CN113073061B - 一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固定化细胞高效生产α‑熊果苷的方法，步骤如下：将大肠杆菌Escherichia coli IFE‑amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液，将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m3的发酵罐，经高密度发酵获得生产α‑熊果苷所用的酶催化剂(菌体)；利用湿菌体制备固定化细胞；利用固定化细胞进行催化反应获得成品。本发明方法利用固定化细胞生产α‑熊果苷，提高了α‑熊果苷的生产效率，缩短了工艺流程，降低了生产成本，减少了“三废排放”。

Description

一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法
技术领域
本发明属于α-熊果苷制备技术领域，具体涉及一种固定化细胞高效生产α- 熊果苷的方法。
背景技术
α-熊果苷，又名熊果素，化学式为C12H16O7，是一种由杜鹃花科植物熊果叶中萃取出的成分，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用，主要应用于化妆品中。
α-熊果苷，作为源自植物的天然酪氨酸结构类似物，能够有效抑制酪氨酸酶的活性，是一种天然、高效的酪氨酸酶抑制剂，目前已被广泛用于化妆品和医药领域：(1)在化妆品行业，α-熊果苷是一种重要的皮肤美白原料，作用机理如下所示，其不仅对皮肤的雀斑、老人斑、黄褐斑有消褪作用，而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合和粉刺等也颇有疗效；(2)在医药方面，α-熊果苷对于人体色素沉着病和黑色素瘤也具有特殊的疗效，是临床上应用最为广泛的治疗药物。
Figure BDA0003006929640000011
获得高催化活性的生物酶是实现α-熊果苷工业化生产的关键技术所在，但相关生产技术一直以来被国外化工巨头所垄断，如荷兰皇家帝斯曼集团。在生物法合成α-熊果苷方面，已有研究表明通过植物细胞培养技术，包括棘胸蛙、骆驼蓬人参等植物细胞培养物，以对苯二酚为底物，能合成细胞干重7％的α-熊果苷，对苯二酚转化率最高为80％。另外，更多研究着手于微生物的酶法转化生产α- 熊果苷。2002年，日本研究小组报道用野油菜黄单胞菌wu-9701冻干细胞作为生物催化剂，麦芽糖作为葡萄糖供体，对苯二酚的最大转化率为93％。2013年，也有国内课题组报道利用嗜麦芽黄单胞菌，以麦芽糖为糖基供体，α-熊果苷产量提高到30.6g/L，摩尔转化率达93.6％。可见，采用微生物细胞或相应的酶制剂法生产α-熊果苷，具有周期短、得率高和产率高的特点，可规模化生产。
在实际生产过程中，微生物酶制剂通过发酵获得，发酵废液中，含有大量的糖类、蛋白质等，排放的废水中COD含量较高，这大幅增加了该产品的生产成本。
发明内容
本发明针对上述缺陷，提供一种采用固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，该方法于固定化过程中加入甘油葡萄糖苷或海藻糖作为酶稳定剂，提高了制备得到的固定化细胞生产α-熊果苷过程中的利用批次和酶活力存活时间。
本发明提供如下技术方案：一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，包括以下步骤：
S1：将大肠杆菌Escherichia coli IFE-amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；
S2：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m3的发酵罐，向所述发酵罐中装入2.5m3的发酵培养基，于30℃～37℃，培养4h～6h后；加入α-乳糖，控制发酵温度在22℃～25℃，继续发酵12h～18h，得到生产α-熊果苷的催化剂，经高速离心，获得菌体，将所述菌体加0.9％生理盐水洗涤3次，得到的湿菌体，将所述湿菌体保存于-18℃备用；
S3：取0.1kg的湿菌体悬浮于0.5L生理盐水，加入20g甘油葡萄糖苷，形成的菌悬液与2L含有海藻酸钠的水溶液混匀，然后继续加入聚乙烯醇，充分混合后，将混合液缓慢喷雾至20L饱和硼酸溶液中，室温中放置12h使其硬化，倾去溶液部分，采用生理盐水洗涤3次得到的细胞，得到固定化细胞 (Immobilization cell-1)，于4℃冰箱保存备用；
