CN112921024B

CN112921024B - 一种α-愈创木烯合成酶、基因及应用

Info

Publication number: CN112921024B
Application number: CN202110436257.1A
Authority: CN
Inventors: 谢恬; 谌容; 殷晓浦; 刘雨恒; 魏昕
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2021-04-22
Filing date: 2021-04-22
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2041-04-22
Also published as: CN112921024A

Abstract

本发明公开了一种α‑愈创木烯合成酶、基因及应用。所述α‑愈创木烯合成酶来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明对蓝细菌来源的α‑愈创木烯合成酶进行功能验证并在大肠杆菌中进行α‑愈创木烯合成方法的发明与应用。发现蓝细菌α‑愈创木烯合成酶可在原核表达体系中催化FPP生成大量的α‑愈创木烯、以及少量的β‑榄香烯和α‑布藜烯，根据峰面积计算α‑愈创木烯的含量达到了79.5％，是目前报道的最大的产物比，从而在大肠杆菌中快速，大量地制备所述的催化剂，并应用于α‑愈创木烯的合成，进一步可应用于莎草奥酮的合成，具有重要的意义。

Description

一种α-愈创木烯合成酶、基因及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种α-愈创木烯合成酶、基因及应用。

背景技术

α-愈创木烯(α-Guaiene)，CAS号：3691-12-1；分子式：C15H24；分子量：204.35100，结构式如式Ⅰ所示，可通过空气氧化，活性氧或者酶催化其C3位氧化生成莎草奥酮，后者具有强烈的辛辣胡椒籽香气和木香气味，在某些葡萄酒中能检测到。由于其在水中的香气检测阈值为8ng/L，是迄今为止发现的所有天然产物中最低的，具有巨大的应用前景。

但是，目前莎草奥酮未在香料和香精工业中应用，可能是由于目前没有有效的生产途径。

采用酶催化方法进行α-愈创木烯的生物合成具有一定的优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要前体是优质的生物催化剂的获得。

目前，关于α-愈创木烯合成酶的研究较少，如从葡萄Vitis vinifera中克隆的α-愈创木烯合成酶的催化产物有α-愈创木烯(占44％)和α-丁烯(35％)；而狼毒Stellerachamaejasme来源的α-愈创木烯合成酶TPS1能催化FPP(法尼基焦磷酸)生成少量的α-愈创木烯以及大量的guai-1(10)-en-12-ol，因此，这些报道的α-愈创木烯合成酶产物专一性不高。

分离并鉴定优质的α-愈创木烯合成酶基因，有助于α-愈创木烯的生物合成，同时也能进一步利用代谢工程或者生物合成相关技术进行α-愈创木烯以及莎草奥酮的细胞工厂生产，本发明具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，经研究发现了一种α-愈创木烯合成酶。

一种α-愈创木烯合成酶，来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

本发明又提供了所述α-愈创木烯合成酶在制备α-愈创木烯中的应用。

本发明又提供了编码所述α-愈创木烯合成酶的基因。优选的，所述的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明又提供了一种包含所述基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体，使用pET28a载体作为骨架。

本发明又提供了一种包含所述重组表达载体的基因工程菌。优选的，所述的基因工程菌，使用的宿主细胞为大肠杆菌。比如，常用的大肠杆菌表达菌株E.Coil BL21 codonplus。

本发明还提供了一种制备α-愈创木烯的方法，使用所述α-愈创木烯合成酶作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇、MgCl₂和1,2,3-丙三醇的作用下催化合成α-愈创木烯。

优选的，初始催化反应体系中催化剂的用量为1.0μg/mL，底物浓度为2μg/mL，二硫苏糖醇和MgCl₂的浓度分别为1mM和10mM，1,2,3-丙三醇体积浓度为10％。

反应pH可以是7.0，反应温度可以是在37℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明对蓝细菌来源的α-愈创木烯合成酶进行功能验证并在大肠杆菌中进行α-愈创木烯合成方法的发明与应用。发现蓝细菌α-愈创木烯合成酶可在原核表达体系中催化FPP生成大量的α-愈创木烯、以及少量的β-榄香烯和α-布藜烯，根据峰面积计算α-愈创木烯的含量达到了79.5％，是目前报道的最大的产物比，从而在大肠杆菌中快速，大量地制备所述的催化剂，并应用于α-愈创木烯的合成，进一步可应用于莎草奥酮的合成，具有重要的意义。

附图说明

图1为CbGS的保守结构域分析。

图2为CbGS与其他物种来源的α-愈创木烯合成酶的氨基酸序列比对图。ScGOS：Streptomyces citricolor Germacradien-4-ol synthase；SePS：Streptomycesexfoliatus Pentalenene Synthase。红色星号表示保守的DDXXD和NSE/DTE结构域。

