2,3,4,5または6〜10コピーのように)存在しうる。したがって、個々の発現産物の活性に存在する差異は、適切なコピー数を選択することによって補うことができる。
特に、発現カセットに存在する酵素は、相違するか、好ましくは同一の補因子の対、例えば、補因子の対であるNAD+/NADHもしくはNADP+/NADPHを用いることができる。
a)両生体触媒は、遺伝的に改変され、互いに別々に最適化することができる。特に、NADHまたはNADPHの再生のために最適化された様々な補因子の再生酵素を使用することが可能である。
b)生体触媒について、異なる割合で生体触媒を使用することが可能である。これにより、すべての生体触媒の調製後であっても、生体触媒が作用している間、複数の酵素作用の個々の反応速度に関与することができる。
a)FDH(少なくともギ酸のCO2への酵素的酸化を触媒するNAD+依存性FDHの変異体を含み、該変異体は非変異の酵素と比較して補因子としてNADP+を追加的に受け入れる);および、
b)GDH。
a)任意に、式(2)のコール酸(CA)を化学的に酸化して式(3)のデヒドロコール酸(DHCA)とする;
特に、NADHおよび/またはNADPHの存在下および消費下で、続いて、
d)任意に、反応生成物をさらに精製する。
a)任意に、式(2)のコール酸(CA)を化学的に酸化して式(3)のDHCAとする;
特に、NADHおよび/またはNADPHの存在下および消費下で、続いて、
d)任意に、反応生成物をさらに精製する。
1.一般的な定義、および使用される略語
別段の定めがない限り、用語「7β−HSDH」は、DHCAまたは7,12−ジケト−3α−CA(7,12−ジケト−LCA)の少なくとも立体特異的および/または位置特異的な還元を触媒して、特にNADPHの化学量論的消費ならびに任意に対応する逆反応を伴って、3,12−ジケト−7β−CAまたは12−ケト−UDCAを得る脱水素酵素のことである。本明細書では、酵素は、天然の酵素であっても、組換え生産された酵素であってもよい。原則として酵素は、例えばタンパク質の混入物質などの細胞性混入物質との混合物として存在することもあるが、好ましくは純粋な形態で存在する。適切な検出方法は、例えば、下記実験部分に記載されているか、または文献から公知である(例えば、Characterization of NADP−dependent 7 beta−hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciensおよびS Hirano and N Masuda.Appl Environ Microbiol.1982)。この活性の酵素は、EC番号1.1.1.201に分類される。
本発明は、具体的に開示された7β−HSDH、FDH、GDHまたは3α−HSDH活性を有するタンパク質もしくは酵素および/またはそれらの変異体には限定されず、それだけではなくそれらの機能的同等物にも及ぶ。
a)分子量(SDSゲル電気泳動):約28〜32kDa、特に約29〜31kDaまたは約30kDa;
b)分子量(特にSDSを用いない非変性条件下でのゲル濾過):約53〜60kDa、特に約55〜57kDa、例えば56.1kDa。これは、Collinsella aerofaciens DSM39797β−HSDHの二量体性であることを確認する;
c)7−ケト−LCAの7−カルボニル基の7β−ヒドロキシ基への立体選択的還元;
d)pH8.5〜10.5の範囲におけるUDCAの酸化のために最適なpH、特にpH9〜10;
e)pH3.5〜6.5の範囲におけるDHCAおよび7−ケト−LCAの還元のために最適なpH、特にpH4〜6;
f)そこに記載された基質/補因子の少なくとも1つについて、以下の表からの少なくとも1つの動力学的パラメータ;±20%の範囲、特に、以下の表に具体的に記載された値を中心に、±10%、±5%、±3%、±2%または±1%:
a)対応する7β−ヒドロキシステロイドへの7−ケトステロイドの立体特異的還元;および/または
b)対応する7β−ヒドロキシステロイドを生じるための7位のケト基およびステロイド骨格上の少なくとも1個のさらなるケト基を含むケトステロイドの位置特異的ヒドロキシル化、特に、例えば、NADPH依存性である、対応する3,12−ジケト−7β−コラン酸を生成するための7位のデヒドロコール酸(DHCA)の位置特異的ヒドロキシル化。
3.1核酸
本発明の対象は、7β−HSDH、FDH、GDHおよび/または3α−HSDH活性を有する酵素およびその変異体をコードする核酸配列でもある。
ギャップ開始ペナルティ 10
ギャップ延長ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アライメント遅延の%同一性 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジッションウエイト 0
FASTアルゴリズム オン
K−タプルサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウィンドウサイズ 5
最適な対角線数 5
DNAギャップ伸長ペナルティ 6.66
DNAマトリックス 同一
プロテインギャップ開始ペナルティ 10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/ DNA ENDGAP -1
タンパク質 / DNA GAPDIST 4
− 遺伝子の単一または複数のヌクレオチドを特異的に置換する部位特異的変異(Trower MK(Ed.)1996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey);
