CN112941063A

CN112941063A - 一种α-檀香烯合成酶、基因及应用

Info

Publication number: CN112941063A
Application number: CN202110436261.8A
Authority: CN
Inventors: 谢恬; 殷晓浦; 谌容; 卫秋慧; 刘雨恒; 魏昕
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN112941063B

Abstract

本发明公开了一种α‑檀香烯合成酶、基因及应用。所述α‑檀香烯合成酶来源于温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明对温郁金来源的α‑檀香烯合成酶进行功能验证并在大肠杆菌中进行α‑檀香烯合成方法的发明与应用。发现温郁金来源的α‑檀香烯合成酶可在原核表达体系中催化FPP生成大量的α‑檀香烯、以及少量的β‑檀香烯和α‑法尼烯，根据峰面积计算α‑檀香烯的含量达到了90％以上，从而在大肠杆菌中快速，大量地制备所述的催化剂，并应用于α‑檀香烯的合成，进一步可应用于α‑檀香醇的合成，具有重要的意义。

Description

一种α-檀香烯合成酶、基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种α-檀香烯合成酶、基因及应用。

背景技术

α-檀香烯(α-santalene)，结构式如下式Ⅰ所示，是从檀香树中提取的倍半萜类挥发性成分，可在细胞色素氧化酶P450的催化下生成α-檀香醇，α-檀香烯和α-檀香醇是檀香精油的主要成分。檀香精油毒性低、无致突变性，是目前公认安全的食品添加剂；檀香精油不仅用于香料和化妆品，还具有镇静安神、抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤作用，对皮肤疾病、支气管炎、黏膜炎、抑郁失眠等具有一定的疗效。虽然檀香精油具有很重要的作用，市场价值也在不断扩大，但是檀香精油主要是通过水蒸汽蒸馏从天然植物檀香的心材和根中提取分离，导致檀香树木被过度砍伐，生态环境遭到严重的破坏；进一步也导致檀香精油产量下降，价格上涨，同时檀香树生长条件苛刻，生长周期长，精油含量很低且受到种植环境等诸多因素影响；提取精油需要多步的分离纯化，工艺复杂要求高难度大。

采用酶催化方法进行α-檀香烯的生物合成具有一定的优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要前体是优质的生物催化剂的获得。目前关于檀香烯合成酶的研究较少，例如从檀香植物Santalum album、S.austrocaledonicum和S.spicatum中分别克隆到檀香烯合成酶，但是其产物专一性不高，除了生成α/β-santalene外，还有其异构体epi-β-santalene、bergamotene等产物。因此，研究优质的α-檀香烯合成酶基因的克隆、表达，有助于α-檀香烯的生物合成，同时也能进一步利用代谢工程或者生物合成相关技术进行α-檀香烯以及α-檀香醇的细胞工厂生产，本发明具有重要的意义。

发明内容

本发明经研究发现了一种来源于植物温郁金的α-檀香烯合成酶，能够使用大肠杆菌基因工程菌进行大量表达，且该酶具有很好的催化合成α-檀香烯的效果。

温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)为姜科植物，主产于浙江瑞安，由于温郁金具有鲜明的地域特性和较高的药用价值，因而被列为“浙八味”之一。温郁金药材表面呈棕褐色，又称“黑郁金”。

本发明首先提供了一种α-檀香烯合成酶，来源于温郁金(Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明又提供了所述α-檀香烯合成酶在制备α-檀香烯中的应用。

本发明又提供了编码所述α-檀香烯合成酶的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明又提供了一种包含所述基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体，使用pET28a载体作为骨架。

本发明又提供了一种包含所述重组表达载体的基因工程菌。优选的，所述的基因工程菌，使用的宿主细胞为大肠杆菌。作为宿主细胞的大肠杆菌菌株可以选用E.Coil BL21codon plus。

本发明还提供了一种制备α-檀香烯的方法，使用所述α-檀香烯合成酶作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇、MgCl₂和1,2,3-丙三醇的作用下催化合成α-檀香烯。优选的，初始催化反应体系中催化剂的用量为1.0μg/mL，底物浓度为2μg/mL，二硫苏糖醇和MgCl₂的浓度分别为1mM和10mM，1,2,3-丙三醇体积浓度为10％。

本发明具有以下有益效果：

本发明对温郁金来源的α-檀香烯合成酶进行功能验证并在大肠杆菌中进行α-檀香烯合成方法的发明与应用。发现温郁金来源的α-檀香烯合成酶可在原核表达体系中催化FPP生成大量的α-檀香烯、以及少量的β-檀香烯和α-法尼烯，根据峰面积计算α-檀香烯的含量达到了90％以上，从而在大肠杆菌中快速，大量地制备所述的催化剂，并应用于α-檀香烯的合成，进一步可应用于α-檀香醇的合成，具有重要的意义。

