CN111100893A - 一种采用酶催化法制备糖苷的方法 - Google Patents

一种采用酶催化法制备糖苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种采用酶催化法制备糖苷的方法。在该方法中，将对苯二酚或维生素C经过重结晶处理得到精制后的对苯二酚或维生素C，然后在水溶液中以蔗糖糖苷转移酶作为催化剂酶进行酶催化反应使对苯二酚与蔗糖反应制备α‑熊果苷或以维生素C与蔗糖反应制备维生素C葡萄糖苷，最后通过重结晶得到α‑熊果苷或维生素C葡萄糖苷纯品。该方法可以特异性地使对苯二酚与蔗糖反应生成α‑熊果苷或使维生素C与蔗糖反应生成维生素C葡萄糖苷。产物单一，底物转化率达到85％以上，只需要通过简单的重结晶就可以得到98％以上高纯度的产品，生产操作简单，设备要求低，生产过程中的溶剂可以循环利用，绿色环保，可大规模进行生产。

Description

一种采用酶催化法制备糖苷的方法
技术领域
本发明涉及一种糖苷的合成方法，特别涉及一种采用酶催化法制备糖苷的方法，本发明属于生物化工技术领域。
背景技术
糖苷是糖的半缩醛羟基与配基缩合失去一分子水或其它小分子化合物而形成的化合物，糖基可以是单糖或多糖，而糖基受体的结构可以从简单的中等长度的脂肪族醇变化到蛋白。糖苷广泛存在于生物体内，其中很多糖苷由于具有特殊的生物活性而担负着重要的生物功能。例如，植物的叶、籽粒和皮中存在的数目众多的糖苷，对植物的生长具有重要作用，动物体中存在的多种糖苷具有抗肿瘤、免疫调节等多种生理活性。目前临床上使用的植物来源药物，其中大部分为糖昔。天麻苷、红景天苷、熊果苷、洋地黄苷、桔梗皂苷、人参皂苷等早已被开发为药物。此外，苦杏仁之所以能止咳是由于它的有效成份：苦杏仁苷；洋地黄叶及其它强心类生药的有效成份为甾体糖苷；洋地黄苷能加强心肌收缩力，减慢心率并抑制传导，其作用慢而持久，适于慢性心功能不全患者长期服用；中草药黄芪根具有抗菌作用，常用作清热解毒类药物，其有效成分是黄芪苷。
α-熊果苷类似于熊果苷，名称为对苯二酚-α-D-葡萄糖苷，能够抑制黑色素的产生和沉积，祛除色斑和雀斑。研究表明α-熊果苷在比较低的浓度下即可抑制酪氨酸酶的活性，其对酪氨酸酶的抑制作用优于熊果苷。α-熊果苷抑制黑色素形成的效果是β-熊果苷的5-10倍，在正常的使用条件下，不会抑制正常细胞的生长，副作用更小。而且该物质在防治紫外线方面也有良好的功效。然而，不同于合成的β-熊果苷，α-熊果苷的制备目前还比较受限。有人在曼陀罗的细胞上成功地进行了α-熊果苷的合成，但底物浓度也仅为30-40mg/L，尚不具备进行产业化的可能。使用植物细胞作为生物反应器进行转化的方法合成α-熊果苷，依赖于植物本身的培养条件，以及植物细胞对底物的耐受能力，但最为重要的原因是植物细胞培养在工业化放大的过程中容易出现染菌的问题。而目前使用酶选择性转化对苯二酚生成α-熊果苷存在生物细胞对对苯二酚耐受能力差的问题，导致底物浓度只能控制在很低的水平。因此寻找一种绿色酶催化法制备α-熊果苷具有重要的意义。
维生素C(缩写为VC)是人体必需的营养元素之一，在临床上主要用来治疗坏血酸病，故化学名称为抗坏血酸(ascorbic acid，AA)。此外，VC特有的化学结构和生理活性使其可以作为酸味剂、还原剂、抗氧化剂、漂白剂和稳定剂广泛应用于化妆品、食品和医药等领域。然而VC也存在着一系列固有弊端：其在水溶液中极不稳定；易被空气中的氧和其他氧化剂氧化；暴露于中性pH、热、光和重金属下会快速降解等，从而限制了它在某些领域中的应用。因此，开发高附加值的VC衍生物成为近年来国内外学者研究的热点。维生素C葡萄糖苷(ascorbylglucoside)，学名-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbicacid，缩写为AA-2G)，是VC的一种衍生物，其分子式为C12H18O11，相对分子质量为338.27，熔点为158.5～159.5℃。AA-2G的结构特征决定了它具有如下几个主要特点与功能：1)AA-2G具有非还原活性，不易发生氧化反应，在水溶液中特别稳定。2)AA-2G具有较好的耐光性和耐热性，其在100℃，30min的加热条件下也不分解。3)进入细胞的AA-2G，经α-葡萄糖苷酶水解生成VC和葡萄糖，且具有同原始VC一样的还原性和抗氧化性。并且由于AA-2G的持续分解，可为体内不断的提供VC，促进胶原蛋白的形成，具有防止皮肤衰老的功能。4)AA-2G是卫生署公布认可的6种美白添加剂之一。它可以直接排出表皮层中已经形成的黑色素(即将已形成的黑色素加速逆向还原至最初形态)，美白效果比其他添加剂更加明显和快速，因此在多种高端美白化妆品中都有着广泛的应用。目前，国际上的AA-2G只由日本林原国际有限公司一家提供，而国内还没有一个厂家能够达到该产品的工业化生产水平。