− 任意の所望のアミノ酸のコドンを、遺伝子の任意の所望の位置で、置換または付加できる飽和変異(Kegler−Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res.22:1593;Barettino D,Feigenbutz M,Valcarel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)Mol.Biotechnol.3:1);
− ヌクレオチド配列が不完全に作用するDNAポリメラーゼによって変異するError−prone(エラープローン)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Eckert KA、Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res.18:3739);
− ヌクレオチド配列の変異割合が、例えば不完全なDNA修復機構のために増加している変異株の遺伝子の継代(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain.In:Trower MK(Ed.)In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey);または、
− DNAシャフリング(密接に関係する遺伝子プールが形成されて切断される)およびその断片は、鎖の分離および再アニーリングの繰り返しによって最終的に生成される全長モザイク遺伝子において、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用される(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747)。
さらに本発明の対象は、調節核酸配列の遺伝子調節下において、本発明における少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現コンストラクトである;そして、これらの発現コンストラクトの少なくとも1つを含むベクターである。
本明細書では、用語「微生物」は、出発(野生型)微生物もしくは遺伝子組換え微生物または両者を意味すると理解される。
工程1:CAのDHCAへの化学変換
CAのヒドロキシル基は、酸性溶液(例えば、H2SO4)中のクロム酸またはクロム酸塩を使用して、従来の化学的経路を介してそれ自体が公知の方法でカルボニル基に酸化される。これによりDHCAが生じる。
DHCAは、NADPHまたはNADHの存在下で、3α−HSDHおよび7β−HSDHまたはその変異体によって水溶液中で特異的に還元され、12−ケト−UDCAとなる。補因子NADPHまたはNADHは、それぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースからのADHまたはFDHまたはGDHまたはその変異体によって再生できる。その反応は緩やかな条件下で進行する。例えば、その反応は、pH=6〜9、特に約pH=8で、約10〜30℃、15〜25℃または約23℃で行うことができる。
12−ケト−UDCAの12−カルボニル基は、Wolff−Kischner還元によってそれ自体が公知の方法で除去され、それによって、UDCAが12−ケト−UDCAから生成される。この反応では、まず最初に、カルボニルをヒドラジンと反応させて、ヒドラゾンを得る。その後、塩基(例えば、KOH)の存在下で、ヒドラゾンを200℃に加熱する。この工程の間、窒素が取り除かれてUDCAが生じる。
さらに本発明の対象は、本発明におけるポリペプチドまたはその機能的な生物学的に活性のある断片を組換え生産する方法であり、該方法では、ポリペプチド産生微生物を培養し、ポリペプチドの発現を任意に誘導し、ポリペプチドを培養物から単離する。必要に応じて、当該ポリペプチドはこの方法で工業的規模で生産することもできる。
本明細書に記載の方法において、本発明における酵素は、遊離または固定された形態で使用できる。固定化酵素は、不活性支持体に固定された酵素を意味すると理解される。適切な支持材料およびその上に固定化された酵素は、EP−A−1149849、EP−A−1 069 183およびDE−OS 100193773、ならびに、それらに引用された文献から公知である。この点において、前記文献の開示は、その全体が参照される。適切な支持材料としては、例えば、粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換物質、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール・ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびに、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィンが挙げられる。該支持材料は、通常、支持される酵素の調製のために、細かく分割された粒状で使用され、多孔質の形状であることが好ましい。その支持材料の粒径は、通常は5mm以下であり、特に2mm以下である(傾斜曲線)。同様に、全細胞の触媒としてのデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定された形態が選択できる。支持材料は、例えば、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素に加えて細胞も、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋できる(CLEAへの架橋)。対応するおよびさらなる固定化方法は、例えば、J.Lalonde and A.Margolin“Immobilization of Enzymes”in K.Drauz and H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,Vol.III,991−1032,Wiley−VCH,Weinheimに記載されている。
