CN107828752A

CN107828752A - 一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α‑熊果苷中的应用

Info

Publication number: CN107828752A
Application number: CN201711088144.7A
Authority: CN
Inventors: 王东阳; 张娟; 冯志彬; 王蕾
Original assignee: SHANDONG YANGCHENG BIOTECH Co Ltd
Current assignee: SHANDONG YANGCHENG BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-11-07
Also published as: CN107828752B

Abstract

本发明公开了一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α‑熊果苷中的应用，所述蔗糖淀粉酶DpAMY基因，是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。该蔗糖淀粉酶DpAMY来源于Deinococcus puniceus菌，具有高催化能力，能够特异地催化蔗糖和对苯二酚生产α‑熊果苷，6h内能够催化3％的对苯二酚，摩尔转化效率达98％，催化时间短，产物纯度高，副产物少，易于纯化。

Description

一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α-熊果苷中的应用

技术领域

本发明涉及蔗糖淀粉酶生产技术领域，具体涉及一种一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α-熊果苷中的应用。

背景技术

熊果苷是从多种不同植物中提取得到的天然活性物质，是葡萄糖基化的氢醌衍生物，化合物分类中属于氢醌葡萄糖苷类，具有某些特定的生理功能，广泛存在于在动物、植物及微生物细胞中。熊果苷具有抑制黑色素产生的作用，通常在化妆品中作为美白保湿剂使用，具有两种异构体，即：β-熊果苷和α-熊果苷，研究表明，不仅在美白功效方面α-熊果苷远远强于β-熊果苷，而且在使用的安全性上α-熊果苷也远远优于β-熊果苷。二者均属于天然产物，前者主要通过植物提取或化学法合成得到；而α-熊果苷除通过植物提取制备外，主要通过生物转化法得到。

生物转化法是利用生物细胞中的相应的酶对外源化合物进行酶催化反应。目前已经发现一些植物细胞，如西洋参冠瘿组织培养液、长春花组织细胞、何首乌毛状根能够催化底物生成α-熊果苷，1991年，Inomate等人首次将对苯二酚加入到长春花植物组织细胞悬浮液中，通过对苯二酚的转化制得具有高含量的熊果苷；此后Yokoyama等人不仅采用更换新鲜的植物组织培养液的方法提高熊果苷产率，还通过在培养液中添加抗氧化剂方法是熊果苷的产率得到大大的提高。但是由于它们催化效率低，生产水平难以提高而无法应用于工业生产。微生物酶法或全细胞转化法具有生产效率高，原料简单，生产周期短，发酵条件容易控制，生产更环保、符合可持续发展的要求，发展前景非常广阔。，刘春巧等将嗜麦芽黄单胞菌B T-112作为生物反应器，向培养液中加入氢醌和葡萄糖，该反应生成的α-熊果苷的转化率相对于反应物氢醌而言高达91.2％。李良群等以巨大芽孢杆菌CNIB-8505细胞作为生物反应器，利用促进其代谢的蔗糖磷酸化酶进行催化合成，α-熊果苷含量达0.35g/L、原料中对苯二酚转化率为74％。耐辐射地热菌(Deinococcus geothermalis)来源的淀粉蔗糖酶能够利用对苯二酚高效转化生产α-熊果苷，24内转化率高达90％。以上情况表明微生物法在生产α-熊果苷方面取得较大的进步，但仍然存在酶活不够高、产物浓度低、转化率低及生产周期长的缺点距离工业应用尚有一段距离。采用分子生物学技术构建高表达淀粉蔗糖酶重组菌利用转糖基化反应一步合成α-熊果苷，将解决a-熊果昔用化学法难合成，酶催化法产量低、成本高和不利于大规模生产的难题，且具有生产成本低、产品纯度高、操作简单安全等优点。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种蔗糖淀粉酶DpAMY及其制备方法，该蔗糖淀粉酶DpAMY来源于Deinococcus puniceus菌，具有高催化能力。

本发明的另一目的在于提供上述蔗糖淀粉酶DpAMY在生产α-熊果苷中的应用，以蔗糖淀粉酶DpAMY催化蔗糖和对苯二酚生产α-熊果苷，该方法提高了转化效率，用以降低现有技术的成本，提高工业化生产的竞争力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种蔗糖淀粉酶DpAMY基因，它是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