附图说明

图1为CwSS与其他物种来源的α-檀香烯合成酶的氨基酸序列比对图。

图2为CwSS与其他物种来源的倍半萜合酶构建的系统进化树，其中，CcSS：Cinnamomum camphora SS；ClSS：Clausena lansium SS；CzGBS：Curcuma zedoariagermacrene B synthase；ZzES：Zingiber zerumbet eudesmol synthase；SpSS：Santalumspicatum SS。

图3为SDS-PAGE分析重组CwSS工程菌经IPTG诱导表达结果(泳道M：marker；泳道1：诱导后上清部分；泳道2：诱导后沉淀部分)。

图4为CwSS催化反应产物的GC-MS图。a:GC-MS全色谱图；b：局部放大的色谱图；c：出峰时间为16.10min的产物峰的质谱图；d：标准品α-檀香烯的质谱图。

具体实施方式

实施例1：温郁金来源的α-檀香烯合成酶、基因、载体、工程菌的制备

1、候选的CwSS基因的同源性分析

收集温州瑞安飞云江两岸的温郁金块根、嫩叶、芽和茎组织，由上海美吉生物技术公司进行转录组测序，获得的序列进行生物信息学分析发现一条候选的倍半萜合酶基因(即本申请α-檀香烯合成酶，CwSS)，其推测的氨基酸序列在NCBI进行Blastp分析发现，与姜科植物Zingiber officinale来源的红没药烯合成酶(Accession Number：D2YZP9)具有最大的同源性，序列一致性达到86％；进一步与其他来源的倍半萜烯合成酶进行序列比对，结果显示CwSS具有保守的结构域，例如DDxxD，RXR，NSE/DTE，RRX₈W(图1)。

对CwSS和其他植物来源的倍半萜合酶进行系统进化树分析，发现其聚类到了TPS-a亚家族，该亚家族均来源于被子植物倍半萜合酶(图2)。生物信息学分析推测改基因序列可能为倍半萜合酶，因此，进一步进行功能分析。

2、CwSS基因全长的克隆

采用RNA Easy Fast植物组织RNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取温郁金块根、嫩叶、芽和茎混合组织的RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒(宝生物工程有限公司)进行反转录获得cDNA。根据候选的CwSS基因序列，设计一对引物(上游引物：5’-ATGGGGCTTGGCCAGACTCCGT-3’；下游引物：5’-TCAAACAGGAACAGGATGAAC-3’)，以cDNA为模板进行高保真PCR反应，PCR反应体系：10*PCR buffer 5μL，上下游引物(10μM)各1μL，cDNA 1μL，高保真taq酶，0.5μL，加水补齐50μL。PCR反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；最后70℃延伸10min。待PCR反应结束后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，进行TA亚克隆(宝生物工程有限公司)。在50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上进行阳性克隆筛选，如上采用PCR筛选阳性克隆，将阳性克隆送上海捷瑞生物技术公司测序验证，成功获得SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因CwSS，该基因编码的酶CwSS氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

含目的基因CwSS的重组载体及工程菌的构建：根据CwSS基因编码序列(SEQ IDNO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(上游为NdeI，下游为XhoI)，具体地说，上游引物为：5’-CATATGGGGCTTGGCCAGACTCCGT-3’，下游引物为：5’-CTCGAGTCAAACAGGAACAGGATGAAC-3’。PCR反应体系：10*PCR buffer 5μL，上下游引物(10μM)各1μL，cDNA1μL，高保真taq酶，0.5μL，加水补齐50μL。PCR反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃y延伸2min，30个循环；最后70℃延伸10min。经PCR扩增后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。同时，提取pET28a重组质粒，进行NdeI和XhoI(NEB北京公司)双酶切，采用DNA产物纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物，DNA连接酶(NEB北京公司)进行过夜连夜，再将连接产物CwSS-pET28a采用热激法转入E.Coil BL21 codon plus感受态细胞中，在50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上进行阳性克隆筛选，获得工程菌E.Coil BL21 codon plus/pET 28a/CwSS。

3、CwSS蛋白的诱导表达与纯化

将第2步中获得的工程菌E.Coil BL21 codon plus/pET 28a/CwSS在含100mL 50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入IPTG终浓度为0.5mM，28℃诱导16h后，离心收集菌体，5g湿菌体用25ml、pH7.4磷酸缓冲液重悬，超声破碎细胞。离心取上清，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，根据产品说明书，将滤液进行镍柱(Qiagen，德国)亲和层析纯化获得带His-Tag的CwSS重组酶液，电泳图见图3所示。结果表达CwSS在大肠杆菌中以可溶的形式表达。

