CN103243083A

CN103243083A - 一种新的倍半萜合成酶及其用途

Info

Publication number: CN103243083A
Application number: CN2012100251176A
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 王凌健; 李建戌
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2032-02-06
Also published as: CN103243083B

Abstract

本发明涉及一种新的倍半萜合成酶及其用途。本发明人分离获得一种新的倍半萜合成酶，所述的倍半萜合成酶可以将法尼基焦磷酸环化产生α-没药醇。通过结构域置换和点突变实验，本发明人还获得了所述倍半萜合成酶的产物特异性位点。所述的倍半萜合成酶的酶活性良好，可应用于工业生产α-没药醇。

Description

一种新的倍半萜合成酶及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新的倍半萜合成酶及其用途。

背景技术

植物青蒿(Artemisia annua L.)属于菊科植物，为一年生草本植物，其具有良好的药用价值。青蒿含有多种化学成分，如含倍半萜类(包括青蒿素(Qinghaosu，Artemisinin)、青蒿醇(Artemisinol)、青蒿酸(Artemisic acid)等)；亦含挥发性成分，如莰烯(Camphene)、β-莰烯(β-Camphene)、异蒿酮(Isoartemisia ketone)、左旋樟脑(1-Camphor)、β-丁香烯(β-Caryophyllene)等；亦含黄酮类成分，如：山柰黄素(Kaemp-ferol)、槲皮黄素(Quercetin)、黄色黄素(Luteolin)等；还含香豆素类成分以及β-半乳糖甙酶(β-Galactosidace)、β-葡萄糖甙酶(β-Glucosidase)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)和棕榈酸(Palmitic acid)等。各种成分发挥了抗疟作用、抗血吸虫作用，抗微生物作用等。其中的青蒿素，其是含有过氧桥的倍半萜衍生物，是治疗疟疾的有效药物，而紫穗槐二烯合酶(ADS)是青蒿素生物合成途径中重要的倍半萜合成酶。然而，仍然还有很多青蒿素生物合成途径中的酶没有被分离和鉴定。

α-没药醇是存在于春黄菊花等植物中的一种成份，是广泛应用于化妆品中的消炎物质，由于其稳定性及很好的皮肤相容性，它很适合于用在化妆品中，不仅具有抗炎性能，还被证明有抑菌活性。目前现有技术中，α-没药醇的生产主要是通过栽培植物提取的手段进行，而未见采用生物技术方法生产的报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的倍半萜合成酶及其用途。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，其是具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽、或其同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物。

在一个优选例中，所述的保守性变异多肽、活性片段、活性衍生物选自下组：

(1)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽功能的多肽；或

(2)与SEQ ID NO：3氨基酸序列具有70％以上(更佳地80％以上，更佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地98％以上或99％以上)的序列相同性的，且具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽功能的多肽。

在另一优选例中，所述的具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽的功能包括：环化法尼基焦磷酸(FPP)产生α-没药醇(α-Bisabolol)。

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO：3中第272位是Ala，第274位是Ala，第276位是Arg，第288位是Leu，第289位是Ala，第291位是Val，第301位是Ile，第328位是Met；第373位是Val，第381位是Leu，第392位是Leu，第394-399位是Ser Ile Ala Val Asn Leu；第417位是Val，第421位是Ala，第422位是Phe，第428位是Glu，第432位是Leu，第435位是Lys，第446位是Ala，第447位是Gly，第450位是Glu，第457位是Val，第471位是Ser，第476位是Lys，第477位是Asn，第512位是Val，第513位是His。

在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO：3中第272-329位氨基酸序列、第343-399位氨基酸序列、第417-486位氨基酸序列是保守的(不发生氨基酸的变异)。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其是：

(i)编码权利要求1-4任一所述多肽的多核苷酸；或

(ii)与(i)的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为不能简单地借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的细胞；或所述的宿主细胞为非植物繁殖材料。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为非生殖性细胞。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的多肽的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于生产α-没药醇。

