CN106543289A

CN106543289A - 雷公藤倍半萜合酶TwNES及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106543289A
Application number: CN201611055465.2A
Authority: CN
Inventors: 高伟; 黄璐琦; 苏平; 周家伟; 胡添源
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: CN106543289B

Abstract

本发明公开了雷公藤倍半萜合酶TwNES及其编码基因与应用。本发明从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Twnes基因。该基因是首次从雷公藤中得到的倍半萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的TwNES蛋白既能够催化FPP形成橙花叔醇((E)‑nerolidol)，也能催化GGPP形成香叶基芳樟醇((E,E)‑geranyllinalool)，不仅对雷公藤中倍半萜类生物碱合成具有重要作用，也对于调节和生产植物倍半萜类化合物及培育高品质的雷公藤具有重要的理论及实际意义。

Description

雷公藤倍半萜合酶TwNES及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于药用植物基因工程领域，具体涉及雷公藤倍半萜合酶TwNES及其编码基因与应用。

背景技术

药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是一味中草药，被广泛用于类风湿性关节炎和炎症的治疗(Raphaela G M,Mildred W,Roy F,et al.Comparison ofTripterygium wilfordii Hook F Versus Sulfasalazine in the Treatment ofRheumatoid Arthritis:A Randomized Trial[J].Annals of Internal Medicine,2009,151(4):229-240；Tao X L,Lipsky P E.The Chinese anti-inflammatory andimmunosuppressive herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F.[J].RheumaticDisease Clinics of North America,2000,26(1):29–50.)。萜类成分为雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚内酯(triptophenolide)和雷公藤红素(celastrol)等。从中药中的活性成分开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分在雷公藤中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

雷公藤中的萜类化合物具有抗炎、抗风湿、抗肿瘤、免疫抑制等活性。通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonic acid(MVA)pathway)和质体的2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其异构体Dimethylallyl pyrophosphate(DMAPP)。再由此分别生成单萜(monoterpenes)、倍半萜(sesquiterpenes)、二萜(diterpenes)、三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate，GGPP)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质，将其命名为TwNES：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

其中，序列2由552个氨基酸残基组成。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1第65-1723位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明的第二个目的是提供与TwNES蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与TwNES蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码TwNES蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第65-1723位所示的cDNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TwNES蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TwNES蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TwNES的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码TwNES的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TwNES且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码TwNES的核酸分子的表达盒(Twnes基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达Twnes的DNA，该DNA不但可包括启动Twnes转录的启动子，还可包括终止Twnes转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明的第三个目的是提供TwNES蛋白质的新用途。

本发明提供了TwNES蛋白质在作为倍半萜合酶中的应用。

本发明第四个目的是提供上述生物材料的新用途。

本发明提供了上述生物材料在制备倍半萜合酶中的应用。

本发明提供了TwNES蛋白质或上述相关生物材料在如下1)-3)中任一种中的应用：

1)制备或合成萜类化合物；

2)催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)形成香叶基芳樟醇((E,E)-geranyllinalool)；

3)催化法尼基焦磷酸(FPP)形成橙花叔醇((E)-nerolidol)。

上述应用中，

所述萜类化合物为二萜类化合物和/或倍半萜类化合物；

所述二萜类化合物为香叶基芳樟醇，所述倍半萜类化合物为橙花叔醇。

本发明的最后一个目的是提供一种萜类化合物的合成方法。

本发明提供的萜类化合物的合成方法包括如下步骤：将TwNES蛋白质、底物和酶促缓冲液混匀，反应，得到萜类化合物。

上述方法中，

所述TwNES蛋白质与底物的质量比为2：1；

所述酶促缓冲液包括MgCl₂；

所述MgCl₂在所述酶促缓冲液中的浓度为10mM。

上述方法中，

所述酶促缓冲液由HEPES、MgCl₂、DTT和甘油组成；

所述HEPES在所述酶促缓冲液中的浓度为50mM；

所述DTT在所述酶促缓冲液中的浓度为5mM；

所述甘油在所述酶促缓冲液中的体积分数为10％。

上述方法中，

所述底物为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸或法尼基焦磷酸；

所述萜类化合物为二萜类化合物和/或倍半萜类化合物；

本发明从雷公藤悬浮细胞中克隆得到Twnes基因。该基因是首次从雷公藤中得到的倍半萜类成分合成的关键酶基因。通过实验证明：本发明的TwNES蛋白既能够催化FPP形成橙花叔醇((E)-nerolidol)，也能催化GGPP形成香叶基芳樟醇((E,E)-geranyllinalool)，不仅对雷公藤中倍半萜类生物碱合成具有重要作用，也对于调节和生产植物倍半萜类化合物及培育高品质的雷公藤具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为丙甲菌素对雷公藤悬浮细胞中Twnes基因表达的作用。