实施例2：重组酶CwSS的催化性质分析

以实施例1方法制备的CwSS重组酶液(浓度为50mg/L，体积为10μL)为催化剂，加入pH 7.0Tris-HCl缓冲液、2μg FPP(法尼基焦磷酸)、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油(1,2,3-丙三醇)构成反应体系1ml，分别在30℃下搅拌充分反应120min，同时采用顶空-固相微萃取技术吸附反应产物，待反应结束后，将萃取头取出注入气相色谱仪，对产物进行定性分析。色谱条件：选用GC-2010岛津气相色谱仪；色谱柱为HP-5；载气：N₂，吹扫流量为3mL/min，无分流；柱箱起始温度40℃，保留2分钟，然后以7℃/min的速度升温至220℃，保留5分钟；进样口温度为250℃；检测器温度为250℃。质谱数据以45-500全扫描模式收集。比对NIST数据库分析产物：在16.10min出现了最大的主产物峰α-檀香烯，16.29min和16.66min出现了极小的β-檀香烯和α-法尼烯，根据峰面积计算，α-檀香烯占90.97％(如图4所示)。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种α-檀香烯合成酶、基因及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggcttg gccagactcc gtcagtcgag gttttggaag acgttgttgt tgatcgtcag 60

ttggcaggtt tcgatcccag cttttggggt gactacttta ttacaaatca gaaatcacag 120

tctgaggcat ggatgaacga aagagctgaa gagctcaaga atgaagtaag gagcatgttc 180

caaaatgtta ctggcgttct acaaactatg aatctaattg atacacttca acttcttgga 240

cttgattacc attttatgga ggaaatagac agaggtttag accatctcaa ggattttgac 300

atgagcaaat atgggctcta tgaggttgct cttcattttc gactgcttag acaaaaagga 360

ttcaatattt cttcagatgt atttaaaaag tacaaggata aagagggaaa attttttgaa 420

gaactaaaag atgatgctaa ggggctccta agtttatata acgcagctta ccttggaact 480

aaaaaagaga ctatactcga tgaagccatt tctttcacta aagataatct tacatctttg 540

ttaaaagatc taaatcctac atttgcaaag ctagtgtctc tcgctctcaa gacacctatt 600

caacgaagca tgaaacgact tttcaccaga tgctacatct ctatctacca agatgaacag 660

acccgaaatg aatcaatact tgagcttgca aaattggact tcaacatatt acaatgtctc 720

caccaggagg agctcaagaa agtatgcacg tggtggaaga atttgaattt agacattatg 780

catctaaatt ttgttcgaga acgagtggtg gaatcttact gttggttgat ggtgacacgt 840

catgaaccca gttgttctcg tgctcgaatg ttcgcaacta agctacttat gttaattact 900

gtcttggatg acacctatga tagctacagc acactagaag agagtcgact acttacagat 960

gcaatccaaa ggtggagccc taatgtagta gatcaactac cagaatactt aagggatttc 1020

tttctcaaaa tgttgagcac ttttcaggaa tttgaaaatg aacttgcacc ggaggagaag 1080

tttcgaatat tgtacctcaa ggaagaatgg aaaattcaag ctgaagctta ttttaaggaa 1140

tgcaaatgga gggatgacga gtatgtgccc aagttagaag agcacatgcg tgtttcaatc 1200

ataagtgttg gatttatctt ggtttcctgc gtatttttga gtggcatgga ggaggcagtg 1260

gccacaaagg atgcatttga atggttcaaa agctctccaa agatcgcaga agcttgtgga 1320

acaattggtc gtatcacaaa tgacataact tcaaaggagc gagaacaaaa gagggtacat 1380

gttgcctcaa caatagattg ctatatgaag gaacatggaa catcagagga tgttgcacgt 1440

gagaagctcc taggctttgt tgaagatgca tggaagacta tcaacgagga gctccttatt 1500

gcaactggat tgtctaggga agtagttgaa ctatttctcc attctacacg aactacagaa 1560

tttatataca agcatggtga tgcattcaca gaacctaaca cctcgatgaa ggaaatcatc 1620

ttttttctac ttgttcatcc tgttcctgtt tga 1653

<210> 2

<211> 550

<212> PRT

<213> 温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)

<400> 2

Met Gly Leu Gly Gln Thr Pro Ser Val Glu Val Leu Glu Asp Val Val

1 5 10 15

Val Asp Arg Gln Leu Ala Gly Phe Asp Pro Ser Phe Trp Gly Asp Tyr

20 25 30

Phe Ile Thr Asn Gln Lys Ser Gln Ser Glu Ala Trp Met Asn Glu Arg

35 40 45

Ala Glu Glu Leu Lys Asn Glu Val Arg Ser Met Phe Gln Asn Val Thr

50 55 60

Gly Val Leu Gln Thr Met Asn Leu Ile Asp Thr Leu Gln Leu Leu Gly

65 70 75 80

Leu Asp Tyr His Phe Met Glu Glu Ile Asp Arg Gly Leu Asp His Leu

85 90 95

Lys Asp Phe Asp Met Ser Lys Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Ala Leu His