本发明的另一方面，提供一种生产α-没药醇的方法，所述的方法包括：利用所述的多肽环化法尼基焦磷酸(FPP)产生α-没药醇(α-Bisabolol)。

在另一优选例中，所述的多肽催化法尼基焦磷酸环化在体外或细胞内进行。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、天然的萜类合酶QHS3与紫穗槐二烯合成酶(ADS)的蛋白质序列比对图。它们的同源性82％。

图2、QHS3的组织表达特征，表明QHS3在花序中高表达。

图3、QHS3体外酶活的GC-MS图(FPP为底物)及QHS3体外酶活副产物的含量以及结构(FPP为底物)。

A、对照pET32a空载体的酶活反应GC-MS图；

B、QHS3的酶活反应GC-MS图；

C、标准品α-没药醇(α-bisabolol)的GC-MS图；

D、B图中峰1的质谱图；

E、标准品α-没药醇的质谱图；

F、QHS3主产物α-没药醇以及其他副产物的含量的比较；

G、QHS3副产物的化学结构。

图4、野生型和突变体QHS3活力的影响。

A、将QHS3和ADS的C-末端结构域分成两部分207-381aa、392-546aa，加N-末端结构域1-195aa共三部分进行结构域置换的示意图。

B、将QHS3和ADS的C-末端活性结构域约350个氨基酸残基分为五部分207-261aa、272-329aa、343-399aa、417-486aa、496-546aa，以QHS3的蛋白序列为骨架，用ADS中相同部分进行置换的示意图。

C、B示意图中的DW3中被分析的片段再分成两段343-381aa、392-399aa，以ADS中相应部分进行置换的示意图。

图5、野生型(A)和突变体QHS3(第373、395、398和399位四个氨基酸残基突变)(B)体外酶活的GC-MS图。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，分离获得一种新的倍半萜合成酶，所述的倍半萜合成酶可以将法尼基焦磷酸(FPP)环化产生α-没药醇(α-Bisabolol)。通过结构域置换和点突变实验，本发明人还获得了所述倍半萜合成酶的产物特异性的位点。所述的倍半萜合成酶的酶活性良好，可应用于工业生产α-没药醇。在此基础上完成了本发明。

本发明的多肽(倍半萜合成酶)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括倍半萜合成酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的倍半萜合成酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“倍半萜合成酶”或“倍半萜合成酶蛋白”指具有倍半萜合成酶活性(较佳地为环化FPP产生α-没药醇)的SEQ ID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有与倍半萜合成酶相同功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括倍半萜合成酶的活性片段和活性衍生物。较佳地，这些变异形式中，对应于SEQ ID NO：3氨基酸序列中的部分位点是保守的；较佳地，这些保守性位点包括：对应于SEQ ID NO：3的第272位，第274位，第276位，第288位，第289位，第291位，第301位，第328位；第373位，第381位，第392位，第394-399位；第417位，第421位，第422位，第428位，第432位，第435位，第446位，第447位，第450位，第457位，第471位，第476位，第477位，第512位，第513位；更佳地，所述的保守性位点包括：对应于SEQ ID NO：3中第272-329位氨基酸序列、第343-399位氨基酸序列、第417-486位氨基酸序列。上述保守性位点或区域与本发明的倍半萜合成酶的酶功能较为相关，一个或几个位点的变化将导致倍半萜合成酶的酶功能丧失。

发明还提供倍半萜合成酶或多肽的类似物。这些类似物与所述的倍半萜合成酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。较佳地，较佳地，这种氨基酸的替换发生在前面所指出的保守性位点或区域以外的位点上。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“倍半萜合成酶的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。较佳地，这种氨基酸的替换发生在前面所指出的保守性位点或区域以外的位点上。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