图2为聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在大肠杆菌中表达的TwNES蛋白。泳道1为蛋白分子量标准，条带由上往下分别为170、130、100、70、55KDa；泳道2为表达载体pMAL-c2X表达的纯化蛋白，箭头表示目的蛋白；泳道3为重组质粒pMALTwNES表达的纯化蛋白，箭头表示目的蛋白。

图3为纯化后的TwNES酶促反应产物GC-MS分析。图3A为TwNES分别催化底物FPP和GGPP形成产物提取离子图；图3B和图3C分别为标准品橙花叔醇和香叶基芳樟醇的质谱图；图3D和图3E分别为TwNES催化底物FPP和GGPP形成产物的质谱图。

图4为TwNES表达蛋白在不同浓度的Mg²⁺和K⁺下的活性。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)悬浮细胞在文献“雷公藤4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析.中国中药杂志,2015,40(21):4165-4170”中公开过，公众可从首都医科大学分子生药与中药资源实验室获得。

下述实施例中的SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit和PrimeSTAR GXL DNAPolymerase均是Takara公司的产品；

pEASY-Blunt Simple Cloning Kit是北京全式金生物技术有限公司的产品；

法尼基焦磷酸FPP是Sigma公司的产品，产品目录号为F6892，CAS号为13058-04-3；

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸GGPP是Sigma公司的产品，产品目录号为G6025，CAS号为6699-20-3；

(E)-nerolidol是Sigma公司的产品，产品目录号为18143，CAS号为40716-66-3；

(E,E)-geranyllinalool是Sigma公司的产品，产品目录号为48809，CAS号为1113-21-9。

实施例1、雷公藤Twnes全长cDNA序列的克隆

1、cDNA的获得

采用改良CTAB法提取雷公藤悬浮细胞总RNA；利用SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit试剂盒中引物5’-CDS primer以获得的RNA为模板，进行反转录得到5’-RACE-Ready cDNA；

2、PCR扩增

以步骤1获得的5’-RACE-Ready cDNA为模板，采用TwNES-F和TwNES-R引物(下划线所示序列为酶切识别位点)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。并对PCR扩增产物进行测序。

TwNES-F：5’-CGCGGATCCATGGCCTTCTTTGGTTCCTCTCGC-3’

TwNES-R：5’-CGCGTCGACTTACTTAATCAGGATGGATTTAAGG-3’

PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 2min，35个循环；68℃延伸5min。

测序结果表明：PCR扩增产物的序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为TwNES，其中，自5’端第65-1723bp位为ORF，编码由552个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为TwNES，该蛋白的氨基酸序列为序列2。

实施例2、丙甲菌素处理后Twnes基因表达分析

一、实验材料的处理

1、将雷公藤悬浮细胞在培养液A中，于25±1℃120rpm黑暗条件下摇培10天，得到丙甲菌素处理的雷公藤悬浮细胞；

将雷公藤悬浮细胞在培养液B中，于25±1℃120rpm条件下黑暗摇培30h天，得到对照雷公藤悬浮细胞；

培养液A为将丙甲菌素(阿拉丁，A132913)、乙醇溶液和MS液体培养基(+0.1mg/LKT+0.5mg/L IBA+0.5mg/L 2,4-D)混匀后得到的培养液，其中，丙甲菌素的终浓度为100ng/L、乙醇溶液的体积分数为0.1％。

培养液B为将乙醇溶液和MS液体培养基(+0.1mg/L KT+0.5mg/L IBA+0.5mg/L 2,4-D)混匀后得到的培养液，其中，乙醇溶液的体积分数为0.1％。

二、采用改良CTAB法提取步骤一得到的丙甲菌素处理的雷公藤悬浮细胞和对照细胞的总RNA，步骤详见试剂盒操作手册；取1μg总RNA模板按FastQuant RT Kit(WithgDNase)(天根)说明书反转录得到第一链cDNA。

三、Real-time定量PCR

采用ABI Prism 7300Sequence Detection System(Applied Biosystems,USA)和KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR Master Mix(Kapa Biosystems,USA)试剂盒以步骤二获得的cDNA为模板进行Real-time定量PCR，并以雷公藤actin基因未内参基因。引物序列如下：