100 105 110

Phe Arg Leu Leu Arg Gln Lys Gly Phe Asn Ile Ser Ser Asp Val Phe

115 120 125

Lys Lys Tyr Lys Asp Lys Glu Gly Lys Phe Phe Glu Glu Leu Lys Asp

130 135 140

Asp Ala Lys Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Asn Ala Ala Tyr Leu Gly Thr

145 150 155 160

Lys Lys Glu Thr Ile Leu Asp Glu Ala Ile Ser Phe Thr Lys Asp Asn

165 170 175

Leu Thr Ser Leu Leu Lys Asp Leu Asn Pro Thr Phe Ala Lys Leu Val

180 185 190

Ser Leu Ala Leu Lys Thr Pro Ile Gln Arg Ser Met Lys Arg Leu Phe

195 200 205

Thr Arg Cys Tyr Ile Ser Ile Tyr Gln Asp Glu Gln Thr Arg Asn Glu

210 215 220

Ser Ile Leu Glu Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile Leu Gln Cys Leu

225 230 235 240

His Gln Glu Glu Leu Lys Lys Val Cys Thr Trp Trp Lys Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Asp Ile Met His Leu Asn Phe Val Arg Glu Arg Val Val Glu Ser

260 265 270

Tyr Cys Trp Leu Met Val Thr Arg His Glu Pro Ser Cys Ser Arg Ala

275 280 285

Arg Met Phe Ala Thr Lys Leu Leu Met Leu Ile Thr Val Leu Asp Asp

290 295 300

Thr Tyr Asp Ser Tyr Ser Thr Leu Glu Glu Ser Arg Leu Leu Thr Asp

305 310 315 320

Ala Ile Gln Arg Trp Ser Pro Asn Val Val Asp Gln Leu Pro Glu Tyr

325 330 335

Leu Arg Asp Phe Phe Leu Lys Met Leu Ser Thr Phe Gln Glu Phe Glu

340 345 350

Asn Glu Leu Ala Pro Glu Glu Lys Phe Arg Ile Leu Tyr Leu Lys Glu

355 360 365

Glu Trp Lys Ile Gln Ala Glu Ala Tyr Phe Lys Glu Cys Lys Trp Arg

370 375 380

Asp Asp Glu Tyr Val Pro Lys Leu Glu Glu His Met Arg Val Ser Ile

385 390 395 400

Ile Ser Val Gly Phe Ile Leu Val Ser Cys Val Phe Leu Ser Gly Met

405 410 415

Glu Glu Ala Val Ala Thr Lys Asp Ala Phe Glu Trp Phe Lys Ser Ser

420 425 430

Pro Lys Ile Ala Glu Ala Cys Gly Thr Ile Gly Arg Ile Thr Asn Asp

435 440 445

Ile Thr Ser Lys Glu Arg Glu Gln Lys Arg Val His Val Ala Ser Thr

450 455 460

Ile Asp Cys Tyr Met Lys Glu His Gly Thr Ser Glu Asp Val Ala Arg

465 470 475 480

Glu Lys Leu Leu Gly Phe Val Glu Asp Ala Trp Lys Thr Ile Asn Glu

485 490 495

Glu Leu Leu Ile Ala Thr Gly Leu Ser Arg Glu Val Val Glu Leu Phe

500 505 510

Leu His Ser Thr Arg Thr Thr Glu Phe Ile Tyr Lys His Gly Asp Ala

515 520 525

Phe Thr Glu Pro Asn Thr Ser Met Lys Glu Ile Ile Phe Phe Leu Leu

530 535 540

Val His Pro Val Pro Val

545 550

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggggcttg gccagactcc gt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaaacagga acaggatgaa c 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catatggggc ttggccagac tccgt 25

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgagtcaa acaggaacag gatgaac 27

Claims

1.一种α-檀香烯合成酶，其特征在于，来源于温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen etC.Ling)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述α-檀香烯合成酶在制备α-檀香烯中的应用。

3.编码权利要求1所述α-檀香烯合成酶的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种包含如权利要求3或4所述基因的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，使用pET28a载体作为骨架。

7.一种包含权利要求6所述重组表达载体的基因工程菌。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，使用的宿主细胞为大肠杆菌。

9.一种制备α-檀香烯的方法，其特征在于，使用权利要求1所述α-檀香烯合成酶作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇、MgCl₂和1,2,3-丙三醇的作用下催化合成α-檀香烯。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，初始催化反应体系中催化剂的用量为1.0μg/mL，底物浓度为2μg/mL，二硫苏糖醇和MgCl₂的浓度分别为1mM和10mM，1,2,3-丙三醇体积浓度为10％。