在本发明的具体实施例中，提供了一种倍半萜合酶QHS3，通过对QHS3和紫穗槐二烯合成酶(ADS)的结构域置换和点突变实验，发现了控制QHS3产物特异性的位点。同时本发明人解析了QHS3的蛋白晶体结构，通过结构信息来改造酶蛋白，以提高酶活性或者产生新产物；或模拟ADS的结构，来提供改造ADS的氨基酸位点。

本发明还提供了编码本发明倍半萜合成酶或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”或“严紧条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码倍半萜合成酶的多聚核苷酸。

本发明的编码倍半萜合成酶的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接以获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或倍半萜合成酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的倍半萜合成酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码倍半萜合成酶(或变异体)的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，倍半萜合成酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含倍半萜合成酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，酵母，植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的倍半萜合成酶(或其片段、变异形式或衍生物)的多核苷酸在转化入宿主细胞后，可直接用于生产α-没药醇。所述的倍半萜合成酶可以催化FPP环化，从而获得α-没药醇。在本发明的具体实施例中，通过原核表达和体外酶活实验，经质谱鉴定证明倍半萜合成酶QHS3可以将FPP环化产生α-没药醇。

法尼基焦磷酸(英语：Farnesyl pyrophosphate，FPP)是存在于β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶途径中的一个中间产物，用于在生物体内生物合成萜、类萜与甾醇，其结构式为

所述的倍半萜合成酶催化FPP环化可在胞内或胞外进行。作为本发明的一种优选方式，提供了一种胞外合成α-没药醇的方法，包括将所述的倍半萜合成酶与FPP反应。作为本发明的另一优选方式，提供了一种胞内生物合成α-没药醇的方法：包括将所述的倍半萜合酶的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而生产α-没药醇。

作为本发明的优选方式，提供了一种在胞内直接生产α-没药醇的方法，所述的方法包括：将本发明的倍半萜合成酶的编码基因利用合适的表达载体转入宿主细胞内，获得重组细胞并进行发酵生产。细胞内本身存在β-羟基-β-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶途径，因此可自行产生FPP。

较佳地，可将所述的倍半萜合成酶的编码基因以及FPP产生酶(即：MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于：乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸还原酶、FPP合成酶、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA还原酶、香叶基转移酶等)的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而生产α-没药醇。FPP产生酶及其编码基因是本领域已知的，本领域技术人员清楚如何获得这些酶以及如何将之转化细胞。以上MVA/MEP途径中的酶也是本领域技术人员熟知的。

通过利用倍半萜合成酶发酵生产α-没药醇，可以极大地提高α-没药醇产量，降低成本。

在获得了α-没药醇后，可以通过生物或化学的手段制备倍半萜没药烯，还原后可得到萜类衍生物没药烷(Bisabolane)，没药醇、没药烯和没药烷的转化关系如下：

由于没药烷与D2生物柴油具有相似的属性，是一种很有前景的D2生物柴油替代品；理论上可以利用改造的微生物设计生产新型生物燃料。而本发明的倍半萜合成酶可以合成α-没药醇，通过还原得到没药烷。因此，可以通过在微生物中表达倍半萜合成酶，发酵生产α-没药醇，为合成生物燃料提供原料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.实施例

实施例1、青蒿总RNA的提取、PCR扩增目的基因QHS3

A、青蒿总RNA的提取

取青蒿植物材料(约100mg)于液氮中充分研磨。转移至1.5ml离心管中，加入1mL Trizol(Invitrogen，Cat.15596-018)，混匀，室温放置5min。12,000rpm离心10min，弃取沉淀。上清中加入200μL三氯甲烷，混匀，12,000rpm离心10min。取上清，加入500μL异丙醇沉淀RNA。12,000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥，溶于20-50μL H₂O(RNase free)。将RNA用10mM Tris-HCl(pH7.5)作适当稀释，测定波长在200-300nm之间的UV吸收值。RNA浓度＝40μg/mL×A₂₆₀×稀释倍数。A₂₆₀/A₂₈₀应当在1.9至2.1之间。PolyAmRNA第一链反转录采用RNA PCR体系(TaKaRa，Cat.DRR019A)。反应体系如下：