TwNES-F:5'-TGCCGTCCAACGCCTT-3’；

TwNES-R:5’-CCATTAGTCCCTTTATGTCTCCA-3’；

actin-F：5’-AGGAACCACCGATCCAGACA-3’；

actin-R：5’-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3’。

Real-time定量PCR反应条件：94℃ 3min；94℃ 3sec，60℃ 30sec，40cycles。

结果如图1所示。经过丙甲菌素处理，actin内参基因均一化之后，丙甲菌素处理的雷公藤悬浮细胞的Twnes基因表达水平是对照组的3.66倍，说明雷公藤悬浮细胞经丙甲菌素处理后，Twnes基因表达水平有明显提高，从而有利于其编码的蛋白TwNES催化形成(E)-nerolidol和(E,E)-geranyllinalool，推动代谢流向目的产物。

实施例3、雷公藤TwNES蛋白的获得及其功能分析

一、雷公藤TwNES蛋白的获得

1、重组载体的构建

将序列1第65-1723bp位所示的DNA片段替换载体pMAL-c2X(New EnglandBiolabs,产品目录号E8000S)的BamHI和SalI酶切位点间的片段，且保持pMAL-c2X载体其他序列不变，得到重组质粒pMAL-TwNES。

2、重组菌的获得

将重组质粒pMAL-TwNES转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到pMAL-TwNES重组菌；同时用不含目的基因的pMAL-c2X空载体转化大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)作为对照菌。

3、重组蛋白TwNES的获得

挑取pMAL-TwNES重组菌和对照菌分别接种于2mL的LB液体培养基(含羧苄青霉素100mg/L)中，于37℃振荡培养过夜。次日按1：100稀释加入到200mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时转入16℃振摇1小时，加入IPTG至终浓度0.5mM，继续于16℃摇床培养24小时诱导目标蛋白表达。将菌液用3000×g离心20min，弃上清，收集pMAL-TwNES重组菌和对照菌菌体，保存在-80℃冰箱备用。

4、重组蛋白TwNES的纯化

对pMAL-TwNES重组菌和对照菌菌体进行纯化，分别得到重组蛋白TwNES(MBP-TwNES)和标签蛋白(MBP)。具体步骤如下：将pMAL-TwNES重组菌和对照菌菌体用预冷的5mL重悬缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,0.1mM EDTA,150mM NaCl,1mM DTT,5％甘油,1mMPMSF)重悬；加入终浓度为0.5mg/mL的溶菌酶，冰上静置20min；加入终浓度体积分数0.2％的Triton X-100和1/10体积的5M NaCl，置冰浴中超声破菌(30％功率，超声5秒，间隔5秒，持续5min，重复1次)，12000×g，4℃离心30min，分别得到pMAL-TwNES重组菌和对照菌上清；取pMAL-TwNES重组菌和对照菌上清，分别与1mL直链淀粉树脂(Amylose resin，购自NEB公司)于PD-10柱(购自GE Healthcare公司)中旋转混匀30min(4℃)，并静置10min；加入10倍柱体积的清洗缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,0.1mM EDTA,500mM NaCl,1mM DTT,5％甘油)清洗；加入10倍柱体积的重悬缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,0.1mM EDTA,150mMNaCl,1mM DTT,5％甘油)清洗；加入2倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl,pH 7.5,0.1mM EDTA,150mM NaCl,1mM DTT,5％甘油,10mM麦芽糖)，静置10min，收集洗脱液；再次加入2倍柱体积的洗脱缓冲液，静置10min，合并两次洗脱液；采用蛋白超滤管(购自MerckMillipore公司)将含纯化目的蛋白的洗脱液置换为酶促缓冲液(50mM HEPES,10mM MgCl₂,100mM KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)，经Bradford法进行蛋白定量，分别得到重组蛋白TwNES(MBP-TwNES)和对照菌中空载体表达的标签蛋白(MBP)，浓度分别为8.4和1.9μg/μL。

分别将pMAL-TwNES重组菌上清及其纯化后洗脱液、对照菌上清及其纯化后洗脱液进行SDS-PAGE，结果如图2所示。从图中可以看出，纯化后的TwNES蛋白大小约为100kDa，大小与预期相符。而对照菌中没有目的蛋白。