上述蔗糖淀粉酶DpAMY基因编码的蛋白质，它是SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

优选地，所述蔗糖淀粉酶DpAMY来自于Deinococcus puniceus菌，但不局限于此菌。

上述蔗糖淀粉酶DpAMY菌体的的制备方法，包括如下步骤：

(a)DpAMY基因的获得：

利用关键字搜索Deinococcus puniceus菌株(CP011387.1)的全基因组序列，得到一个可能的蔗糖淀粉酶候选基因(基因序列如SEQ NO.1所示)。将该候选基因核苷酸序列进行适用于E.coli表达的密码子优化后，全基因合成该基因，并在基因的起始密码子前加入BamHI酶切位点，终止密码子后加入XhoI的酶切位点；

(b)构建DpAMY原核表达载体：

利用BamHI和XhoI分别将DpAMY和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达蔗糖淀粉酶基因DpAMY的质粒pET28a-DpAMY；

(c)构建表达蔗糖淀粉酶DpAMY的基因工程菌；

将质粒pET28a-DpAMY转入E.coli BL21，得到重组表达蔗糖淀粉酶DpAMY的菌株BL21-DpAMY；

(d)将菌株BL21-DpAMY在发酵培养基中发酵培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得到蔗糖淀粉酶DpAMY菌体。

其中，所述发酵培养基配方为：甘油20g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨10g/L，豆粕水解液20g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，柠檬酸1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，微量元素母液1mL，pH7.0；

所述微量元素母液的组成为FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2g/L，CuSO₄·5H₂O2g/L，CaCl₂ 2g/L，H₃BO₃ 0.3g/L，(Na)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L，采用1mol/L HCl溶解而得。

更具体地，菌株BL21-DpAMY发酵培养的具体方法为：

(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养14-24h；

(2)接1环斜面菌种与LB液体种子培养基培养4-8h；

(3)5L发酵罐中装入3.0培养基，种子液以1-5％种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20-40％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6-10h降温至24-30℃表达。发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，-20℃保存菌体备用。

更进一步地，重组蛋白DpAMY表达的检测方法：将上述得到的表达菌株BL21-DpAMY在含有Kana的LB液体培养基中37℃培养，菌体OD600达到0.4-0.6后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mM，25℃诱导表达16h，分别收集加入IPTG诱导前和诱导结束后的菌体，利用聚丙烯胺凝胶电泳检测重组蛋白DpAMY的表达。

本发明还通过试验得出，蔗糖淀粉酶DpAMY菌体中所含的蔗糖淀粉酶(命名为DpAMY)具有催化蔗糖和对苯二酚生产α-熊果苷的优势。具体地，本发明还公开了上述蔗糖淀粉酶DpAMY在制备α-熊果苷中的应用，具体地，制备α-熊果苷的具体方法为：将蔗糖20-30％、对苯二酚1-3％、蔗糖淀粉酶DpAMY菌体10g/L混合后置于反应器中，混合均匀，调节pH7.0，温度为30℃，催化反应4-8h，即得到α-熊果苷。

本发明方法具有如下优点：

本发明通过合适的发酵方法从Deinococcus puniceus菌株中得到一种蔗糖淀粉酶DpAMY菌体，该蔗糖淀粉酶DpAMY在催化反应中能够特异地催化蔗糖和对苯二酚生产α-熊果苷，6h内能够催化3％的对苯二酚，转化效率达99％，生产强度为12.2g/L/h，催化时间短，产物纯度高，副产物少，易于纯化。

本发明采用蔗糖淀粉酶DpAMY为底物生成α-熊果苷，蔗糖淀粉酶DpAMY的诱导采用乳糖诱导，发酵时间为18h，可溶性蔗糖淀粉酶的表达量高，无需酶的纯化，发酵收集的菌体可直接应用于催化反应，成本低，易于操作。

附图说明

图1显示了质粒pET28a-DpAMY的双酶切验证，其中泳道M是DNA marker，泳道1为BamHI/EcoRI双酶切验证质粒pET28a-DpAMY。

图2显示了DpAMY重组蛋白的SDS-PAGE检测结果，泳道1是BL21-DpAMY诱导后产，泳道2是BL21-DpAMY诱导前产物，泳道M是蛋白质Marker。