从植物中分离糖苷类化合物，分离步骤繁多，产率低。化学法合成糖苷及糖苷酯需要采用基团保护及脱保护等措施，步骤繁多，且选择性差。用酶法催化糖苷及糖苷酯的合成只需要一步反应，且立体选择性和区域选择性高，因此可以大大节省后续的提取成本，实现绿色生产。
发明内容
本发明的目的是克服现有α-熊果苷使用植物细胞作为生物反应器进行转化的方法合成α-熊果苷，依赖于植物本身的培养条件，以及植物细胞对底物的耐受能力，在工业化放大的过程中容易出现染菌的等缺陷，以及目前目前国际上的维生素C葡萄糖苷(AA-2G)只由日本林原国际有限公司一家提供，而国内还没有一个厂家能够达到该产品的工业化生产水平的缺陷，提供一种可高效制备α-熊果苷和维生素C葡萄糖苷的酶催化方法，解决现阶段α-熊果苷和维生素C葡萄糖苷产量低、价格高的问题。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种采用酶催化法制备糖苷的方法，包括以下步骤：
(1)酶催化底物的精制：将亚硫酸钠、工业级酶催化底物、活性炭、维生素C以及水按质量比亚硫酸钠：工业级酶催化底物：活性炭：维生素C：水为1：500～1000：10～50：5～10：1000～1500混合均匀，在50～80℃溶解，趁热过滤，然后结晶过滤后在40～60℃真空干燥4～10h；其中，工业级酶催化底物为工业级对苯二酚或工业级维生素C；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖溶于水中配成50～200mmol/L溶液，加入抗氧剂维生素C，待溶解完全后，加入精制过的酶催化底物和蔗糖糖苷转移酶，在30～40℃下于pH为5.0～8.0的条件下避光反应20～80h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；其中蔗糖糖苷转移酶：蔗糖：抗氧剂维生素C：精制过的酶催化底物的物质的量比为1：100～500：1～5：10～80；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3～5次得到纯度在98％以上的α-熊果苷或维生素C葡萄糖苷纯品。
其中，优选的，所述的蔗糖糖苷转移酶的基因序列为SEQ ID No.1所示基因序列，或其基因序列与SEQ ID No.1所示的基因序列具备95％以上的同源性且能使对苯二酚与蔗糖反应生成α-熊果苷或使维生素C与蔗糖反应生成维生素C葡萄糖苷的酶的基因序列。
其中，优选的，所述的蔗糖糖苷转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，或其氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具备98％以上的同源性且能使对苯二酚与蔗糖反应生成α-熊果苷或使维生素C与蔗糖反应生成维生素C葡萄糖苷的酶。
其中，优选的，所述的蔗糖糖苷转移酶的生产细胞选自基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。
其中，优选的，制备α-熊果苷时，步骤(1)中，亚硫酸钠、工业级对苯二酚、活性炭、维生素C以及水的质量比为0.2：100：5：1：250。
其中，优选的，制备α-熊果苷时，步骤(2)中，将蔗糖溶于水中配成100mmol/L溶液，蔗糖糖苷转移酶：蔗糖：抗氧剂维生素C：精制过的酶催化底物对苯二酚的物质的量比为1：100：1：10。
其中，优选的，制备维生素C葡萄糖苷时，步骤(1)中，亚硫酸钠、工业级维生素C、活性炭、维生素C以及水的质量比为0.2：100：5：1：250。
其中，优选的，制备维生素C葡萄糖苷时，步骤(2)中，将蔗糖溶于水中配成100mmol/L溶液，蔗糖糖苷转移酶：蔗糖：抗氧剂维生素C：精制过的酶催化底物维生素C的物质的量比为1：100：1：50。
按照本发明所述的方法制备得到的α-熊果苷或维生素C葡萄糖苷含量≥98％，底物转化率≥85％。
相较于现有技术，本发明的有益效果：
本发明的方法可以特异性地使对苯二酚与蔗糖反应生成α-熊果苷或使维生素C与蔗糖反应生成维生素C葡萄糖苷。产物单一，底物转化率达到85％以上，只需要通过简单的重结晶就可以得到98％以上高纯度的产品，生产操作简单，设备要求低，生产过程中的溶剂可以循环利用，绿色环保，可大规模进行生产。本发明方法对原料的要求比较宽泛，不需要用到高纯度的原料就可以高效地生产出高纯度的α-熊果苷和维生素C葡萄糖苷，较大幅度地降低了生产成本。本发明过程中使用有机物的量相比传统方法大大减少，并且酶解母液还可进行多轮的循环利用，极大地减轻了对环保的压力。
