CN103409400A

CN103409400A - 一种β-榄香烯合成酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

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Publication number: CN103409400A
Application number: CN2013102805246A
Authority: CN
Inventors: 李海峰; 黄黎锋; 蓝袁洋; 高允允
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明提供了一种β-榄香烯合成酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的载体、工程菌及其应用。该β-榄香烯合成酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供了一种β-榄香烯合成酶及其编码基因，为生物酶法生产β-榄香烯提供了基础，将会提高β-榄香烯的产品质量、降低其生产成本、提高生产效率，为β-榄香烯的工业化生物合成提供技术前提。

Description

一种β-榄香烯合成酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种β-榄香烯合成酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。

（二）背景技术

β-榄香烯（β-elemene）属于不含氧的倍半烯烃类，是由温莪术挥发油中分离来的油状物单体，其化学名称是1-甲基-1-乙烯基-2，4-二异丙基环己烷，结构式如式1所示。β-榄香烯已经被证实对腺癌、人神经角质瘤、肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌等具有抗肿瘤活性，另外，有研究还表明β-榄香烯还具有镇痛及放射增敏作用。以β-榄香烯为主要成分的榄香烯乳1993年在我国开始普遍应用于恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其它浅表性肿瘤的临床治疗。

β-榄香烯的制备主要包括天然植物挥发油分离提取和化学合成两种方法。而目前商业用β-榄香烯主要通过传统水蒸汽蒸馏法和超临界CO₂萃取等方法从植物莪术挥发油中分离提取获得。这些分离方法投料多、耗时长、纯度低、得率低，不能完全适应市场的需求。相比植物提取方法获得的榄香烯是成分不单一的β-，γ-,δ-榄香烯的混合物的特点，化学合成可以针对特定的物质进行单一合成，国外有报道利用双不对称折叠和烯丙位约束的分子内酯烯醇烷基化的方法实现了榄香烯的立体选择性全合成，但该合成步骤繁琐、合成过程用到氰化钠等剧毒物质污染大，极大的限制了该方法用于商业生产β-榄香烯。

而生物酶法具有成本低，反应条件温和，环境污染小的优点，随着人们对绿色环保的追求，生物酶法越来越引起人们的重视。本发明的成果将会提高β-榄香烯的产品质量、降低其生产成本、提高生产效率，为β-榄香烯的工业化生物合成提供技术前提。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种β-榄香烯合成酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。本发明成果将有利于该药物在普通癌症患者中推广，并且将为我国的自主知识产权的抗肿瘤药物产业做出贡献。

本发明采用的技术方案是：

一种β-榄香烯合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：

1 MET Glu Lys Ile Thr Phe Pro Asn Leu Tyr Cys Pro Phe Pro Glu Arg Lys Asn Gln Tyr

21 Phe Glu Val Leu Gln Asp Tyr Ala Leu Gln Trp Val Leu Arg Phe Lys Leu Ile Asp Ser

41 Glu Ser Leu Tyr Gln Arg Phe Ser Lys Ala Lys Phe Tyr Leu Leu Thr Ala Gly Ala Tyr

61 Pro His Cys Gln Leu Glu Glu Leu Lys Ile Ala Asn Asp Val Ile Ser Trp Leu Phe Ile

81 Trp Asp Asp Gln Cys Asp Ile Ser Asp Leu Gly Lys Lys Pro Glu Leu Leu Lys Ile Trp

101 Cys Asn Arg Phe Leu Glu Ile Leu Asn Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asp Asp Leu Pro Leu

121 Gly Phe Ala Leu Arg Asp Ile Arg Asn Arg Ile Ile Asn Arg Gly Ser Ile Thr Phe Phe

141 His His Phe Val Arg Asn Phe Glu Asp Tyr Phe Tyr Gly Cys Ile Glu Glu Ala His Asn

161 Arg Val Thr Val Ser Ile Pro Asp Val Glu Ala Tyr Ile Lys Ile Arg Ser Ala Asn Ala

181 Ala Ala Ala Leu Cys Leu Asn Leu Ile Glu Phe Cys Asp Arg Val Met Ile Pro Tyr Ser

201 Leu Arg Asn His Asp Thr Leu Asn Lys Leu Thr Gln Met Thr Ile Asn Ile Leu Ala Trp

221 Ser Asn Asp Ile Phe Ser Ala Pro Arg Glu Ile Ala Asn Gly Glu Val His Asn Leu Val

241 Phe Val Ile His His His Gln Lys Ile Pro Leu Glu Lys Ala Met Leu Ala Ala Ala Ala

261 Met His Asn Gln Glu Val Glu Asn Leu Val Lys Leu Glu Ser Gln Ile Thr Tyr Phe Ser

281 Ala Glu Ile Asp Ala Glu Ile Thr Lys Tyr Ile Ser Gly Leu His Ala Trp Ile Arg Gly

301 Asn Leu Asp Trp Tyr Ala His Ser Gly Arg Tyr Gln Ile Thr Glu Lys Leu Glu Leu Met

321 Ala Ser

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的β-榄香烯合成酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：（Ⅰ）一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基（优选的是保守氨基酸残基）取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；（Ⅱ）一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；（Ⅲ）成熟蛋白与另一种化合物（比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合；（Ⅳ）附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列（如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列）。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还涉及所述β-榄香烯合成酶的编码基因。本发明的β-榄香烯合成酶基因来源于土壤宏基因组文库。