42℃反应30min。沸水煮5min后，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR扩增目的基因。

B、3’RACE和5’RACE获得QHS3全长cDNA

利用引物QT进行反转录。以反转录产物为模板，引物Q1+QHS3-S1和Q2+QHS3-S2进行巢式PCR扩增QHS3的3’端。

用引物QHS3-AS3进行基因特异的反转录。反转录结束后，反应体系中加1μl RNaseH 37℃消化30分钟。用胶回收试剂盒纯化反转录产物。加入1μl末端转移酶和1mM dATP 37℃反应30分钟，进行加A反应。反应结束后，进行第一轮PCR，使用引物QT+Q1+QHS3-AS2扩增。第二轮PCR所用引物为Q2+QHS3-AS1。扩增获得QHS3的5’端。

根据5’和3’RACE结果拼接出全长。使用引物QHS3-full-S+QHS3-full-AS用pfu酶进行PCR扩增QHS3全长，获得的序列如SEQ ID NO：1(含有3’及5’非翻译区)。

PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，68℃延伸120s，扩增30至35个循环；68℃保温10min。4℃保温。

各引物序列如下：

QHS3-full-S：5’-GGCAACTGTAGTAAATTAAACCAC-3’(SEQ ID NO：4)；

QHS3-full-AS：5’-AACACCATCTTATGAAACACCAA-3’(SEQ ID NO：5)；

QT：

5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：6)；

Q1：5’-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3’(SEQ ID NO：7)；

Q2：5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’(SEQ ID NO：8)；

QHS3-S1：5’-GGCAACTGTAGTAAATTAAACCA-3’(SEQ ID NO：9)；

QHS3-S2：5’-GAAAGCGGAGTGTTCAAGCAATCGT-3’(SEQ ID NO：10)；

QHS3-AS1：5’-AGTTGGCAATGGGGCGAATAGGT-3’(SEQ ID NO：11)；

QHS3-AS2：5’-ATCTTTCACTATCTGTTCCACCC-3’(SEQ ID NO：12)；

QHS3-AS3：5’-TTGAACACTCCGCTTTCGTCTTTAT-3’(SEQ ID NO：13)。

实施例2、PCR扩增目的基因QHS3

用高保真酶KOD-plus DNA聚合酶(ToYoBo)扩增QHS3全长基因序列(SEQ ID NO：2)(1641bp)，引物序列如下：

pETQHS 3-S：5’-TTTCCATGGCTATGTCTCTTACAGAAGAAAAACCTA-3’(SEQ ID NO：14)，

pETQHS3-AS：5’-TTTGGATCCTCATATACTCATAGGATAAACGAGT-3’(SEQ ID NO：15)。

实施例3、青蒿QHS3的结构域置换和定点突变

使用重叠延伸PCR技术(Aiyar et al.，1996)，构建成功多个结构域置换突变体及单点突变体、双突变体、三突变体及多突变体。对这些突变体的DNA序列进行了测定。

突变体信息以及引物序列如表1(5’-3’)。

表1

实施例4、载体构建和大肠杆菌转化

A、载体构建

KOD-plus DNA聚合酶扩增QHS3编码区序列及突变体序列，经NcoI/BamHI酶切连入pET-32a载体(Novagen)。

B、感受态细胞制备

-70℃储存的大肠杆菌DH5α或BL-21，在固体LB平板上划线，37℃培养过夜；挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，250rpm培养过夜。第二天，按1/50的比例放大接种到500mL液体LB培养基中，18-22℃培养，至OD₆₀₀≈0.5(约5-6h)，冰上冷却10min。4℃2,500g离心10min，菌体用160mL转化缓冲液重悬，离心弃上清，菌体最后用40mL转化缓冲液重悬，加入3mL DMSO，混匀。分装，每管50μL，液氮速冻，-70℃保存。

