CN103468665A - 一种玉米苯丙氨酸解氨酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米苯丙氨酸解氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了上述玉米苯丙氨酸解氨酶在生物法合成肉桂酸中的应用。将本发明提供的玉米苯丙氨酸解氨酶ZmPAL基因构建到大肠杆菌表达载体并转化入大肠杆菌细胞进行原核表达，可用于高比活植物苯丙氨酸解氨酶的生产。获得的重组玉米苯丙氨酸解氨酶能够催化L-苯丙氨酸去氨基生产肉桂酸，为全生物合成制备肉桂酸提供了可能，具有很高的工业应用价值。

Description

一种玉米苯丙氨酸解氨酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物技术领域，具体涉及玉米苯丙氨酸解氨酶（ZmPAL）基因及其应用。

背景技术

苯丙氨酸解氨酶于1961年由J.Koukol，E.Conn在大麦中发现，主要存在于高等植物、酵母、菌类的可溶性部分。一般分子量为30万，是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的胞内诱导酶，在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化。近年来苯丙氨酸解氨酶的研究主要集中在植物生理代谢调控和医用领域。在植物的代谢过程中，苯丙氨酸解氨酶是催化苯丙烷类代谢途经第一步反应的酶，也是这个途径的关键酶和限速酶，所参与的苯丙烷类代谢途径的次生代谢产物在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用；在医用领域，苯丙氨酸解氨酶可以用于治疗某些肿瘤，监控苯丙酮尿患者血浆中的苯丙氨酸含量，治疗苯丙酮尿患者，其主要作用是催化肉桂酸转化生产L-苯丙氨酸。苯丙氨酸解氨酶用于工业生产并不多见，目前研究大多局限于酶法制备L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸是人体八种必须氨基酸之一，用于制备多重氨基酸输液，综合氨基酸制剂以及营养强化剂，也是功能性食品甜味剂阿斯巴甜（AMP）生产的主要原料。苯丙氨酸解氨酶(PAL)转化肉桂酸制备L-苯丙氨酸工艺不需辅助因子、工艺路线简单、成本低，所以极具竞争力。该工艺所用的苯丙氨酸解氨酶主要来自红酵母属，目前主要问题是生产过程中由于红酵母的PAL产量低，酶活下降迅速，导致肉桂酸转化率低，限制了L-苯丙氨酸的生产。

肉桂酸，分子量为148.17，微微有桂皮香气，是从肉桂皮或安息香分离出的有机酸。在植物中的代谢途径是由苯丙氨酸脱氨降解产生的苯丙烯酸，其可作为芳香混合物，用于香皂、香波、洗衣粉和日用化妆品中，以增加香味。还可用在葡萄酒中，使其色泽光鲜，在饮用进人体之后，还能增强人体的免疫功能，防止氧化作用进程和自由基的释放。作为一种重要的精细化工品目前在香精香料、食品添加剂、医药工业、美容、农药、有机合成等多个方面均有重要用途。肉桂酸按照烯键上氢原子空间位置不同，可分为顺式和反式两种，顺式肉桂酸来自于天然提取，而化学合成生产获得的肉桂酸均为反式结构。Perkin反应制备反式肉桂酸是将苯甲醛、醋酸酐和无水醋酸钠混合反应获得，该工艺主要缺点在于收率低、成本相对较高，且原料相对有毒，生产的肉桂酸在食品、美容等行业应用受限。因此，寻求能够高效转化L-苯丙氨酸合成肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶，不仅对于提供肉桂酸生产新工艺具有一定的新颖性，更重要的意义在于酶法制备肉桂酸是一种全生物合成路线（苯丙氨酸来自于发酵法），生产获得肉桂酸更接近天然肉桂酸，对肉桂酸在食品、美容等与人体健康密切相关的领域应用有重大贡献。

迄今为止，适用于L-苯丙氨酸合成肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶制备与开发的报道很少，目前尚未发现对玉米苯丙氨酸解氨酶基因体外表达的研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种适于苯丙氨酸合成肉桂酸的玉米苯丙氨酸解氨酶ZmPAL、编码基因及其应用。

一种玉米苯丙氨酸解氨酶ZmPAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述玉米苯丙氨酸解氨酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，长度为2223bp。

一种重组质粒，它含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因，具体为pETDuet-1-ZmPAL。