具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

1ATGGAAAAAA TTACTTTCCC AAATTTATAT TGCCCATTTC CAGAAAGGAA AAATCAGTAT

61TTTGAAGTTC TACAAGACTA TGCGCTTCAA TGGGTACTTC GCTTCAAGCT AATTGATAGT

121GAATCACTAT ACCAGCGTTT CTCAAAAGCA AAATTTTATT TACTCACAGC AGGTGCTTAT

181CCTCATTGTC AACTGGAAGA ATTAAAAATT GCTAATGATG TAATCAGCTG GTTATTCATT

241TGGGACGACC AATGTGACAT TTCAGACTTA GGGAAAAAAC CTGAACTACT GAAAATCTGG

301TGTAACAGAT TCCTAGAAAT ACTAAATGGA GCAGAACTTA CTGCCGATGA TCTGCCCCTT

361GGATTTGCAT TAAGAGATAT TAGAAACCGC ATAATTAACA GAGGAAGCAT AACATTCTTC

421CATCATTTTG TACGTAACTT TGAGGATTAT TTTTACGGAT GTATTGAAGA AGCTCATAAC

481CGTGTCACTG TATCAATTCC TGATGTTGAA GCTTATATCA AAATCCGTAG TGCAAACGCA

541GCTGCCGCTC TGTGTCTCAA TTTAATTGAA TTCTGTGACA GAGTAATGAT TCCTTATTCT

601TTAAGAAATC ATGATACTCT CAACAAATTA ACTCAAATGA CGATTAATAT TCTTGCCTGG

661TCGAATGATA TTTTCTCTGC TCCTAGAGAA ATAGCTAATG GTGAAGTGCA TAATTTAGTT

721TTTGTCATAC ATCATCATCA AAAAATTCCT TTAGAAAAAG CCATGTTAGC GGCTGCTGCA

781ATGCACAATC AAGAAGTTGA AAACCTTGTG AAATTAGAAT CACAAATTAC ATATTTTAGT

841GCAGAAATTG ATGCGGAGAT TACAAAGTAC ATATCTGGAT TACACGCATG GATACGTGGG

901AATCTAGATT GGTACGCTCA TTCAGGGCGC TATCAAATAA CAGAGAAACT AGAATTAATG

961 GCTTCTTGA

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70%以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸（至少具有50%同源性，优选具有70%同源性），也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：（1）在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1%SDS，60℃；或（2）杂交时加用变性剂，如50%（v/v）甲酰胺，0.1%小牛血清，0.1%Ficoll，42℃；或（3）仅在两条序列之间的同源性至少在95%以上，更好是97%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

编码本发明所述β-榄香烯合成酶的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：（1）用探针与基因或cDNA文库杂交以检出同源性的多核苷酸序列和（2）表达文库的活性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，该表达文库可以包括环境宏基因组文库。本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：（1）从基因组DNA分离双链DNA序列；（2）化学合成DNA序列以获得所述蛋白的双链DNA。

可用常规方法从这些cNDA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括（但不限于）：（1）DNA-DNA或DNA-RNA杂交；（2）标志基因功能的出现或丧失；（3）通过测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法双脱氧链终止法测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接全长的cDNA序列。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明中，编码β-榄香烯合成酶的所核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体还包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pcDNA3.1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选pET载体系列以其其它原核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码β-榄香烯合成酶的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA序列、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素等。

本发明中，编码β-榄香烯合成酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的本领域众所周知，可供选择的是用MgCl₂如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明还涉及所述基因在制备重组β-榄香烯合成酶中的应用。

本发明还涉及所述的β-榄香烯合成酶在微生物法制备β-榄香烯中的应用。β-榄香烯合成酶为胞内酶，将榄香烯酶基因转入细菌后，随着菌体的生长，酶的表达，即能不断的释放榄香烯到胞外，因此可用重组菌直接生产β-榄香烯，而无需添加其他底物。

通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的β-榄香烯合成酶。一般来说有以下步骤：

（1）用本发明的编码β-榄香烯合成酶的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；

（2）在合适的培养基中培养宿主细胞；

（3）从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤（2）中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞的条件下进行培养。当宿主细胞生长在适当的细胞密度后，用合适的方法诱导选择的启动子，浆细胞再培养一段时间。