附图说明
图1为VC与对苯二酚的比例对转化率的影响；
图2为蔗糖使用比例对转化率的影响；
图3为本发明中制备α-熊果苷的反应方程式；
图4为α-熊果苷氢谱；
图5为α-熊果苷红外图谱；
图6为本发明中制备维生素C葡萄糖苷的反应方程式；
图7为维生素C葡萄糖苷的红外光谱。
具体实施方式
以下介绍本发明制备方法的实施例，但以下实施例是用于说明本发明的示例，并不构成对本发明权利要求的任何限定。
实施例1蔗糖糖苷转移酶(DGAS)的表达与制备
1.1细菌菌株和培养条件
E.coli DH10B被用作克隆菌株。
E.coli MC1061/BL21(DE3)被用作表达菌株(氨苄抗性)，重组大肠杆菌菌株在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中在37℃下生长。
1.2表达载体的构建
用于发酵催化酶的酶的基因序列(SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示)由生工生物(上海)股份有限公司进行全基因合成，基因合成后与表达载体pGEX-6P-1连接，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白质的表达，用氨苄抗性的培养基筛选转化成功的表达菌株，扩大培养后，转入摇瓶培养，将重组菌株按5％的添加量加入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，220rpm、37℃培养。待OD600为0.5至0.6时，25℃IPTG诱导16小时，离心收集粗蛋白。
重组DGAS酶在其羧基末端被6his标签标记，因此纯化简单地使用(Ni-NTA)亲和柱层析具体方法如下。将上清液直接加载到Ni-NTA亲和柱中，并用两倍体积的洗涤缓冲液[50mM NaH2PO4，300mM NaCl和20mM咪唑(pH 7.0)]洗涤柱。用洗脱缓冲液[50mMNaH2PO4,300mM NaCl，和250mM咪唑(pH7.0)]洗脱结合在柱上的重组DGAS酶，并将来自洗脱部分的蛋白质透析以除去过量的咪唑。纯化的重组DGAS通过SDS-PAGE(含10％(w/v)丙烯酰胺)电泳检测纯度。
实施例2α-熊果苷的酶催化合成反应的优化
本实施例使用实施例1制备的酶作为催化剂，使用对苯二酚为糖苷受体，使用蔗糖作为糖基供体，合成α-熊果苷。
1.对苯二酚的纯化
由于对苯二酚的工业制备方法和该化合物不稳定的特性，使得对苯二酚的试剂中含有重金属和对苯醌等杂质，在化学法进行反应的过程中影响不大，但在酶催化反应中则显著影响了酶的活性和反应转化率，因此该方法中使用的对苯二酚都需要经过精制纯化的过程。
经过实验，使用的方法是取对苯二酚100g，加入活性炭5g，亚硫酸钠0.2g，VC 1g，加入水250mL，加入溶解对苯二酚，温度控制在70摄氏度附近，趁热过滤，结晶，过滤后真空干燥，控制干燥温度小于60摄氏度。
经过精制的对苯二酚颜色为无色至微黄色针状晶体，mp.174-175摄氏度。高于精制前的172-173摄氏度。
在使用中，经过纯化的对苯二酚对酶活几乎没有显著的影响，反应20小时后，酶活的下降与直接存放在水相中酶活的下降相似，因此对进行酶催化制备α-熊果苷的方法来说，对苯二酚的精制是十分必要的，将会直接影响反应是否成功。
2.酶催化反应
取适量蔗糖溶于水中，加入抗氧化剂VC，待溶解完全后，加入精制后的对苯二酚和实施例1制备的酶，保持温度在35-38摄氏度，20-30小时，用TLC和HPLC监测反应过程，待对苯二酚不再向α-熊果苷转化后停止反应，用正丁醇萃取，浓缩，用活性炭脱色后，水重结晶得到α-熊果苷。
在确定的最优条件下，即蔗糖浓度100mmol/L，对苯二酚10mmol/L，VC1mmol/L，pH～8.0的情况下，反应22h，对苯二酚的转化率可达90％以上。
3.酶活性的影响因素
3.1温度对酶活的影响
因为该反应在水相中进行，因此未考察溶剂对酶活的影响，这样温度是影响酶活的主要因素。我们使用不同的温度对酶在水中的稳定性和酶活进行了检测。
结果如表1所示：
表1温度对酶活的影响
Figure BDA0002359152130000061
Figure BDA0002359152130000071
由此可以看出该酶最为适用的温度在40摄氏度附近，温度低时反应速度慢，温度超过40摄氏度则活性大幅度降低，超过70摄氏度，蛋白质变性使得酶的活性几乎完全消失。因此选取适宜的酶催化反应温度在30-40摄氏度。