特に明記しない限り、クローニング工程は、例えば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への転写、DNA断片の結合、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖などの本発明の範囲内で実施される。また組換えDNAの配列分析は、Sambrook et al.(1989)loc.citに記載されている。
材料:
Collinsella aerofaciens DSM 3979(ATCC 25986、以前はEubacterium aerofaciensと呼ばれていた)のゲノムDNAは、Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)から入手した。DHCA、UDCAおよび7−ケト−LCAは、それ自体は公知な出発化合物であり、文献に記載されている。他のすべての化学物質は、Sigma−AldrichおよびFluka(ドイツ)から入手した。すべての制限酵素エンドヌクレアーゼ、T4 DNAリガーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、Plusion DNAポリメラーゼおよびイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)は、Thermo Scientific(Germany)から入手した。
LB培地:培地1リットル当たり、トリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10gを含む
図2は、野生型7β−HSDH酵素および変異体のアミノ酸配列を示す。しかしながら、いずれの場合も全てがC末端ヘキサヒスチジンタグに提供される。このようにして、全ての酵素が単離され、特徴付けられた。
A)プラスミド形質転換:
制限酵素NcoIおよびXhoIの切断部位を介して、それぞれの7β−HSDH遺伝子をクローニングした市販の発現ベクターpET28a(+)を、組換え7β−HSDH酵素(野生型および変異体酵素)の発現のために使用した。発現ベクターpET28a(+)は、HSDH遺伝子をクローニングするときに、一連の6個のヒスチジン分子をコードする遺伝子配列をHSDH遺伝子に直接付加することを可能にする。発現後、この配列(ヘキサヒスチジンタグまたはHisタグと呼ばれる)は、HSDHタンパク質のC末端に現れる。オリジナルの、または、野生型HSDH遺伝子は、細菌Collinsella aerofaciens ATCC 25986に由来し、それぞれの7β−HSDH遺伝子を含むプラスミドは、pET28a(+)_7β−HSDHと呼ばれる。pET28a(+)_7β−HSDHプラスミドを形質転換するために、5μlのライゲーション用混合物を100μlのコンピテントBL21(DE3)Δ7α−HSDH大腸菌細胞に処理し、形質転換をHanahanによって記載されたように実施した(J.Mol.Biol.(1983),vol.166,pp.557)。野生型遺伝子を含むプラスミドおよび変異したHSDH遺伝子を含むプラスミドを用いて同じ工程を行なった。本明細書中で通常使用されている大腸菌株BL21(DE3)Δ7α−HSDHは、この株の7α−HSDH遺伝子が欠失している点で区別される。この研究に用いた大腸菌株の詳細な特徴を表1にまとめる。
発現のために、発現コンストラクト(pET28a(+)_7β−HSDHプラスミド)を含む大腸菌株を50μg/mlのカナマイシンを含むLB培地(1リットル当たり、トリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10g)中で20時間、25℃で増殖させた。遠心分離(5000×g、30分、4℃)により細胞を収集した。
細胞1g(湿潤質量)当たり4mlの緩衝液を添加して、ペレットを破砕用緩衝液(10mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8)に再懸濁した。Sonopuls HD2070ソニケーター(Bandelin、ベルリン、ドイツ)を使用して、一定冷却下で、細胞を1分間超音波処理(30W出力、50%作動間隔および1分間の中断)により破砕した。この破砕を3回繰り返した。細胞懸濁液を遠心分離(18000×g、30分、4℃)し、上清を無細胞粗抽出物とした。
His−タグは、HSDHタンパク質の非常に簡単な精製を可能にする。なぜなら、この配列は、例えば「His Pur Ni−Ni」(Nimagen B.V.,Nijmegen,The Netherlands)などの二価のニッケルイオンを充填した特異的なクロマトグラフィー材料である(NTA(Ni−ニトリロトリアセテート)修飾した支持体に高い特異性で結合するからである。この目的のために、無細胞粗抽出物をこの材料を含む滴下カラムにかける。この滴下カラムは、予め破砕緩衝液(3〜5カラム容量)で平衡化させた。3〜5カラム容量の洗浄緩衝液(20mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8)で洗浄することによって、弱く結合するタンパク質を除去した。His−タグ−7β−HSDHタンパク質をイミダゾール含有溶出緩衝液(250mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8)で溶離した。この工程は室温で行った。存在するイミダゾールは、緩衝液の交換によって除去された。