二、重组蛋白TwNES酶促活性分析

1、酶促活性

(1)酶促反应体系的制备

取步骤一中的“4”纯化的重组蛋白TwNES和标签蛋白(MBP)进行酶促反应。根据底物不同分为如下两组，每组均设有对照，各组酶促反应体系如下：

GGPP组：

GGPP组酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)和酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES(生工生物工程(上海)股份有限公司，75277-39-3),10mM MgCl₂(国药集团化学试剂有限公司，7791-18-6),100mM KCl(国药集团化学试剂有限公司，7447-40-7),5mM DTT(Sigma，3483-12-3),10％甘油(国药集团化学试剂有限公司，56-81-5),pH 7.5)混匀得到的体系，并将GGPP组酶促反应总体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置2小时后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用。

GGPP组对照酶促反应：将GGPP组酶促反应总体系中重组蛋白TwNES替换为步骤二的“4”中制备的标签蛋白(MBP)，实验同上述的GGPP组酶促反应。

FPP组：

FPP组酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物法尼基焦磷酸(FPP)和酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,10mM MgCl₂,100mM KCl,5mMDTT,10％甘油,pH 7.5)混匀得到的体系，并将FPP组酶促反应总体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置2小时后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用。

FPP组对照酶促反应：将FPP组酶促反应总体系中重组蛋白TwNES替换为步骤二的“4”中制备的标签蛋白(MBP)，实验同上述的FPP组酶促反应。

(2)GC-MS分析

利用气质联用GC-MS对各组体系进行目标化合物的检测：GC-MS分析系统为ThermoTRACE 1310/TSQ 8000gas chromatograph，进样量1μL，splitless模式，气相色谱柱为DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)，氦气流速1.0mL/min，进样口温度250℃，离子源温度250℃，升温程序为50℃保持2min，程序升温20℃·min^-1到300℃，并保持20min，电子能量70eV，对样品进行40-450m/z范围扫描。

GC-MS分析结果如图3所示：与空载体酶促反应对照相比，纯化后的TwNES蛋白既能够催化GGPP形成香叶基芳樟醇((E,E)-geranyllinalool)，也能催化FPP形成橙花叔醇((E)-nerolidol)。

2、不同浓度Mg²⁺的酶促活性检测及酶促动力学分析

检测步骤一中的“4”纯化的重组蛋白TwNES在不同浓度Mg²⁺下的酶促活性。根据浓度的不同分别五组，各组酶促反应体系如下：

Mg²⁺(0mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)和酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,100mM KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

Mg²⁺(5mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,100mM KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和5mM MgCl₂混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

Mg²⁺(10mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,100mM KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和10mM MgCl₂混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

Mg²⁺(15mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,100mM KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和15mM MgCl₂混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

Mg²⁺(20mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,100mM KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和20mM MgCl₂混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)GC-MS分析

利用气质联用GC-MS对各组体系进行目标化合物的检测。检测方法同步骤1中的(2)。

GC-MS分析结果如图4所示，在10mM MgCl₂条件下，重组蛋白TwNES的酶活性最高。

3、不同浓度K⁺的酶促活性检测及酶促动力学分析

检测步骤一中的“4”纯化的重组蛋白TwNES在不同浓度K⁺下的酶促活性。根据浓度的不同分别五组，各组酶促反应体系如下：

K⁺(0mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)和酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,10mM MgCl₂,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

K⁺(50mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,10mM MgCl₂,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和50mM KCl混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

K⁺(100mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,10mMMgCl₂,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和100mM KCl混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

K⁺(150mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,10mMMgCl₂,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和150mM KCl混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

K⁺(200mM)：酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)、酶促缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度为：50mM HEPES,10mMMgCl₂,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)和200mM KCl混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

(2)GC-MS分析

GC-MS分析结果如图4所示，在10mM MgCl₂，200mM KCl条件下，重组蛋白TwNES酶活性最高。

4、酶促动力学分析

对重组蛋白TwNES进行酶促动力学分析。

酶促反应总体系为1mL，是将20μg重组蛋白TwNES、25μM底物法尼基焦磷酸(FPP)和酶促缓冲液(50mM HEPES,10mM MgCl₂,200Mm KCl,5mM DTT,10％甘油,pH 7.5)混匀得到的体系，并将该体系以400μL正己烷覆盖液封，然后在30℃放置10分钟后用正己烷萃取3次，合并正己烷层并用氮气吹干待用，三个重复实验。

GC-MS分析结果如图4所示，TwNES纯化蛋白(重组蛋白TwNES)的米氏常数K_m为12.700±1.900μM，最大反应速度V_max为3.496±0.104nkat/mg，催化常数K_cat为0.371±0.011/s，表观二级速度常数K_cat/K_m为0.029±0.006(s^-1/μM)。