图3显示了催化反应结束后反应混合物的TLC分析结果，泳道1是对苯二酚标准品，泳道2是α-熊果苷的标准品，泳道3和4是催化反应后的反应液。

图4显示了催化反应结束后反应混合物的HPLC分析结果，A：α-熊果苷的标准品；B：催化反应后的反应液。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明中使用的材料如下：大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、TransTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准相对分子量(Mr)DNA(即DNA marker，Mr 250～10,000)、标准Mr蛋白质等试剂均可购置于北京全式金生物技术有限公司；熊果苷标准品(美国Sigma-Aldrich公司)；对苯二酚、蔗糖、氨苄霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)均购自上海生工生物技术有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；其他试剂均购自国药试剂有限公司。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH 7.0。

实施例1

一种蔗糖淀粉酶DpAMY菌体的制备方法，具体包括如下步骤：

一、蔗糖淀粉酶DpAMY的异源表达：

1、蔗糖淀粉酶DpAMY的异源表达与酶活测定：

(1)获得DpAMY基因片段

(a)蔗糖淀粉酶基因的合成：

利用关键字蔗糖淀粉酶搜索，在Deinococcus puniceus菌株(CP011387.1)的全基因组序列中获得一个可能的蔗糖淀粉酶基因为候选基因(其基因序列如SEQ NO.1所示)。为使DpAMY基因能够在E.coli BL21(DE3)过量表达，对获得的DpAMY基因序列进行了密码子优化，优化后的序列(SEQ NO.2)进行了全基因合成(金唯智公司)，并在合成的DpAMY基因的起始密码子ATG之前加入BamHI限制性酶切位点，终止密码子后加入XhoI限制性酶切位点，以便进一步的重组载体构建。

(b)构建DpAMY原核表达载体：

使用BamHI和XhoI分别双酶切pET28a载体和全基因合成的DpAMY基因，然后二者进行连接反应得到重组表达DpAMY的质粒pET28a-DpAMY；使用BamHI和XhoI双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物得到2条条带(5.9kb和1.9kb)，与预期相符(见图1，泳道1为DNA分子量Marker，泳道2为p28a-DpAMY酶切电泳)。

(c)构建表达DpAMY的基因工程菌；

将pET28a-DpAMY转化入E.coli BL21(DE3)，得到DpAMY表达菌株BL21-DpAMY。

将表达菌株BL21-DpAMY接入LB培养基(含Kana 50ng/ml)中，37℃培养。当OD600值达到0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，DpAMY(Mr约7.18×104D)有明显表达条带，与预期大小相符。IPTG诱导前后DpAMY表达的SDS-PAGE检测结果见图2(泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2箭头所示为诱导蛋白，泳道3为空载体阴性对照)。

二、蔗糖淀粉酶DpAMY的发酵

将菌株BL21-DpAMY在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述DpAMY表达菌体，表达菌体保存于-20℃；

所述微量元素母液的组成为FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O2g/L，CuSO₄·5H₂O2g/L，CaCl₂ 2g/L，H₃BO₃ 0.3g/L，(Na)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L，采用1mol/L HCl溶解而得。

发酵条件：

将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养14-24h；

接1环斜面菌种于LB液体种子培养基培养4-8h；

5L发酵罐中装入3.0L培养基，种子液以1-5％种量接入发酵培养基，初始转速200r/min，初始通气流量为2L/min，随着菌体OD600值增加调节转速与通气流量，以维持溶氧值在20-40％之间，用25％氨水调节pH值稳定在7.0，37℃培养6h降温至25℃，加入0.1％的乳糖诱导表达16h。发酵结束后8000r/min、4℃离心10min收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次。

实施例2

一种酶法合成α-熊果苷的方法，是利用实施例1制备的得到的蔗糖淀粉酶DpAMY催化蔗糖和对苯二酚来生产α-熊果苷，具体如下：

首先按照实施例1的方法制备糖淀粉酶DpAMY菌体，然后向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：蔗糖20％，对苯二酚1％(1g/100mL)，蔗糖淀粉酶菌体10g/L、氨水调节反应体系pH7.0，在30℃条件下转化4h。