图3为SDS-PAGE分析重组CbGS工程菌经IPTG诱导表达结果(泳道M：marker；泳道1，诱导前；泳道2，诱导后；泳道3，诱导后上清部分；泳道4，诱导后沉淀部分)。

图4为CbGS催化反应产物的GC-MS图。a：GC-MS色谱图；b：出峰时间为16.25min的产物峰的质谱图；c：标准品α-愈创木烯的质谱图。

具体实施方式

实施例1：蓝细菌来源的α-愈创木烯合成酶、编码基因、重组载体、工程菌的制备

1、候选的CbGS基因的同源性分析：

根据NCBI GenBank中报道的蓝细菌基因组(NC_003272REGION:5586089..5587057)核苷酸序列信息，以及推测的氨基酸序列，在NCBI进行Blastp分析发现，与多种微生物来源的萜类合酶同源性较高，进一步对保守结构域CDD分析发现，上述NC_003272基因组的REGION:5586089..5587057序列编码的蛋白酶属于非植物来源的萜类环化酶大家族class 1，具有保守的底物结合口袋以及保守的Mg²⁺结合位点DDxxD和NSE/DTEmotif(图1)。序列比对结果如图2所示。

2、CbGS基因全长的克隆：

根据NC_003272REGION:5586089..5587057的核苷酸序列，以大肠杆菌密码子偏好性进行序列密码子优化，并委托北京擎科生物技术有限公司进行基因全合成，获得SEQ IDNO.1所示核苷酸序列，命名为CbGS基因，该基因编码的酶CbGS氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

含目的基因的表达载体的构建，根据CbGS基因编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(上游为NdeI，下游为XhoI)，具体地说，上游引物为：5’-CATATGGAAAAAATTACCTTTCCG-3’，下游引物为：5’-CTCGAGGCTTGCCATCAGTTCCAG-3’。PCR反应体系：10*PCR buffer 5μL，上下游引物(10μM)各1μL，cDNA 1μL，高保真taq酶，0.5μL，加水补齐50μL。PCR反应参数为：首先95℃变性5min；其次，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；最后70℃延伸10min。经PCR扩增后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带。同时，提取pET28a重组质粒，进行NdeI和XhoI(NEB北京公司)双酶切，采用DNA产物纯化回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收酶切产物，DNA连接酶(NEB北京公司)进行过夜连接，获得CbGS基因克隆到质粒pET28a中的重组质粒，命名为CbGS-pET28a，再将连接产物CbGS-pET28a采用热激法转入E.Coil BL21 codon plus感受态细胞中，在50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上进行阳性克隆筛选，获得工程菌E.Coil BL21 codon plus/pET 28a/CbGS。

3、CbGS蛋白的诱导表达与纯化：

将第2步中获得的工程菌E.Coil BL21 codon plus/pET 28a/CbGS在含100mL 50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入IPTG终浓度为0.5mM，28℃诱导16h后，离心收集菌体，5g湿菌体用25ml、pH7.4磷酸缓冲液重悬，超声破碎细胞。离心取上清，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，根据产品说明书，将滤液进行镍柱(Qiagen，德国)亲和层析纯化获得携带His-Tag的CbGS重组酶液，电泳图见图3所示。结果表明重组CbGS在大肠杆菌中以可溶的形式表达。

实施例2：重组酶CbGS的催化性质分析

以实施例1方法制备的CbGS重组酶液(浓度为50mg/L，体积为10μL)为催化剂，加入pH 7.0Tris-HCl缓冲液、2μg FPP(法尼基焦磷酸)、500mM MgCl₂溶液20μL、500mM DTT 2μL、100μL稀甘油(1,2,3-丙三醇)构成反应体系1ml，分别在30℃下搅拌充分反应120min，同时采用顶空-固相微萃取技术吸附反应产物，待反应结束后，将萃取头取出注入气相色谱仪，对产物进行定性分析。色谱条件：选用GC-2010岛津气相色谱仪；色谱柱为HP-5；载气：N₂，吹扫流量为3mL/min，无分流；柱箱起始温度40℃，保留2分钟，然后以7℃/min的速度升温至220℃，保留5分钟；进样口温度为250℃；检测器温度为250℃。质谱数据以45-500全扫描模式收集。比对NIST数据库分析产物：在16.25min出现了最大的主产物峰α-愈创木烯，15.92min和16.72min出现了较小的β-榄香烯和αα-布藜烯，根据峰面积计算，α-愈创木烯占79.5％(图4)。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种α-愈创木烯合成酶、基因及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaaaaa ttacctttcc gaatctgtat tgtccgtttc cggaacgtaa aaatcagtat 60