转化缓冲液：55mM MnCl₂，15mM CaCl₂，250mM KCl，10mM PIPES(pH6.7)，新鲜配制，冰上预冷。

LB培养基(1L)：10g NaCl，5g酵母抽提物，10g蛋白胨，pH7.0。固体LB培养基加入15g/L琼脂粉。

C、转化

加DNA样品(0.1-0.5μg)于50μL融化的大肠杆菌感受态细胞中，混匀，冰上放置25min；42℃热处理90s，冰上放置3min；加100μL液体LB培养基，37℃复苏培养30min；涂于选择平板，培养12-16h。然后后挑单菌落进行PCR鉴定。

DNA琼脂糖凝胶电泳、片段的酶切、纯化和连接参考《分子克隆实验指南》。

实施例5、RT-PCR

1μg总RNA，Oligo(dT)₂₀为引物，10μL反应体系，按照反转录试剂盒(TOYOBO，Osaka，Japan)要求进行反转录。42℃反应30min。沸水煮5min后，置于冰上。反转录产物(或稀释10倍后)可直接用于PCR检测。根据的QHS3序列，合成了PCR引物，分析QHS3表达时，以青蒿Actinl(GenBank登录号：EU531837)作为内对照，校正RT-PCR反应的模板量。

PCR条反应的复性温度和延伸时间由引物和扩增片段长度决定。一般反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，55-60℃复性30s，72℃延伸30s，扩增25至35个循环；72℃保温10min。4℃保温。

实施例6、原核表达和酶活测定

A、原核表达

BL21细胞在含50μg/mL Ampicillin的LB平板上37℃生长过夜，PCR鉴定挑取阳性单菌落在液体培养基中培养过夜，取500μL培养物扩大培养到50mL，直到OD₆₀₀≈0.6加入IPTG到终浓度为0.5mmol/L，继续在20℃诱导培养过夜(20h)。取6mL菌液12000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于预冷的3mL缓冲液(25mM Mopso，pH7.0，5mM DTT，和10％[v/v]甘油，5mM MgCl₂)中，超声波破碎，离心，取上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。或者依照Ni-NTA Spin Kit手册(Qiagen，Valencia，CA)，纯化带有His-Tag的重组蛋白，并电泳鉴定。

B、酶活测定

同样诱导得到的上清蛋白在1.5mL EP管中进行酶活测定，500μL上述蛋白中加入FPP(Farnesyl pyrophosphate，Sigma-Aldrich，F6892)至FPP终浓度40μmol/L，在反应体系上方覆盖400μL正己烷，37℃反应1小时，取4μL进行GC-MS分析。

C、仪器和色谱条件

安捷伦6890/5973GC-MSD气相色谱-质谱检测器，采用HP5-MS石英毛细管柱(30mx0.25mmx0.25μm，安捷伦)。高纯氦气作为载气，载气流速为1ml/min，温度设置为220℃。进行分析时，升温程序为80℃起始，10℃/min升到250℃，然后20℃/min升到280℃，保持2.5min。质谱采用EI源，扫描范围为30-500m/z，离子源和四级杆温度分别为250℃和150℃，扫描频率为5次/s。化合物的结构和名称通过NIST(National Institute of Standards and Technology)和Wiley libraries两个数据库共同决定。

实施例7、动力学分析

用0.025M pH7.0 HEPES缓冲液包含3μg的纯化蛋白、5mM DTT及5mMMgCl₂，在25℃反应5-10min，使用底物FPP的浓度从3μm到100μm。k_cat、K_m及V_max用Lineweaver-Burk曲线计算。