3.2蛋白水解酶对酶活的影响
酶的稳定性测试，将酶溶于水中，室温放置，在标准条件下对酶活进行测试，评估酶的稳定性。结果如表2所示：
表2蛋白水解酶对酶活的影响
序号 存放时间(d) 酶活(μ/L)
1 1 2500
2 2 2300
3 3 1200
4 4 500
5 5 50
6 6 10
7 7 10
经过纯化的酶因为去除了发酵液里会加速酶分解和失活的蛋白水解酶，酶的稳定性得以提升，正常的催化反应时间在约20h完成，因此达到这样的稳定性已经可以完成所期望的反应。
3.3反应影响因素
催化反应以对苯二酚和蔗糖为原料，生成熊果苷和果糖，如果反应的过程中，对苯二酚消耗完，则后续的处理是将α-熊果苷和糖进行分离，且不产生含酚废水，因此该转化过程结合经济性、环保需要等因素，期望达到将对苯二酚完全转化为α-熊果苷。实际过程中，发现影响反应平衡移动的因素有底物的浓度和比例，以及抗氧化剂的应用，以下对这些因素进行了实验和优化。
3.5抗氧化剂用量
反应稳定性的影响，对苯二酚是一种极容易被氧化的物质，在反应过程中可以观察到溶液的颜色不断变深，这不仅影响了反应的收率，也对后续的纯化过程造成了很多问题，因此通过初选反应条件蔗糖：对苯二酚5:1，加入不同量的VC为抗氧化剂，其对转化率的影响如图1所示：
因此，优选添加VC的比例为对苯二酚的0.1倍量(摩尔比)。
3.6底物浓度影响
通过加入过量的蔗糖，会显著影响平衡移动，我们通过固定对苯二酚浓度为3g/L，加入不同浓度蔗糖的，使反应转化率达到了90％以上，结果如图2所示。
当蔗糖浓度超过30g/L的时候，对酶产生了抑制效果，因此转化率反而下降了，因此确定最佳反应比例为蔗糖：对苯二酚：VC为10:1:0.1。
实施例3维生素C葡萄糖苷(AA-2G)的酶催化合成反应的优化
本实施例进行了AA-2G的实验尝试，采用与实施例2制备α-熊果苷类似的反应工艺，经过对各个影响因素的研究，得到了比较满意的结果，其工艺各项参数如下：
取适量蔗糖溶于水中，加入抗氧化剂VC，待溶解完全后，加入精制过的酶催化底物VC和蔗糖糖苷转移酶，调整pH为5～6，保持温度在35-38摄氏度，避光反应50-70小时，用TLC和HPLC监测反应过程，待VC不再转化后停止反应，离心浓缩，用活性炭脱色后，水重结晶得到AA-2G。
在确定的最优条件下，即蔗糖浓度100mmol/L，VC 50mmol/L，pH～5的情况下，反应50～70小时，VC的转化率可达85％以上。
实施例4
制备α-熊果苷的示意图如附图3所示。所用的蔗糖糖苷转移酶按照实施例1方法制备，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
(1)酶催化底物的精制：按质量比亚硫酸钠0.2g：工业级对苯二酚100g：活性炭5g：维生素C1g：水250g混合均匀，在70℃溶解，趁热过滤，然后结晶过滤后在50℃真空干燥4h；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖100mmol溶于1L水中配成溶液，加入抗氧剂维生素C1mmol，待溶解完全后，加入精制过的对苯二酚10mmol和蔗糖糖苷转移酶1mmol，在38℃下于pH为8.0的条件下避光反应25h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3次得到纯度在99％的α-熊果苷，对苯二酚转化率达到89％。α-熊果苷的氢谱以及红外光谱分别如图4以及图5所示。
实施例5
制备α-熊果苷的示意图如附图3所示。所用的蔗糖糖苷转移酶的氨基酸序列为SEQID No.2所示。
(1)酶催化底物的精制：同实施例4；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖100mmol溶于1L水中配成溶液，加入抗氧剂维生素C1mmol，待溶解完全后，加入精制过的对苯二酚10mmol和蔗糖糖苷转移酶1mmol，在30℃下于pH为8.0的条件下避光反应20h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3次得到纯度在99％的α-熊果苷，对苯二酚转化率达到85％。α-熊果苷的氢谱以及红外光谱分别如图4以及图5所示。
实施例6
制备α-熊果苷的示意图如附图3所示。所用的蔗糖糖苷转移酶的氨基酸序列为SEQID No.2所示。