经过检测，所得α-熊果苷含量为24.1g/L，对苯二酚摩尔转化率大于97％。再次醇洗后，产物用于薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)检测与结构鉴定以及催化体系中产物化合物1的检测。

使用TLC测定化合物1。所用硅胶板为TLC Silica gel 60F254，展开剂使用乙酸乙酯∶乙酸∶水＝3∶1∶1的混合液，显色剂使用茴香醛混合液(135mL乙醇+5mL浓硫酸+1.5mL冰乙酸+3.7mL茴香醛)，125℃烘烤10min显色。检测结果见图3所示，如图所示，催化后的反应液中均检测到了的α-熊果苷的生成。

高效液相色谱(HPLC)检测方法：反应液8000r/min离心20min，取1mL反应液加入11mL甲醇混合均匀，稀释100倍，过滤后用于Waters液相色谱仪，C₁₈色谱柱(3.9×150mm)，流动相(甲醇∶水＝1∶9)，柱温35℃，流速：1ml/min，检测波长：282nm，进样量20μL。检测结果见图4所示，反应液检测到生成的α-熊果苷。

实施例3一种酶法合成α-熊果苷的方法

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例2。

按步骤一中的方法得到DpAMY的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：蔗糖25％，对苯二酚2％((2g/100mL))，蔗糖淀粉酶湿菌体15g/L、氨水调节反应体系pH7.0，在30℃条件下转化6h。所得α-熊果苷含量为48.6g/L，对苯二酚摩尔转化率大于98％。熊果苷检测方法如实施例1。

实施例4一种酶法合成α-熊果苷的方法

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例2。

按步骤一中的方法得到DpAMY的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：蔗糖30％，对苯二酚3％(3g/100mL)，蔗糖淀粉酶湿菌体20g/L、氨水调节反应体系pH为7.3，在35℃条件下转化8h。所得α-熊果苷含量为73.2g/L，对苯二酚摩尔转化率大于98％。熊果苷检测方法如实施例2。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东阳成生物科技有限公司