吸光度の低下を340nmで30秒間にわたって測定する分光アッセイを用いて、7β−HSDHおよび変異体の活性を測定した。反応溶液は、全量1ml中に、874μlの50mMリン酸カリウム(KPi)緩衝液(pH8.0);100μlの100mM DHCA溶液(50mMのKPiに溶解したDHCA(pH8));10μlの酵素溶液(任意に希釈);16.5μlの12.5mM NADPH溶液(蒸留H2Oに溶解)を含む。以下においては、活性は単位(U)で特定され、1Uは1μM NADPH/分の減少に相当する。
A)プライマー:
下記の変異導入プライマーを使用して、7β−HSDHの位置特異的変異導入を実施した(表2参照)。7β−HSDHの遺伝子配列に基づいて、プライマーは、所望するアミノ酸を変換するように選択された。変異体を生成するために以下のプライマーペアを使用した:
64位のアミノ酸のアルギニンをアスパラギン酸に置換した最初の変異体が、野生型酵素よりも著しく高い活性を示した後、その位置にさらなるタンパク質を構成するアミノ酸を組み込み、これらの活性に関するこれらの様々な変異体を試験した。目的とするアミノ酸の変換は「QuikChange−PCR」法によって達成できる。このために、以下のPCR反応を行った(反応混合物は表3を参照):最初に、95℃で2分間の初期変性工程を行い、その後、20サイクルの変性(95℃で30秒間)、プライマーのハイブリダイゼーション(60〜68℃で1分間)および伸長(68℃で13分間)を行った。実施された最後の工程は、68℃で10分間の最終伸長であり、その後、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は4℃に冷却することによって終了した。用いた鋳型は、7β−HSDH(野生型)の遺伝子を有するpET28aベクターであった。
64位において変異導入された変異体の活性測定(実施例1参照)を、以下の表4に示すデータで明らかにした。表の第1列の[R64E]は、タンパク質配列の64位のアルギニン(R)が、目的の変異体のグルタミン酸(E)に置換されたことを意味する。各々のアミノ酸は、国際的な1文字コードを用いて略記される。同様に[R64D]は、アスパラギン酸がこの位置に導入されたことを意味する。
それぞれの位置の最良の変異体を実施例1Dのように精製し、基質DHCAおよび補酵素NADPHの動態定数vmaxおよびKMを決定した。図3は動力学の経過を図示し、表5は動力学的定数を示す。
A)プライマー:
表6に列挙した変異導入プライマーを、7β−HSDHの位置特異的変異導入のために使用した。7β−HSDHの遺伝子配列に基づいて、プライマーは、所望するアミノ酸変換をするように選択された。変異体を生成するために、以下のプライマーペアを使用した:
39位のセリンのグリシンへの標的変換は、実施例2Bに記載のQuikChange PCRを用いて行った。
39位のグリシンの代わりにセリンを含む変異体(7β−HSDH[G39S])の活性測定(実施例1参照)は、735U/mlの容量活性および52.9U/mgのタンパク質特異的酵素活性を示し、一方、野生型酵素を比較すると、96.8U/mlの容量活性および8.7U/mgの特異的活性を有していた。
動力学的パラメーター定数vmaxおよびKMを精製された酵素を用いて決定した。図4は動力学の経過を図示し、表7は動力学定数を示す。
A)プライマー:
表8に記載した変異導入プライマーを、7β−HSDHの位置特異的変異導入のために使用した。変異体を生成するために以下のプライマーペアを使用した:
表8に記載されたアミノ酸の17位のスレオニンの標的変換は、実施例2Bに記載のQuikChange PCRにより行った。
17位のスレオニン以外のアミノ酸を含む変異体の活性測定値(実施例1参照)を表9にまとめる。
実施例2〜4に記載された個々の変異体の他に、変異を有利に組み合わせることも可能である。例として、位置39および64が同時に改変された二重変異体を生成した。ここでは、位置39における最良のアミノ酸変換([G39S])を、位置64における最良の変換([R64E])と組み合わせた。
二重変異体を得る方法および活性試験は、2Bおよび2Cに記載された方法に従った。
異種発現の発現性能の評価を可能とするために、SDS−PAGEを行った。二重変異体を例として用いた。図5は、粗細胞抽出物を用いることにより、この変異体が非常に良好な過剰発現を示しているSDSゲルを示す(おおよそで流した広範なバンド)。30kDaは、細胞内の可溶性タンパク質が二重変異体のみと高度に一致することを裏付ける。またさらに、当該ゲルは、精製された二重変異体の純度を確認する。変異体の分子量は約29.9kDaである。
変異体[G39S/R64E]を精製し(項目3参照)、精製された酵素について動力学的パラメーターを測定した。図6に経過を図示し、表11に動力学定数を示す。
n.d.=測定なし
Claims (23)
- 7−ケトステロイドの、対応する7−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β−HSDH)であって、
該酵素が、配列番号2の位置17に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有し、
位置17の変異が、T17X2(式中、X2はF,A,IまたはSである)であり、そして、
該酵素が、配列番号2を有する7β−HSDHと比較して以下のa)、b)、c)およびd)から選択される1以上の特性プロファイルを示す、7β−HSDH:
a)補因子としてNAD(P)Hを用いたデヒドロコール酸(DHCA)の酵素的還元における、DHCAに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);
b)補因子としてNAD(P)Hを用いたDHCAの酵素的還元における、NAD(P)Hに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);
c)低下したDHCAによる基質阻害;