(1)酶催化底物的精制：同实施例1；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖100mmol溶于1L水中配成溶液，加入抗氧剂维生素C5mmol，待溶解完全后，加入精制过的对苯二酚10mmol和蔗糖糖苷转移酶1mmol，在38℃下于pH为8.0的条件下避光反应25h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3次得到纯度在99％的α-熊果苷，对苯二酚转化率达到90％。α-熊果苷的氢谱以及红外光谱分别如图4以及图5所示。
实施例7
制备α-熊果苷的示意图如附图3所示。所用的蔗糖糖苷转移酶的氨基酸序列为SEQID No.2所示。
(1)酶催化底物的精制：同实施例1；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖300mmol溶于1L水中配成溶液，加入抗氧剂维生素C1mmol，待溶解完全后，加入精制过的对苯二酚10mmol和蔗糖糖苷转移酶1mmol，在38℃下于pH为8.0的条件下避光反应25h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3次得到纯度在99％的α-熊果苷，对苯二酚转化率达到92％。α-熊果苷的氢谱以及红外光谱分别如图4以及图5所示。
实施例8
制备维生素C葡萄糖苷的示意图如附图6所示。所用的蔗糖糖苷转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
(1)酶催化底物的精制：按质量比亚硫酸钠0.2g：工业级维生素C100g：活性炭5g：维生素C1g：水250g混合均匀，在70℃溶解，趁热过滤，然后结晶过滤后在50℃真空干燥4h；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖100mmol溶于1L水中配成溶液，加入抗氧剂维生素C1mmol，待溶解完全后，加入步骤(1)精制过的维生素C 50mmol和蔗糖糖苷转移酶1mmol，在60℃下于pH为6.0的条件下避光反应50h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3次得到纯度在99％的维生素C葡萄糖苷，对苯二酚转化率达到86％。维生素C葡萄糖苷的红外光谱分别如图7所示。
序列表
<110> 西安岳达生物科技股份有限公司
<120> 一种采用酶催化法制备糖苷的方法
<130> KLPI200008
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1953
<212> DNA
<213> Sucrose glycosyltransferase
<400> 1
atgctgaaag acgtgctcac ttctgaactg gcggcgcagg tacgagacgc cttcgatgat 60
gaccgtgacg ccgagacgtt cctgctgcgg ctggaacgct acggcgagga cctctgggag 120
agcctgcgcg cggtgtatgg cgaccaggtg agggccttgc cagggcgact gctggaagtc 180
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ctgcggcccg actggctgca acgtcccgag atggtgggct acgtcgccta caccgaccgt 300
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tactttcatc tcttccccga ccgcaggggg ccggacgctt ttgaagccac ccttcctgag 660
atctttcccg acttcgcgcc gggcaacttc tcgtgggacg aggagatcgg tgaaggcgag 720
gggggctggg tctggaccac cttcaacagc taccagtggg acctgaactg ggccaacccc 780
gacgtgtttc tggagtttgt ggacatcatc ctctacctcg ccaaccgggg cgtggaggtg 840
ttccggctgg atgcgatcgc cttcatctgg aagcggctgg gaaccgactg ccaaaaccag 900
ccggaagttc accacctcac gcgggcgctg cgggcagccg cgcgcatcgt cgcgcccgca 960