<120> 一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α-熊果苷中的应用

<130> 2017

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1929

<212> DNA

<213> α-amylosucrease

<400> 1

gtgctaaaga cggacttggc ggcgcggctg aggcccgctt ttgatgatga ccgcgatgcg 60

gaaacctttc tgctgcggct ggaacgctac ggcgctgacc tagagggcag tttgcgggcg 120

gtgtacggcg acgccaccga cacgctgatg gctgaactgt tggaagtgct gattcacgcg 180

caccacaccc gcgcccccga cctgaagcgg ctggacgagg cccgcctgct gcgccccgac 240

tggctgcaag cgcccgacat gatcgggtac gtggcctaca cagaccgctt tgccggaacc 300

ctgcgcggcg tgcaggagcg gctggagtat ctggagggct tgggcgtcaa atactttcac 360

ctgatgccgc tcctcaagcc ccgtgagggc gaaaacgatg gcggctacgc ggtgcaggac 420

taccgcgccg tgcgccccga tctcggcgac atggacgatc tgtcggcgct ggcctccaaa 480

ctgcgcgggc gcggcatcag tctggtgctg gatctggtgt tgaaccacgt ggcccgcgaa 540

cacgagtggg ccgccaaagc gcgggcgggc gatcccgtct accgcgacta tttccatatc 600

tacccggatc gcacccagcc cgacgcctac gagcgcacct tgcctgaagt gtttcccgac 660

tttgcccccg gcaactttac ttgggataca gaaacgagtg gctgggtctg gacgactttc 720

aatgcctacc agtgggatct gaattggggc aatccggcag tgttccgcga gttcaccgac 780

ctgatcctgc acctcgccaa ccggggtgta gaggtgttcc gactggacgc catcgccttt 840

atgtggaagc gcctcggcac ggccagccag aatcagcccg aagtgcatca cctgacgcgg 900

gcgctgcggg cggccatccg gatcgtggcc ccggctgtgg cgttcaaggc cgaagccatc 960

gtggcccccg ccgacctgat tcattacctc ggcacgcggg atcatcacgg caaggtcagc 1020

gacatggcct accagaacag cctgatggtg cagatttgga gcagcctcgc cagccgtgat 1080

acccgcctgt tcgagacggc gctgttggcc tttccgccca agcccaccaa caccacttgg 1140

ggcatgtatg tgcgctgcca cgacgatatt ggctgggcca tcagcgacga ggatgcgggg 1200

cgcgtgggcc tcagcgggcc ggggcatcgc cattttctca gcgattttta cagcggcgag 1260

catcccggca gctttgcgcg ggggctggta tttcagcaca accccgccac cggagatagg 1320

cgaattagcg gcagcgcggc cagcttggcg ggtctggaag ccgcgctgga cgcaggacac 1380

gccggatgga cagaccacgc ggtacggcgc ttgctgctgg cccacgccgt gacgctcggc 1440

tttggcggcg tgcccctgct gtacatgggc gacgaactcg cgctcctgaa cgactacacc 1500

ttcgaggccg accccgccca cgcgcccgac aaccgctggg ttcaccgccc caaaatggat 1560

tgggcattgg ccgaagccgt gcaggatgat ccggccacgc cagccgcacg ggtcaacgct 1620

ggaattcgcg ccctgatcgc tgcccgccag cgcacgccgc acctgcacgc cagcgtcgaa 1680

tcccgcgccg tgcccagccc agattcccgc gtgctgctgc tgcgccgcga tcatcctttg 1740

ggcgtcatgc tgtgcgtgta taacttcagc gaacacgagg tggcctttcc cacctacctg 1800

ctgcgcgatc agttgggcga acacgccacc gacgctgtgg cgggcacgca ctttactttg 1860

cagcgggcca ccacgcgcct tgctcccttc cgcgccctgt ggcttaccca atcggaggct 1920

ccacgatga 1929

<210> 2

<211> 1944

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ggatccatgg ttctgaaaac cgacctggct gctcgtctgc gtccggcttt cgacgacgac 60