一种重组菌，它是包含了重组质粒pETDuet-1-ZmPAL的大肠杆菌。

上述重组菌的构建方法，将玉米苯丙氨酸解氨酶基因连接到表达质粒载体上，将含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因的重组质粒转化到大肠杆菌中。

上述玉米苯丙氨酸解氨酶在生物法合成肉桂酸中的应用。

本发明是利用生物信息学手段分析玉米全基因组测序结果进行基因探矿，对来源于玉米的苯丙氨酸解氨酶进行密码子优化和序列设计，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，利用化学法合成该基因并通过DNA重组技术将本发明制备的玉米苯丙氨酸解氨酶基因在原核细胞中进行诱导表达，获得的重组玉米苯丙氨酸解氨酶共741个氨基酸，分子量为80KDa，在40℃、pH值为8.5-9.0的条件下具有较高的酶活。

本发明与现有技术相比，具有实质性的特点和显著性的进步是：

与玉米基因组数据预测的苯丙氨酸解氨酶相比，在N端添加了Met、Gly、Ser、Ser、His、His、His、His、His、His、Ser、Gln、Asp、Pro、Asn、Ser、Ser、Ser、Ala、Arg、Leu、Gln、Val、Asp、Lys、Leu共26个氨基酸，本发明中蛋白理论大小为741个氨基酸。

通过Blast软件在线比较分析，发现ZmPAL编码的氨基酸序列与其它植物的已知PAL具有较高的同源性，与高粱（sorghum bicolor）、苦竹（Pleioblastus maculosoides）、毛竹（phyllostachys edulis）、水稻（oryza sativa）、大麦（hordeum vulgare）的一致性分别为77%、76%、75%、75%和74%。

本发明中，术语“玉米苯丙氨酸解氨酶”还包括能编码具有与玉米苯丙氨酸解氨酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括：若干个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和3’端添加数个核苷酸。

在本发明实例中，所述的基因全长2223bp。通过化学合成法合成该基因并将其连接在表达载体上，形成重组质粒pETDuet-1-ZmPAL，进一步将可诱导表达苯丙氨酸解氨酶基因的重组质粒转化到感受态细胞E.coli BL21（DE3）中，将转化好的细胞转接到含有AMP的LB培养基上进行培养。待OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为1μg/mL的IPTG诱导目的基因的表达，诱导之后采用超声波破碎细胞，获得具有活性的苯丙氨酸解氨酶，对该酶进行酶学性质测定，在37℃下，在12.1mM的L-苯丙氨酸、50mM的Tris-HCl的底物中加入适量的粗酶液，反应30min，用紫外分光光度计测定肉桂酸的生成，证明诱导表达出的苯丙氨酸解氨酶具有活性。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种在体外合成的玉米苯丙氨酸解氨酶，该酶可以应用于以L-苯丙氨酸为底物生物制备肉桂酸方面。本发明不仅解决了从植物中提取苯丙氨酸解氨酶的困难，而且可以实现生物制备肉桂酸的途径，保证了肉桂酸的安全性，具有很高的应用价值。

附图说明

图1是含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因的质粒pETDuet-1-ZmPAL结构图。

图2是对含有ZmPAL基因的重组质粒pETDuet-1-ZmPAL双酶切电泳结果。其中，M:Marker DL5,000；1,2为双酶切的两段基因。

图3是诱导表达后粗酶液和纯酶液的SDS-PAGE电泳结果图。其中，1为空的pETDuet上清液；2为重组蛋白粗酶液；M为Marker；3～8分别为0%、20%、40%、60%、80%、100%洗脱结果。

图4是L-苯丙氨酸生成肉桂酸的转化反应0h的HPLC图。其中，1：L-苯丙氨酸。

图5是L-苯丙氨酸生成肉桂酸的转化反应1h的HPLC图。其中，1：L-苯丙氨酸；2：肉桂酸。

具体实施方式

下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如《分子克隆实验指南》。

实施例1：含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因序列的重组菌的构建。

通过化学合成法合成编码本发明中玉米的苯丙氨酸解氨酶基因（SEQ ID No：1所示）片段，并将其连接到pETDuet-1载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞，经过蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析，验证得到载有ZmPAL基因的重组质粒pETDuet-1-ZmPAL，重组表达载体pETDuet-1-ZmPAL图如图1所示。把重组载体重组质粒pETDuet-1-ZmPAL转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，将转化的细胞涂布于含有1‰Amp的LB平板上37℃进行培养，对平板上生长出来的单菌落提取质粒进行双酶切电泳验证，电泳结果（图2）表明，单克隆菌落含有目的基因片段，可用于苯丙氨酸解氨酶蛋白的诱导表达实验。