在步骤（3）中，重组蛋白可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是轻而易举的。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种β-榄香烯合成酶及其编码基因，为生物酶法生产β-榄香烯提供了基础，将会提高β-榄香烯的产品质量、降低其生产成本、提高生产效率，为β-榄香烯的工业化生物合成提供技术前提。

（四）附图说明

图1为蛋白电泳图；图中箭头所指的即为表达的目的蛋白，M指低分子量marker（takara），标记1～4分别指菌株不加诱导剂破碎全细胞、诱导菌株破碎全细胞、诱导菌株破碎上清、诱导菌株破碎沉淀（包涵体）；

图2为β-榄香烯标准品GC-MS图（a）、重组菌产生的β-榄香烯GC-MS图（b）；

图3为不同载体时β-榄香烯的产量；

图4为不同诱导温度下β-榄香烯的产量；

图5为不同IPTG诱导浓度下β-榄香烯的产量。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

构建土壤基因组文库。随机挑取宏基因组文库菌株测序。通过文献查阅及序列分析确定β-榄香烯合成酶基因的开放式阅读框（ORF）核苷酸序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（可视选用的载体而定）。通过PCR技术获得SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列的β-榄香烯合成酶基因。PCR扩增程序95℃，预变性5min，32个循环（98℃变性10sec；58℃退火30sec；68℃延伸2min），16℃保持。将该基因与pET28a表达载体连接，再将其转入E.Coil BL21中得到重组菌株。

实施例2：

将得到的重组菌株转接到含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，用0.4mM IPTG，30℃过夜诱导，同时以不加诱导剂的菌株作为对照；取1.5ml培养液12000rpm离心1min，加入300μl的0.5mM pH7.5Tris-HCl缓冲液，超声破碎细胞，分别取100μl破碎样品全细胞、上清、沉淀加入20μl5×蛋白电泳Loading buffer，对照样品取100μl破碎全细胞加入20μl5×蛋白电泳Loading buffer，沸水浴煮沸5min；待样品冷却到室温后用15%的SDS-PAGE胶进行蛋白电泳检测蛋白表达情况，结果见图1。

由图1可见，β-榄香烯合成酶为胞内酶，主要存在于菌体包涵体中。

LB液体培养基配制：胰蛋白胨（购自Qxoid公司）10g，酵母提取物（购自Qxoid公司）5g，NaCl10g，蒸馏水补足至1L，121℃灭菌20min。

实施例3：

将重组菌株转接到100ml含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，待OD₆₀₀达到0.8时加入400μl的10mM IPTG并用封口膜将瓶口密封完全，置于30℃诱导16～20h，取培养液运用固相微萃取技术（SPME）萃取30min后进行气相-质谱检测，结果见图2。而以空白E.Coil BL21菌株作为阴性对照，未检测到β-榄香烯生成。

由图2可见，重组菌株生产β-榄香烯的初始表达峰面积为4067531，按照标准品β-榄香烯1μl用固相微萃取相同条件下吸附30min后检测到的峰面积为278992338，经过换算，β-榄香烯产量是128μg/L。

实施例4：

将实施例1所得β-榄香烯合成酶基因分别连接到pET-21b、pET-28a、pET-32a、pET-42a四种载体上，然后转化到BL21菌株中，转接到含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃、0.4mM IPTG条件下密封，诱导20h后取培养液用固相微萃取，30℃，搅拌条件下萃取吸附样品30min，用GC检测萃取头上吸附的样品量，结果见图3。

由图3可见，使用载体pET-21b产物表达量最高，因此优选pET-21b作为表达载体。

实施例5：

如实施例4确定表达载体后，重组菌株转接到含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，分别在20℃、25℃、30℃、37℃4个温度下用0.4mMIPTG诱导20h，取培养液用固相微萃取，30℃搅拌条件下吸附30min，气相检测萃取头上吸附的样品量，结果见图4。

由图4可见，诱导温度以25～30℃为宜。

实施例6：

如实施例4确定表达载体后，重组菌株转接到含10μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在30℃温度诱导条件下，选取了0.01mM、0.1mM、0.3mM、0.4mM、0.7mM、0.8mM几个不同的IPTG浓度作为优化条件，分别诱导20h，取培养液用固相微萃取，30℃搅拌条件下吸附30min，用气相检测萃取头上吸附的样品量，结果见图5。

由图5可见，IPTG浓度以0.4～0.5mM为宜。

Claims

1.一种β-榄香烯合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述β-榄香烯合成酶的编码基因。

3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所示编码基因的重组载体。

5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.权利要求2或3所述的基因在制备重组β-榄香烯合成酶中的应用。

7.权利要求1所述的β-榄香烯合成酶在微生物法制备β-榄香烯中的应用。