K_m值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶K_m值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，K_m值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；K_m值小，表明亲合力大。

k_cat为催化常数，又叫做转换数(TN值)。它的单位为s^-1，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。

k_cat/K_m的大小用于比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。

测定不同底物浓度时，对测得的反应速度与相应底物浓度进行回归分析，求得K_m值。计算公式为米氏方程(Michaelis-Menten equation)：v＝V_max*[S]/(K_m+[S])(公式1)；其中，v代表反应初速度；V_max代表最大反应速度；[S]代表底物浓度；此运算可同时得到V_max。

根据公式V_max＝k_cat*[E](公式2)计算k_cat；其中，V_max为最大反应速度，在计算K_m值时求得；[E]为酶浓度。

II.实施结果

1、QHS3与ADS的同源性比较以及植物组织表达情况

QHS3编码的核苷酸序列全长1641bp，包含546个氨基酸残基。将天然的QHS3蛋白与ADS蛋白在氨基酸水平进行序列比较，结果如图1。序列比对表明QHS3与已知ADS的蛋白序列一致性(Identity)为82％。

取青蒿植物的各组织，RT-PCR检测其中QHS3基因的组织表达特征。结果如图2，表明QHS3在花序中高表达，与已报道ADS的表达特征相同。

2、QHS3体外酶活测定以及反应产物

如实施例6方法进行QHS3体外酶活测定，以FPP作为底物。结果如图3A-E，可见QHS3体外酶活的产物从出峰的保留时间(GC-MS图)以及质谱图与标准品α-没药醇(α-bisabolol)的一致，因此说明了QHS3酶活的主产物就是α-没药醇。

本发明人分析了以FPP为底物，QHS3体外酶活副产物的含量以及结构，QHS3主产物α-没药醇以及其他副产物的含量的比较如图3F，可见α-没药醇占了绝大多数，其它还有顺式-α-没药烯、β-倍半水芹烯等5种含量非常少的副产物；QHS3副产物的化学结构如图3G，副产物与主产物α-没药醇的母环结构一致，说明它们产生的途径一致。

3、野生型和结构域替换的突变体QHS3活力的影响

萜类合成酶包含一个C-末端活性结构域和一个N-末端结构域。将QHS3和ADS的C-末端结构域分成两部分207-381aa、392-546aa，加N-末端结构域1-195aa共三部分进行结构域置换，以确定影响酶功能的结构域。置换示意图如图4A。结果表明，N-末端结构域1-195aa被置换不会导致酶失去活性，QHS3和ADS的N-末端结构域对酶的产物特异性并没有影响。而C-末端结构域两部分中，任何一部分被置换都能使酶失去活性，说明C-末端结构域直接影响酶的功能。

将C-末端活性结构域约350个氨基酸残基分为五部分207-261aa、272-329aa、343-399aa、417-486aa、496-546aa，以QHS3的蛋白序列为骨架，用ADS中相应部分进行置换。置换示意图如图4B。结果显示，DW1、DW3和DW5三种置换的酶能产生α-没药醇，而DW2和DW4两种置换的酶失去活性，并且DW3能产生一种新产物。这种新产物(AP)经NIST库检测，匹配度最高的一种化合物是Isocaryophillene(异丁子香烯)。

将DW3中被分析的片段343-399aa再分成两段343-381aa、392-399aa，以ADS中相同部分进行置换，分析其酶活。置换示意图如图4C。结果表明，343-381aa被置换后，产物是α-没药醇不变。392-399aa被置换后，无产物产生。这说明这两段中有共同决定新产物产生的氨基酸残基，而392-399aa中的一些氨基酸残基对酶的功能影响很大。

3、野生型和点突变的突变体QHS3活力的影响

在QHS3和ADS的343-381aa、392-399aa两段序列中，本发明人发现有15个氨基酸残基不同，通过结构域置换和多点突变确定了在QHS3中，第373、395、398和399位四个氨基酸残基的突变就可以改变酶的产物特异性，产生新产物AP。野生型QHS3的酶活反应GC-MS图如图5A，QHS3在第373(由V突变为N)、395(由I突变为V)、398(由N突变为I)和399(由L突变为T)位四个氨基酸残基的突变后的酶活反应GC-MS图如图5B。

4、QHS3的酶动力学测定

如实施例7进行QHS3的酶动力学测定，测定结果如表2所示。

表2

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

主要参考文献：

1.Aiyar，A.，Xiang，Y.，and Leis，J.(1996).Site-Directed Mutagenesis UsingOverlap Extension PCR.Methods Mol.Biol.57，177-191.