cgtgacgctg aaaccttcct gctgcgtctg gaacgttacg gtgctgacct ggaaggttct 120

ctgcgtgctg tttacggtga cgctaccgac accctgatgg ctgaactgct ggaagttctg 180

atccacgctc accacacccg tgctccggac ctgaaacgtc tggacgaagc tcgtctgctg 240

cgtccggact ggctgcaggc tccggacatg atcggttacg ttgcttacac cgaccgtttc 300

gctggtaccc tgcgtggtgt tcaggaacgt ctggaatacc tggaaggtct gggtgttaaa 360

tacttccacc tgatgccgct gctgaaaccg cgtgaaggtg aaaacgacgg tggttacgct 420

gttcaggact accgtgctgt tcgtccggac ctgggtgaca tggacgacct gtctgctctg 480

gcttctaaac tgcgtggtcg tggtatctct ctggttctgg acctggttct gaaccacgtt 540

gctcgtgaac acgaatgggc tgctaaagct cgtgctggtg acccggttta ccgtgactac 600

ttccacatct acccggaccg tacccagccg gacgcttacg aacgtaccct gccggaagtt 660

ttcccggact tcgctccggg taacttcacc tgggacaccg aaacctctgg ttgggtttgg 720

accaccttca acgcttacca gtgggacctg aactggggta acccggctgt tttccgtgaa 780

ttcaccgacc tgatcctgca cctggctaac cgtggtgttg aagttttccg tctggacgct 840

atcgctttca tgtggaaacg tctgggtacc gcttctcaga accagccgga agttcaccac 900

ctgacccgtg ctctgcgtgc tgctatccgt atcgttgctc cggctgttgc tttcaaagct 960

gaagctatcg ttgctccggc tgacctgatc cactacctgg gtacccgtga ccaccacggt 1020

aaagtttctg acatggctta ccagaactct ctgatggttc agatctggtc ttctctggct 1080

tctcgtgaca cccgtctgtt cgaaaccgct ctgctggctt tcccgccgaa accgaccaac 1140

accacctggg gtatgtacgt tcgttgccac gacgacatcg gttgggctat ctctgacgaa 1200

gacgctggtc gtgttggtct gtctggtccg ggtcaccgtc acttcctgtc tgacttctac 1260

tctggtgaac acccgggttc tttcgctcgt ggtctggttt tccagcacaa cccggctacc 1320

ggtgaccgtc gtatctctgg ttctgctgct tctctggctg gtctggaagc tgctctggac 1380

gctggtcacg ctggttggac cgaccacgct gttcgtcgtc tgctgctggc tcacgctgtt 1440

accctgggtt tcggtggtgt tccgctgctg tacatgggtg acgaactggc tctgctgaac 1500

gactacacct tcgaagctga cccggctcac gctccggaca accgttgggt tcaccgtccg 1560

aaaatggact gggctctggc tgaagctgtt caggacgacc cggctacccc ggctgctcgt 1620

gttaacgctg gtatccgtgc tctgatcgct gctcgtcagc gtaccccgca cctgcacgct 1680

tctgttgaat ctcgtgctgt tccgtctccg gactctcgtg ttctgctgct gcgtcgtgac 1740

cacccgctgg gtgttatgct gtgcgtttac aacttctctg aacacgaagt tgctttcccg 1800

acctacctgc tgcgtgacca gctgggtgaa cacgctaccg acgctgttgc tggtacccac 1860

ttcaccctgc agcgtgctac cacccgtctg gctccgttcc gtgctctgtg gctgacccag 1920

tctgaagctc cgcgttaact cgag 1944

<210> 3

<211> 643

<212> PRT

<213> predicted

<400> 3

Met Val Leu Lys Thr Asp Leu Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ala Phe Asp

1 5 10 15

Asp Asp Arg Asp Ala Glu Thr Phe Leu Leu Arg Leu Glu Arg Tyr Gly

20 25 30

Ala Asp Leu Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Tyr Gly Asp Ala Thr Asp

35 40 45

Thr Leu Met Ala Glu Leu Leu Glu Val Leu Ile His Ala His His Thr

50 55 60

Arg Ala Pro Asp Leu Lys Arg Leu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Arg Pro

65 70 75 80

Asp Trp Leu Gln Ala Pro Asp Met Ile Gly Tyr Val Ala Tyr Thr Asp

85 90 95

Arg Phe Ala Gly Thr Leu Arg Gly Val Gln Glu Arg Leu Glu Tyr Leu

100 105 110

Glu Gly Leu Gly Val Lys Tyr Phe His Leu Met Pro Leu Leu Lys Pro

115 120 125

Arg Glu Gly Glu Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Val Gln Asp Tyr Arg Ala