tttgaagttc tgcaggatta tgcactgcag tgggttctgc gttttaaact gattgatagc 120

gaaagcctgt atcagcgttt tagcaaagca aaattttatc tgctgaccgc aggtgcatat 180

ccgcattgtc agctggaaga actgaaaatt gcaaatgatg ttattagctg gctgtttatt 240

tgggatgatc agtgtgatat tagcgatctg ggtaaaaaac cggaactgct gaaaatttgg 300

tgtaatcgtt ttctggaaat tctgaatggt gcagaactga ccgcagatga tctgccgctg 360

ggttttgcac tgcgtgatat tcgtaatcgt attattaatc gtggtagcat tacctttttt 420

catcattttg ttcgtaattt tgaagattat ttttatggtt gtattgaaga agcacataat 480

cgtgttaccg ttagcattcc ggatgttgaa gcatatatta aaattcgtag cgcaaatgca 540

gcagcagcac tgtgtctgaa tctgattgaa ttttgtgatc gtgttatgat tccgtatagc 600

ctgcgtaatc atgataccct gaataaactg acccagatga ccattaatat tctggcatgg 660

agcaatgata tttttagcgc accgcgtgaa attgcaaatg gtgaagttca taatctggtt 720

tttgttattc atcatcatca gaaaattccg ctggaaaaag caatgctggc agcagcagca 780

atgcataatc aggaagttga aaatctggtt aaactggaaa gccagattac ctattttagc 840

gcagaaattg atgcagaaat taccaaatat attagcggtc tgcatgcatg gattcgtggt 900

aatctggatt ggtatgcaca tagcggtcgt tatcagatta ccgaaaaact ggaactgatg 960

gcaagctaa 969

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 蓝细菌(Cyanobacteria)

<400> 2

Met Glu Lys Ile Thr Phe Pro Asn Leu Tyr Cys Pro Phe Pro Glu Arg

1 5 10 15

Lys Asn Gln Tyr Phe Glu Val Leu Gln Asp Tyr Ala Leu Gln Trp Val

20 25 30

Leu Arg Phe Lys Leu Ile Asp Ser Glu Ser Leu Tyr Gln Arg Phe Ser

35 40 45

Lys Ala Lys Phe Tyr Leu Leu Thr Ala Gly Ala Tyr Pro His Cys Gln

50 55 60

Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ala Asn Asp Val Ile Ser Trp Leu Phe Ile

65 70 75 80

Trp Asp Asp Gln Cys Asp Ile Ser Asp Leu Gly Lys Lys Pro Glu Leu

85 90 95

Leu Lys Ile Trp Cys Asn Arg Phe Leu Glu Ile Leu Asn Gly Ala Glu

100 105 110

Leu Thr Ala Asp Asp Leu Pro Leu Gly Phe Ala Leu Arg Asp Ile Arg

115 120 125

Asn Arg Ile Ile Asn Arg Gly Ser Ile Thr Phe Phe His His Phe Val

130 135 140

Arg Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Tyr Gly Cys Ile Glu Glu Ala His Asn

145 150 155 160

Arg Val Thr Val Ser Ile Pro Asp Val Glu Ala Tyr Ile Lys Ile Arg

165 170 175

Ser Ala Asn Ala Ala Ala Ala Leu Cys Leu Asn Leu Ile Glu Phe Cys

180 185 190

Asp Arg Val Met Ile Pro Tyr Ser Leu Arg Asn His Asp Thr Leu Asn

195 200 205

Lys Leu Thr Gln Met Thr Ile Asn Ile Leu Ala Trp Ser Asn Asp Ile

210 215 220

Phe Ser Ala Pro Arg Glu Ile Ala Asn Gly Glu Val His Asn Leu Val

225 230 235 240

Phe Val Ile His His His Gln Lys Ile Pro Leu Glu Lys Ala Met Leu

245 250 255

Ala Ala Ala Ala Met His Asn Gln Glu Val Glu Asn Leu Val Lys Leu

260 265 270

Glu Ser Gln Ile Thr Tyr Phe Ser Ala Glu Ile Asp Ala Glu Ile Thr

275 280 285

Lys Tyr Ile Ser Gly Leu His Ala Trp Ile Arg Gly Asn Leu Asp Trp

290 295 300

Tyr Ala His Ser Gly Arg Tyr Gln Ile Thr Glu Lys Leu Glu Leu Met

305 310 315 320

Ala Ser

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatggaaa aaattacctt tccg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgaggctt gccatcagtt ccag 24

Claims

1.α-愈创木烯合成酶在制备α-愈创木烯中的应用，所述α-愈创木烯合成酶来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种制备α-愈创木烯的方法，其特征在于，使用α-愈创木烯合成酶作为催化剂，以法尼基焦磷酸为底物，在二硫苏糖醇、MgCl₂和1,2,3-丙三醇的作用下催化合成α-愈创木烯，

所述α-愈创木烯合成酶来源于蓝细菌(Cyanobacteria)，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，初始催化反应体系中催化剂的用量为1.0μg/mL，底物浓度为2μg/mL，二硫苏糖醇和MgCl₂的浓度分别为1mM和10mM，1,2,3-丙三醇体积浓度为10％。