2.Bouwmeester，H.J.，Wallaart，T.E.，Janssen，M.H.，van Loo，B.，Jansen，B.J.，Posthumus，M.A.，Schmidt，C.O.，De Kraker，J.W.，Konig，W.A.，andFranssen，M.C.(1999).Amorpha-4，11-diene synthase catalyses the first probablestep in artemisinin biosynthesis.Phytochemistry 52，843-854.

3.Chang，Y.J.，Song，S.H.，Park，S.H.，and Kim，S.U.(2000).Amorpha-4，11-diene synthase of Artemisia annua：cDNA isolation and bacterialexpression of a terpene synthase involved in artemisinin biosynthesis.ArchBiochem Biophys 383，178-184.

4.Mercke，P.，Bengtsson，M.，Bouwmeester，H.J.，Posthumus，M.A.，and Brodelius，P.E.(2000).Molecular cloning，expression，and characterization ofamorpha-4，11-diene synthase，a key enzyme of artemisinin biosynthesis inArtemisia annua L.Arch Biochem Biophys 381，173-180.

5.Wallaart，T.E.，Bouwmeester，H.J.，Hille，J.，Poppinga，L.，and Maijers，N.C.(2001).Amorpha-4，11-diene synthase：cloning and functional expression of akey enzyme in the biosynthetic pathway of the novel antimalarial drug artemisinin.Planta 212，460-465.

6.Peralta-Yahya，P.P.，Ouellet，M.，Chan，R.，Mukhopadhyay，A.，Keasling，J.D.，and Lee，T.S.(2011).Identification and microbial production of aterpene-based advanced biofuel.Nature communications 2，483.

Claims

1.一种分离的多肽，其是具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽、或其同功能的保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的保守性变异多肽、活性片段、活性衍生物选自下组：

(1)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽功能的多肽；或

(2)与SEQ ID NO：3氨基酸序列具有70％以上的序列相同性的，且具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽功能的多肽。

3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO：3中第272位是Ala，第274位是Ala，第276位是Arg，第288位是Leu，第289位是Ala，第291位是Val，第301位是Ile，第328位是Met；第373位是Val，第381位是Leu，第392位是Leu，第394-399位是Ser Ile Ala Val Asn Leu；第417位是Val，第421位是Ala，第422位是Phe，第428位是Glu，第432位是Leu，第435位是Lys，第446位是Ala，第447位是Gly，第450位是Glu，第457位是Val，第471位是Ser，第476位是Lys，第477位是Asn，第512位是Val，第513位是His。

4.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中，对应于SEQ ID NO：3中第272-329位氨基酸序列、第343-399位氨基酸序列、第417-486位氨基酸序列是保守的。

5.一种分离的多核苷酸，其是：

(i)编码权利要求1-4任一所述多肽的多核苷酸；或

(ii)与(i)的多核苷酸互补的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

7.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5或6所述的多核苷酸。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的载体，或基因组中整合有权利要求5或6所述的多核苷酸。

9.一种生产权利要求1-4任一所述的多肽的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求8所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离权利要求1-4任一所述的多肽。

10.权利要求1-4任一所述的多肽的用途，用于生产α-没药醇。

11.一种生产α-没药醇的方法，其特征在于，所述的方法包括：利用权利要求1-4任一所述的多肽环化法尼基焦磷酸产生α-没药醇。