序列表

<110>首都医科大学

<120>雷公藤倍半萜合酶TwNES及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>1891bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tcattttcac aaacacacac acattacaca gtgttgataa ttgtttccaa tatatccatc 60

tcccatggcc ttctttggtt cctctcgctc ctcaatcatt cccttgaaaa ccatttcaca 120

aatagtcaca gctgatagta ctaacaagcg gggcactgtt gacagcaatc acaaatcggc 180

tcctactact cctttgaatg accgaatttg caccgagcac gcgcacaagg tgaaagattt 240

taagcagata atcaatatcg cgggagaaga tccatcggaa ggtttggcca taattgatgc 300

cgtccaacgc cttggtgttg accaccattt ccaggatgag attcatacaa ttcttcaaaa 360

gcactacaca ctagctactg gtactactac tcatggcgat tgtatgatca cttcacttcg 420

atttcgactt ttgagacaag aaggttacta tgtttctgca gatgttttcg agggattgaa 480

ggacgaggaa gggaaatttg accaaaatct aagtggagac ataaagggac taatggcttt 540

atatgaagct tcacagctca gtatggaagg agaaaacata ctcgacgagg ccagagacta 600

tagttctcga ctccttaatg aatgtgttac acaacttgat catgaccaag caagaattgt 660

tgaacacaca ttgactcatc cccaccacaa aagcttggcg aggtttatgg ctaagaattt 720

cttaagagat ttccatggca caaatggttg gatagacgat ttgaagaaac tagctaaggt 780

cgattttgac atggcacagt ctacatacca aaaagaggtg gtgcaaattt cacaatggtg 840

gaaagagcta ggtctggctg aggagttgaa gtttgcaaga gatcaaccag tcaaatggta 900

catttggacc acgacatgcc accaagatcc aagcttctct gagcttagga ttaatctcac 960

aaaacccatt tcctttgttt acttaattga cgacatattt gatgtttatg ggaccccgca 1020

agaagttaca gactttacag aagctgtcga tagatgggat catgatgcta ttgatcaact 1080

accctactac atgaagatat gtttcaaggc tctggatgat atcaccaatg aaattagcta 1140

taaagtttac aaacagcatg gttggaatcc attagattct ttacgaaaat cgtgggggag 1200

attgtgcaat gcatttttaa cagaagcaca atggtttgct tctgggcatc ttccaaaggc 1260

tgaagagtac ctggaaaatg ggattataag ttcaggggtg cctgtggtgc tacttcacct 1320

tttctttctt ttaggtgaag gggtgaccca aaaaagtgtg gaaatgattg acaacactcc 1380

ggccattgta tccgccgctg cggcaattct acgactctgg gatgacttgg gaagtgccaa 1440

ggatgaggat caagatggta aggatggatc ttacctagct tgttatacga atgaaaaccc 1500

agggtgttca ttggaagatg cagaaaaaca tgtgaagagc aagatttgtg atgaatggaa 1560

gcagctcaac aaggaatgcc tctctcagaa gaatccgttt tctccgagtt tcctcaaggc 1620

ttgtcttaat gtttccagga tggttccatt gatgtacgag tacgatgaga atcgacgtct 1680

tccgagactt gaagagttcc ttaaatccat cctgattaag taatattgca tttgtaattt 1740

atatatgtaa tttatatatg tgtaatttat atattgcatg tgtaatttat atgtgtaatt 1800

tcttagttat tcaaagttga tggcagtgtg tattacgtgc gcgtatgctc gtataaattt 1860

aaataaactc tgtttttcta atgagtttaa a 1891

<210>2

<211>552

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Ala Phe Phe Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ile Ile Pro Leu Lys Thr

1 5 10 15

Ile Ser Gln Ile Val Thr Ala Asp Ser Thr Asn Lys Arg Gly Thr Val

20 25 30

Asp Ser Asn His Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Leu Asn Asp Arg Ile

35 40 45

Cys Thr Glu His Ala His Lys Val Lys Asp Phe Lys Gln Ile Ile Asn

50 55 60

Ile Ala Gly Glu Asp Pro Ser Glu Gly Leu Ala Ile Ile Asp Ala Val

65 70 75 80

Gln Arg Leu Gly Val Asp His His Phe Gln Asp Glu Ile His Thr Ile

85 90 95

Leu Gln Lys His Tyr Thr Leu Ala Thr Gly Thr Thr Thr His Gly Asp

100 105 110

Cys Met Ile Thr Ser Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln Glu Gly Tyr