d)NADHおよびNADPHに対する改変された補因子特異性。 - 7−ケトステロイドの、対応する7−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β−HSDH)であって、
該酵素が、配列番号2の位置64に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有し、
位置64の変異が、変異R64X1(式中、X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、IまたはYである)であり、そして、
該酵素が、配列番号2を有する7β−HSDHと比較して以下の特性プロファイルb)ならびに任意に以下のa)、c)およびd)から選択される1以上の特性プロファイルを示す、7β−HSDH:
b)補因子としてNAD(P)Hを用いたDHCAの酵素的還元における、NAD(P)Hに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);
a)補因子としてNAD(P)Hを用いたデヒドロコール酸(DHCA)の酵素的還元における、DHCAに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);
c)低下したDHCAによる基質阻害;
d)NADHおよびNADPHに対する改変された補因子特異性。 - 7−ケトステロイドの、対応する7−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である7β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β−HSDH)であって、
該酵素が、配列番号2の位置64に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有し、
さらに少なくとも1つの変異を配列番号2の位置36〜42の配列モチーフVMVGRREに、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列モチーフに有し、かつ、配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有し、
位置64の変異が、変異R64X1(式中、X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、IまたはYである)であり、そして、
該酵素が、配列番号2を有する7β−HSDHと比較して以下の特性プロファイルb)ならびに任意に以下のa)、c)およびd)から選択される1以上の特性プロファイルを示す、7β−HSDH:
b)補因子としてNAD(P)Hを用いたDHCAの酵素的還元における、NAD(P)Hに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);
a)補因子としてNAD(P)Hを用いたデヒドロコール酸(DHCA)の酵素的還元における、DHCAに対する増加した特異的活性(Vmax[U/mg]);
c)低下したDHCAによる基質阻害;
d)NADHおよびNADPHに対する改変された補因子特異性。 - さらに、アミノ酸配列の変異G39X3(式中、X3はグリシン(G)以外のアミノ酸残基である)を有する、請求項3に記載の7β−HSDH。
- 二重の変異体R64X1/G39X3の中から選択される、請求項3または4に記載の7β−HSDH:
X1は、E、D、T、L、S、P、V、K、C、A、G、Q、F、W、I、Y、HまたはNであり;そして、
X3は、S、A、V、I、L、C、K、Y、FまたはRである。 - 二重の変異体が以下の中から選択される、請求項5に記載の7β−HSDH:
(G39S/R64E);(G39S/R64D);(G39S/R64T);(G39S/R64L);(G39S/R64S);(G39S/R64P);(G39S/R64V);(G39A/R64E);(G39A/R64D);(G39A/R64T);(G39A/R64S);(G39A/R64L);(G39A/R64P);(G39A/R64V)。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載の7β−HSDHをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- 少なくとも1つの調節配列の制御下で、少なくとも1つの請求項7に記載のヌクレオチド配列を含む発現カセット。
- 少なくとも1つの請求項8に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
- 少なくとも1つの請求項7に記載のヌクレオチド配列または少なくとも1つの請求項8に記載の発現カセットまたは少なくとも1つの請求項9に記載の発現ベクターを有する、組換え微生物。
- 補因子の再生に適切なヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSDH)およびデヒドロゲナーゼの中から選択される少なくとも1つのさらなる酵素をコードする配列を任意に追加的に有する、請求項10に記載の組換え微生物。
- さらなるHSHDが3α−HSDHから選択され;そして、
デヒドロゲナーゼが、NADPH再生酵素およびNADH再生酵素の中から選択される、請求項11に記載の組換え微生物。 - NADPH再生酵素が、NADPHデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、NADPH再生ホルメートデヒドロゲナーゼ(FDH)、NADPH再生グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、NADPH再生グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G−6−PDH)およびNADPH再生ホスファイトデヒドロゲナーゼ(PtDH)の中から選択され、