130 135 140

Val Arg Pro Asp Leu Gly Asp Met Asp Asp Leu Ser Ala Leu Ala Ser

145 150 155 160

Lys Leu Arg Gly Arg Gly Ile Ser Leu Val Leu Asp Leu Val Leu Asn

165 170 175

His Val Ala Arg Glu His Glu Trp Ala Ala Lys Ala Arg Ala Gly Asp

180 185 190

Pro Val Tyr Arg Asp Tyr Phe His Ile Tyr Pro Asp Arg Thr Gln Pro

195 200 205

Asp Ala Tyr Glu Arg Thr Leu Pro Glu Val Phe Pro Asp Phe Ala Pro

210 215 220

Gly Asn Phe Thr Trp Asp Thr Glu Thr Ser Gly Trp Val Trp Thr Thr

225 230 235 240

Phe Asn Ala Tyr Gln Trp Asp Leu Asn Trp Gly Asn Pro Ala Val Phe

245 250 255

Arg Glu Phe Thr Asp Leu Ile Leu His Leu Ala Asn Arg Gly Val Glu

260 265 270

Val Phe Arg Leu Asp Ala Ile Ala Phe Met Trp Lys Arg Leu Gly Thr

275 280 285

Ala Ser Gln Asn Gln Pro Glu Val His His Leu Thr Arg Ala Leu Arg

290 295 300

Ala Ala Ile Arg Ile Val Ala Pro Ala Val Ala Phe Lys Ala Glu Ala

305 310 315 320

Ile Val Ala Pro Ala Asp Leu Ile His Tyr Leu Gly Thr Arg Asp His

325 330 335

His Gly Lys Val Ser Asp Met Ala Tyr Gln Asn Ser Leu Met Val Gln

340 345 350

Ile Trp Ser Ser Leu Ala Ser Arg Asp Thr Arg Leu Phe Glu Thr Ala

355 360 365

Leu Leu Ala Phe Pro Pro Lys Pro Thr Asn Thr Thr Trp Gly Met Tyr

370 375 380

Val Arg Cys His Asp Asp Ile Gly Trp Ala Ile Ser Asp Glu Asp Ala

385 390 395 400

Gly Arg Val Gly Leu Ser Gly Pro Gly His Arg His Phe Leu Ser Asp

405 410 415

Phe Tyr Ser Gly Glu His Pro Gly Ser Phe Ala Arg Gly Leu Val Phe

420 425 430

Gln His Asn Pro Ala Thr Gly Asp Arg Arg Ile Ser Gly Ser Ala Ala

435 440 445

Ser Leu Ala Gly Leu Glu Ala Ala Leu Asp Ala Gly His Ala Gly Trp

450 455 460

Thr Asp His Ala Val Arg Arg Leu Leu Leu Ala His Ala Val Thr Leu

465 470 475 480

Gly Phe Gly Gly Val Pro Leu Leu Tyr Met Gly Asp Glu Leu Ala Leu

485 490 495

Leu Asn Asp Tyr Thr Phe Glu Ala Asp Pro Ala His Ala Pro Asp Asn

500 505 510

Arg Trp Val His Arg Pro Lys Met Asp Trp Ala Leu Ala Glu Ala Val

515 520 525

Gln Asp Asp Pro Ala Thr Pro Ala Ala Arg Val Asn Ala Gly Ile Arg

530 535 540

Ala Leu Ile Ala Ala Arg Gln Arg Thr Pro His Leu His Ala Ser Val

545 550 555 560

Glu Ser Arg Ala Val Pro Ser Pro Asp Ser Arg Val Leu Leu Leu Arg

565 570 575

Arg Asp His Pro Leu Gly Val Met Leu Cys Val Tyr Asn Phe Ser Glu

580 585 590

His Glu Val Ala Phe Pro Thr Tyr Leu Leu Arg Asp Gln Leu Gly Glu

595 600 605

His Ala Thr Asp Ala Val Ala Gly Thr His Phe Thr Leu Gln Arg Ala

610 615 620

Thr Thr Arg Leu Ala Pro Phe Arg Ala Leu Trp Leu Thr Gln Ser Glu

625 630 635 640

Ala Pro Arg

Claims

1.一种蔗糖淀粉酶，其特征在于，所述蔗糖淀粉酶命名为DpAMY，蔗糖淀粉酶DpAMY的基因是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述蔗糖淀粉酶DpAMY基因编码的蛋白质，其特征在于，它是SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的蔗糖淀粉酶，其特征在于，所述蔗糖淀粉酶DpAMY来自于Deinococcus puniceus菌。

4.权利要求1-3任一项所述蔗糖淀粉酶DpAMY菌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(a)DpAMY基因的获得：

将来自于Deinococcus puniceus菌株的蔗糖淀粉酶候选基因进行密码子优化后进行全基因合成，并在基因序列的前端加入BamHI限制性酶切位点，末端加入XhoI限制性酶切位点；

(b)构建DpAMY原核表达载体：

(c)构建表达蔗糖淀粉酶DpAMY的基因工程菌；

5.根据权利要求4所述蔗糖淀粉酶DpAMY菌体的的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：甘油20g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨10g/L，豆粕水解液20g/L，K₂HPO₄ 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，柠檬酸1.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，微量元素母液1mL，pH7.0；

所述微量元素母液的组成为FeSO₄·7H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 2g/L，CuSO₄·5H₂O 2g/L，CaCl₂ 2g/L，H₃BO₃ 0.3g/L，(Na)₆Mo₇O₂₄ 0.1g/L，采用1mol/L HCl溶解而得。

6.根据权利要求4所述蔗糖淀粉酶DpAMY菌体的的制备方法，其特征在于，菌株BL21-DpAMY发酵培养的具体方法为：

(1)将构建的基因工程菌接入LB斜面培养基培养14-24h；

(2)接1环斜面菌种与LB液体种子培养基培养4-8h；

7.权利要求4-6任一项所述蔗糖淀粉酶DpAMY在制备α-熊果苷中的应用，其特征在于，制备α-熊果苷的具体方法为：将蔗糖20-30％、对苯二酚1-3％、蔗糖淀粉酶DpAMY菌体10g/L混合后置于反应器中，混合均匀，调节pH值为7.0，温度为30℃，催化反应4-8h，即得到α-熊果苷。