gtcgccttta aggccgaggc gatcgtggcg cccgccgacc tgatccacta cctgggcacc 1020
cgtgcgcacc acggcaaggt gagcgacatg gcctaccaca acagcctgat ggtgcagctg 1080
tggagtagcc tcgccagccg gaatacccgt ctctttgagg aggcactgcg ggcgtttccc 1140
cccaagccca cgagcacgac ctgggggctg tacgtccgct gtcacgacga catcggctgg 1200
gccatcagcg acgaggacgc ggcccgggcc ggattgaacg gcgcggcgca ccggcacttt 1260
ctctcggact tctacagcgg tcagtttccc ggctcctttg cgcgggggct ggtgtttcag 1320
tacaacccgg tgaacggcga ccggcgcatc agtggctcgg cggccagcct cgctgggctg 1380
gaggcagcgc tggaaaccgg ggacccgggc cgcatcgagg acgcggtgcg tcgcctgctg 1440
ctcctccaca cggtcattct cggcttcggc ggggtgccgc tgctgtacat gggcgacgaa 1500
ctcgccctgc tgaatgacta cgccttcgag gacgtgcccg aacacgcgcc ggacaaccgc 1560
tgggtgcatc gcccgcagat ggattgggcc ctcgcggagc gggtgcggca ggagccttcc 1620
tcgcccgccg gacgggtgaa cacgggcctg cgccacctcc tgcgggtgcg ccgcgatacc 1680
ccgcagctgc acgccagcat cgagagccag gtgctgccca gccccgattc gcgtgcgctt 1740
ctgctgcgcc gcgaccatcc cctcggcggg atggtgcagg tgtacaactt cagcgaggag 1800
acggtgatgc tgcccagcca tgttctgcgg gacgtgctgg gggaccacgt ccaggaccgg 1860
ctgagcggga gtgcctttcg cctagatcgg cccaccgttc gcctggaggg ctaccgggca 1920
ctgtggctga ccgccgggga ggctccagca taa 1953
<210> 2
<211> 650
<212> PRT
<213> Sucrose glycosyltransferase
<400> 2
Met Leu Lys Asp Val Leu Thr Ser Glu Leu Ala Ala Gln Val Arg Asp
1 5 10 15
Ala Phe Asp Asp Asp Arg Asp Ala Glu Thr Phe Leu Leu Arg Leu Glu
20 25 30
Arg Tyr Gly Glu Asp Leu Trp Glu Ser Leu Arg Ala Val Tyr Gly Asp
35 40 45
Gln Val Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Leu Glu Val Met Leu His Ala
50 55 60
Tyr His Ala Arg Pro Ala Glu Leu Arg Arg Leu Asp Glu Ala Arg Leu
65 70 75 80
Leu Arg Pro Asp Trp Leu Gln Arg Pro Glu Met Val Gly Tyr Val Ala
85 90 95
Tyr Thr Asp Arg Phe Ala Gly Thr Leu Lys Gly Val Glu Glu Arg Leu
100 105 110
Asp Tyr Leu Glu Gly Leu Gly Val Lys Tyr Leu His Leu Met Pro Leu
115 120 125
Leu Arg Pro Arg Glu Gly Glu Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Val Gln Asp
130 135 140
Tyr Arg Ala Val Arg Pro Asp Leu Gly Thr Met Asp Asp Leu Ser Ala