NADH再生酵素が、NADHデヒドロゲナーゼ、NADH再生アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、NADH再生ホルメートデヒドロゲナーゼ(FDH)、NADH再生グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、NADH再生グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ(G6PDH)およびNADH再生ホスファイトデヒドロゲナーゼ(PtDH)の中から選択される、請求項12に記載の組換え微生物。 - 7α−HSDHノックアウト株である、請求項10〜13のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 7β−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成方法であって、請求項1〜6のいずれか一項に記載の7β−HSDHの存在下で、または、請求項10〜14のいずれか一項に記載の7β−HSDHを発現する組換え微生物の存在下で、対応する7−ケトステロイドが還元され、任意に少なくとも1つの形成された還元生成物が反応混合物から単離される方法。
- 7−ケトステロイドが、デヒドロコール酸(DHCA)、7−ケト−リトコール酸(7−ケト−LCA)、7,12−ジケト−リトコール酸(7,12−ジケト−LCA)、および、これらの誘導体の中から選択される、請求項15に記載の方法。
- 還元が、NADPHおよび/またはNADHの存在下で、特にNADPHおよび/またはNADHの消費によって行われる、請求項15または16に記載の方法。
- (a)消費されたNADPHが、NADPH再生酵素とのカップリングによって再生され、または、
(b)消費されたNADHが、NADH再生酵素とのカップリングによって再生され、または、
(c)(a)および(b)の両方が実施される、
請求項17に記載の方法。 - NADPH再生酵素が以下から選択される請求項18に記載の方法:
a)FDH(少なくともギ酸のCO2への酵素的酸化を触媒するNAD+依存性FDHの変異体を含み、該変異体は非変異の酵素と比較して補因子としてNADP+を追加的に受け入れる);および、
b)GDH。 - 式(1)のウルソデオキシコール酸(UDCA)の製造方法であって:
[式中、Rはアルキル、H、アルカリ金属イオンまたはN(R3)4 +を表し、基R3は同一または異なってHまたはアルキルを表すか、または、基−CO2Rが酸アミド基−CONR1R2で置換されている。R1とR2は互いに独立してアルキル基を表す。];
a)任意に、式(2)のコール酸(CA)を化学的に酸化して式(3)のデヒドロコール酸(DHCA)とし;
[式中、Rは上記の意味を有するか、または、基−CO2Rが上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。]
[式中、Rは上記の意味を有するか、または、基−CO2Rが上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。];
b)少なくとも1つの請求項1〜6のいずれか一項に記載の7β−HSDH変異体の存在下および少なくとも1つの3α−HSDHの存在下で、DHCAを還元して対応する式(5)の12−ケト−ウルソデオキシコール酸(12−ケトUDCA)とし;
[式中、Rは上記の意味を有するか、または、基−CO2Rが上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。];
特に、NADHおよび/またはNADPHの存在下および消費下で、続いて、
c)式(5)の12−ケト−UDCAを化学的に還元してUDCAとし;そして、
d)任意に、さらに反応生成物を精製する、
製造方法。 - 少なくとも工程b)が、請求項10〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物の存在下で行われる、請求項20に記載の方法。
- 工程b)が同一または異なる補因子の再生システムと一体である、請求項20または21に記載の方法。
- 式(1)のUDCAの製造方法であって:
[式中、Rはアルキル、H、アルカリ金属イオンまたはN(R3)4 +を表し、基R3は同一または異なってHまたはアルキルを表すか、または、基−CO2Rが、上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。];
a)任意に、式(2)のコール酸(CA)を化学的に酸化して式(3)のDHCAとし;
[式中、Rは上記の意味を有するか、または、基−CO2Rが上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。]
[式中、Rは上記の意味を有するか、または、基−CO2Rが上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。];
b)少なくとも1つの7β−HSDHの存在下および少なくとも1つの3α−HSDHの存在下で、DHCAを還元して対応する式(5)の12−ケトUDCAとし;
[式中、Rは上記の意味を有するか、または、基−CO2Rが上で定義した酸アミド基−CONR1R2で置換されている。];
特に、NADHおよび/またはNADPHの存在下および消費下で、続いて、
c)式(5)の12−ケト−UDCAを化学的に還元してUDCAとし;そして、
d)任意に、さらに反応生成物を精製し;
工程b)の変換が、請求項10〜14のいずれか一項に記載の組換え微生物の存在下で行われる、製造方法。
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