115 120 125

Tyr Val Ser Ala Asp Val Phe Glu Gly Leu Lys Asp Glu Glu Gly Lys

130 135 140

Phe Asp Gln Asn Leu Ser Gly Asp Ile Lys Gly Leu Met Ala Leu Tyr

145 150 155 160

Glu Ala Ser Gln Leu Ser Met Glu Gly Glu Asn Ile Leu Asp Glu Ala

165 170 175

Arg Asp Tyr Ser Ser Arg Leu Leu Asn Glu Cys Val Thr Gln Leu Asp

180 185 190

His Asp Gln Ala Arg Ile Val Glu His Thr Leu Thr His Pro His His

195 200 205

Lys Ser Leu Ala Arg Phe Met Ala Lys Asn Phe Leu Arg Asp Phe His

210 215 220

Gly Thr Asn Gly Trp Ile Asp Asp Leu Lys Lys Leu Ala Lys Val Asp

225 230 235 240

Phe Asp Met Ala Gln Ser Thr Tyr Gln Lys Glu Val Val Gln Ile Ser

245 250 255

Gln Trp Trp Lys Glu Leu Gly Leu Ala Glu Glu Leu Lys Phe Ala Arg

260 265 270

Asp Gln Pro Val Lys Trp Tyr Ile Trp Thr Thr Thr Cys His Gln Asp

275 280 285

Pro Ser Phe Ser Glu Leu Arg Ile Asn Leu Thr Lys Pro Ile Ser Phe

290 295 300

Val Tyr Leu Ile Asp Asp Ile Phe Asp Val Tyr Gly Thr Pro Gln Glu

305 310 315 320

Val Thr Asp Phe Thr Glu Ala Val Asp Arg Trp Asp His Asp Ala Ile

325 330 335

Asp Gln Leu Pro Tyr Tyr Met Lys Ile Cys Phe Lys Ala Leu Asp Asp

340 345 350

Ile Thr Asn Glu Ile Ser Tyr Lys Val Tyr Lys Gln His Gly Trp Asn

355 360 365

Pro Leu Asp Ser Leu Arg Lys Ser Trp Gly Arg Leu Cys Asn Ala Phe

370 375 380

Leu Thr Glu Ala Gln Trp Phe Ala Ser Gly His Leu Pro Lys Ala Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Leu Glu Asn Gly Ile Ile Ser Ser Gly Val Pro Val Val Leu

405 410 415

Leu His Leu Phe Phe Leu Leu Gly Glu Gly Val Thr Gln Lys Ser Val

420 425 430

Glu Met Ile Asp Asn Thr Pro Ala Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ile

435 440 445

Leu Arg Leu Trp Asp Asp Leu Gly Ser Ala Lys Asp Glu Asp Gln Asp

450 455 460

Gly Lys Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Cys Tyr Thr Asn Glu Asn Pro Gly

465 470 475 480

Cys Ser Leu Glu Asp Ala Glu Lys His Val Lys Ser Lys Ile Cys Asp

485 490 495

Glu Trp Lys Gln Leu Asn Lys Glu Cys Leu Ser Gln Lys Asn Pro Phe

500 505 510

Ser Pro Ser Phe Leu Lys Ala Cys Leu Asn Val Ser Arg Met Val Pro

515 520 525

Leu Met Tyr Glu Tyr Asp Glu Asn Arg Arg Leu Pro Arg Leu Glu Glu

530 535 540

Phe Leu Lys Ser Ile Leu Ile Lys

545 550

Claims

1.蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1第65-1723位所示的cDNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.权利要求1所述的蛋白质在作为倍半萜合酶中的应用。

5.权利要求2或3所述的生物材料在制备倍半萜合酶中的应用。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在如下1)-3)中任一种中的应用：

1)制备或合成萜类化合物；

2)催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸形成香叶基芳樟醇；

3)催化法尼基焦磷酸形成橙花叔醇。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述萜类化合物为二萜类化合物和/或倍半萜类化合物；

和/或，所述二萜类化合物为香叶基芳樟醇，所述倍半萜类化合物为橙花叔醇。

8.一种萜类化合物的合成方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的蛋白质、底物和酶促缓冲液混匀，反应，得到萜类化合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述酶促缓冲液包括MgCl₂；

所述MgCl₂在所述酶促缓冲液中的浓度为10mM。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述底物为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸或法尼基焦磷酸；

和/或，所述萜类化合物为二萜类化合物和/或倍半萜类化合物；