145 150 155 160
Leu Ala Arg Ala Leu Arg Gly Arg Gly Ile Ser Leu Val Leu Asp Leu
165 170 175
Val Leu Asn His Val Ala Arg Glu His Ala Trp Ala Gln Lys Ala Arg
180 185 190
Ala Gly Asp Pro Lys Tyr Arg Ala Tyr Phe His Leu Phe Pro Asp Arg
195 200 205
Arg Gly Pro Asp Ala Phe Glu Ala Thr Leu Pro Glu Ile Phe Pro Asp
210 215 220
Phe Ala Pro Gly Asn Phe Ser Trp Asp Glu Glu Ile Gly Glu Gly Glu
225 230 235 240
Gly Gly Trp Val Trp Thr Thr Phe Asn Ser Tyr Gln Trp Asp Leu Asn
245 250 255
Trp Ala Asn Pro Asp Val Phe Leu Glu Phe Val Asp Ile Ile Leu Tyr
260 265 270
Leu Ala Asn Arg Gly Val Glu Val Phe Arg Leu Asp Ala Ile Ala Phe
275 280 285
Ile Trp Lys Arg Leu Gly Thr Asp Cys Gln Asn Gln Pro Glu Val His
290 295 300
His Leu Thr Arg Ala Leu Arg Ala Ala Ala Arg Ile Val Ala Pro Ala
305 310 315 320
Val Ala Phe Lys Ala Glu Ala Ile Val Ala Pro Ala Asp Leu Ile His
325 330 335
Tyr Leu Gly Thr Arg Ala His His Gly Lys Val Ser Asp Met Ala Tyr
340 345 350
His Asn Ser Leu Met Val Gln Leu Trp Ser Ser Leu Ala Ser Arg Asn
355 360 365
Thr Arg Leu Phe Glu Glu Ala Leu Arg Ala Phe Pro Pro Lys Pro Thr
370 375 380
Ser Thr Thr Trp Gly Leu Tyr Val Arg Cys His Asp Asp Ile Gly Trp
385 390 395 400
Ala Ile Ser Asp Glu Asp Ala Ala Arg Ala Gly Leu Asn Gly Ala Ala
405 410 415
His Arg His Phe Leu Ser Asp Phe Tyr Ser Gly Gln Phe Pro Gly Ser
420 425 430
Phe Ala Arg Gly Leu Val Phe Gln Tyr Asn Pro Val Asn Gly Asp Arg
435 440 445
Arg Ile Ser Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ala Gly Leu Glu Ala Ala Leu
450 455 460
Glu Thr Gly Asp Pro Gly Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Arg Leu Leu
465 470 475 480
Leu Leu His Thr Val Ile Leu Gly Phe Gly Gly Val Pro Leu Leu Tyr
485 490 495
Met Gly Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asn Asp Tyr Ala Phe Glu Asp Val
500 505 510
Pro Glu His Ala Pro Asp Asn Arg Trp Val His Arg Pro Gln Met Asp
515 520 525
Trp Ala Leu Ala Glu Arg Val Arg Gln Glu Pro Ser Ser Pro Ala Gly
530 535 540