实施例2：玉米苯丙氨酸解氨酶基因的原核表达与纯化。

将实施例1中鉴定正确的克隆进行过夜培养，再转接到含1μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行培养，待菌液OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG于16℃下进行诱导表达，诱导8h之后，收集菌液，8000rpm，5min，倒掉上清培养基，用PBS等体积洗涤两次，加入适量PBS，使得重悬菌液OD₆₀₀=20，加入15%（v/v）甘油，1mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），并在涡旋机上混匀；用超声波破碎仪破碎，超声波破碎条件：工作时间设为20min，每次工作5s，休息4s，功率设为25%，破碎后获得苯丙氨酸解氨酶粗酶液，4℃下10000rpm离心10min，取上清，将收集的蛋白与样品溶解液1：1体积比于100℃水浴加热5min失活后用SDS-PAGE进行蛋白验证，用含不载有目的基因ZmPAL的空质粒的E.coli BL21（DE3）诱导表达出的蛋白做空白对照，验证结果如图3所示。对获得的苯丙氨酸解氨酶粗酶液用0.22μm膜过滤除去杂质，采用亲和介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化，上样前预先5倍柱体积的缓冲液平衡亲和柱，上样后先以100%的Binding Buffer洗脱杂蛋白，再用不同百分比的Elution Buffer洗脱重组蛋白以获得纯化的蛋白溶液，40%Elution Buffer的洗脱液中含有目的蛋白。

实施例3：苯丙氨酸解氨酶酶学性质的研究。

将实施例2获得的粗酶液和纯酶液进行酶学性质的研究，包括酶活、比活性、最适温度和最适pH等。酶活采用紫外分光光度计进行测定。

苯丙氨酸解氨酶酶活测定，按照表1中所示的反应体系加入各组分，对照管用失活的酶液，37℃温育，反应30min，然后分别用6N的HCl终止反应，用紫外分光光度计在A₂₉₀下测定反应前后肉桂酸的生成量，以二者差值计算细胞粗酶液PAL的酶活（酶活力单位采用国际单位IU，即以每分钟生成1μmol肉桂酸为1IU）。

表1ZmPAL活性检测

粗酶液蛋白含量的测定采Bradford微量分析法测定蛋白浓度。

粗酶液和纯酶液的酶学性质，检测结果如表2所示，粗酶液的酶活为2.781×10^-2IU，纯酶液的酶活为3.143×10^-2IU。纯酶液的比酶活比粗酶液的比酶活增高44.6倍，由原来的403.7U/g增加到1.8011×10⁴U/g，最适反应pH为8.5，最适反应温度为40℃。

表2重组玉米苯丙氨酸解氨酶的酶学性质

实施例4：利用苯丙氨酸解氨酶催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸的转化反应。

苯丙氨酸解氨酶催化L-苯丙氨酸生成肉桂酸转化反应的反应体系为在100mL三角瓶中，称取0.5g除去水分的苯丙氨酸，加入49mL pH8.5.Tris-HCl缓冲液，配成10g/L浓度的底物，放置于37℃，100-170r/min的水浴锅中振荡均匀加入酶液1ml，用保鲜膜扎紧瓶口，开始计时水解。水解1小时后用6N的HCl终止反应。通过HPLC分析反应体系中产物的含量与转化率，如图4-5所示，反应转化率为62%。

HPLC分析条件，色谱柱：Eclipse XDB-C18色谱柱（250mm×4.6mm;5μm）；柱温35℃；以1.5%的乙酸（A相）和乙腈（C相）为流动相，流速为0.8ml/min；采用示差折光检测器进行检测，检测波长260nm；进样量10μl。

Claims (6)

1.一种玉米苯丙氨酸解氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种玉米苯丙氨酸解氨酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，它含有权利要求2所述的玉米苯丙氨酸解氨酶基因。

4.一种重组菌，其特征在于，它是包含了权利要求3所述的重组质粒的大肠杆菌。

5.权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，将玉米苯丙氨酸解氨酶基因连接到表达质粒载体上，将含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因的重组质粒转化到大肠杆菌中。

6.权利要求1所述的玉米苯丙氨酸解氨酶在生物法合成肉桂酸中的应用。

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