Arg Val Asn Thr Gly Leu Arg His Leu Leu Arg Val Arg Arg Asp Thr
545 550 555 560
Pro Gln Leu His Ala Ser Ile Glu Ser Gln Val Leu Pro Ser Pro Asp
565 570 575
Ser Arg Ala Leu Leu Leu Arg Arg Asp His Pro Leu Gly Gly Met Val
580 585 590
Gln Val Tyr Asn Phe Ser Glu Glu Thr Val Met Leu Pro Ser His Val
595 600 605
Leu Arg Asp Val Leu Gly Asp His Val Gln Asp Arg Leu Ser Gly Ser
610 615 620
Ala Phe Arg Leu Asp Arg Pro Thr Val Arg Leu Glu Gly Tyr Arg Ala
625 630 635 640
Leu Trp Leu Thr Ala Gly Glu Ala Pro Ala
645 650

Claims (8)

1.一种采用酶催化法制备糖苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)酶催化底物的精制：将亚硫酸钠、工业级酶催化底物、活性炭、维生素C以及水按质量比亚硫酸钠：工业级酶催化底物：活性炭：维生素C：水为1：500～1000：10～50：5～10：1000～1500混合均匀，在50～80℃溶解，趁热过滤，然后结晶过滤后在40～60℃真空干燥4～10h；其中，工业级酶催化底物为工业级对苯二酚或工业级维生素C；
(2)糖苷酶催化水解：将蔗糖溶于水中配成50～200mmol/L溶液，加入抗氧剂维生素C，待溶解完全后，加入精制过的酶催化底物和蔗糖糖苷转移酶，在30～40℃下于pH为5.0～8.0的条件下避光反应20～80h；用正丁醇萃取，浓缩得到糖苷粗产物；其中蔗糖糖苷转移酶：蔗糖：抗氧剂维生素C：精制过的酶催化底物的物质的量比为1：100～500：1～5：10～80；
(3)将步骤(2)得到的糖苷粗产物在水中重结晶3～5次得到纯度在98％以上的α-熊果苷或维生素C葡萄糖苷纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蔗糖糖苷转移酶的基因序列为SEQID No.1所示基因序列，或其基因序列与SEQ ID No.1所示的基因序列具备95％以上的同源性且能使对苯二酚与蔗糖反应生成α-熊果苷或使维生素C与蔗糖反应生成维生素C葡萄糖苷的酶的基因序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蔗糖糖苷转移酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，或其氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具备98％以上的同源性且能使对苯二酚与蔗糖反应生成α-熊果苷或使维生素C与蔗糖反应生成维生素C葡萄糖苷的酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蔗糖糖苷转移酶的生产细胞选自基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备α-熊果苷时，步骤(1)中，亚硫酸钠、工业级对苯二酚、活性炭、维生素C以及水的质量比为0.2：100：5：1：250。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备α-熊果苷时，步骤(2)中，将蔗糖溶于水中配成100mmol/L溶液，蔗糖糖苷转移酶：蔗糖：抗氧剂维生素C：精制过的酶催化底物对苯二酚的物质的量比为1：100：1：10。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备维生素C葡萄糖苷时，步骤(1)中，亚硫酸钠、工业级维生素C、活性炭、维生素C以及水的质量比为0.2：100：5：1：250。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备维生素C葡萄糖苷时，步骤(2)中，将蔗糖溶于水中配成100mmol/L溶液，蔗糖糖苷转移酶：蔗糖：抗氧剂维生素C：精制过的酶催化底物维生素C的物质的量比为1：100：1：50。
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