S4：按S3所述步骤放大制备固定化细胞，取500kg固定化细胞，加入5t 去离子水，加入2.5t蔗糖，继续加入25kg对苯二酚，于30℃下反应，反应过程中，每隔1h添加20kg对苯二酚，共进行转化反应10h，在10h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物205kg，最终测定获得的α-熊果苷产量为491kg；
S5：反应结束后，将催化液静置，过100目筛网，滤液为浅黄色透明澄清液体，将所述滤液加入树脂柱，吸附产品，上样结束后，加入15m3纯水冲洗树脂，随后采用16m3、40％体积分数的乙醇洗涤，获得无色澄清洗脱液，其中含α-熊果苷478kg。进一步于60℃、-0.9MPa下减压浓缩，至α-熊果苷的质量分数含量为50％，降温结晶，同时保持搅拌，降温至室温后，通入5℃冷冻水，保温12h，得到结晶溶液；
S6：将所述结晶溶液经离心后，获得α-熊果苷固体，将所述α-熊果苷固体于70℃下真空干燥8h，最终获得α-熊果苷成品247kg。
进一步地，所述种子培养基的成分为含有5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、 8.9g/L的NaHPO4·12H2O、3.4g/L的KH2PO4、2.67g/L的NH4Cl、0.71g/L的 Na2SO4、0.49g/L的MgSO4·7H2O、50mg/L的卡那霉素的去离子水溶液。
进一步地，所述种子培养基的酸碱度为pH 7.0。
进一步地，所述发酵培养基的成分为含有10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母提取粉、15g/L甘油、9g/L Na2HPO4、3.4g/L KH2PO4、3g/L NH4Cl、0.71g/L Na2SO4、5g/L MgSO4的去离子水溶液。
进一步地，所述发酵培养基的酸碱度为pH 6.5-7.5。
进一步地，所述步骤S2中加入的α-乳糖的终浓度为5g/L-20g/L。
进一步地，所述S3步骤中加入海藻酸钠后的混合溶液中，所述海藻酸钠的终浓度为15g/L。
进一步地，所述S3步骤中加入聚乙烯醇后的混合溶液中，所述聚乙烯醇的终浓度为100g/L。
进一步地，采用HPLC测定所述S6步骤得到的α-熊果苷成品中，纯α-熊果苷的含量为99.1％。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，在细胞固定化过程中加入甘油葡萄糖苷或海藻糖作为酶稳定剂，提高了制备得到的固定化细胞生产α-熊果苷过程中的利用批次。
(2)本发明提供的固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法采用固定化细胞进行催化，降低了酶的生产成本、提高了酶的利用率、减少了因发酵产生的废水、废气及固废、减少了COD的排放。
(3)本发明提供的固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法大幅减少了高COD 废水的排放，原先技术排放废水中，总COD超过130000mg/L，现有技术排放废水COD约600mg/L，废水量大幅降低至原工艺的5％，大幅降低了污水处理压力。
(4)本发明提供的固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法缩短了工艺流程，减少了固液分离、膜处理等步骤；利用固定化细胞技术，可减少发酵批次，从而降低了发酵的成本及三废排放。另一方面，通过固定化细胞技术，进行生物催化，获得的催化液中杂质含量较少，对于后期的分离纯化优势较大，缩短了生产工艺，提升了生产效率。
(5)本发明提供的固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法可使生产成本大幅降低。
具体实施例方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1菌种的生产及固定化细胞的制备
本实施例提供一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，包括以下步骤：
S1：将大肠杆菌Escherichia coli IFE-amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；
S2：向发酵罐中装入2.5m3的发酵培养基，灭菌后将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m3的发酵罐，于30℃～37℃，培养4h～6h后；加入α-乳糖，控制发酵温度在22℃～25℃，继续发酵12h～18h，得到生产α-熊果苷的催化剂，经高速离心，获得菌体，将菌体加0.9％生理盐水洗涤3次，得到的湿菌体，将湿菌体保存于-18℃备用；
S3：取0.1kg的湿菌体悬浮于0.5L生理盐水，加入20g甘油葡萄糖苷，形成的菌悬液与2L含有海藻酸钠的水溶液混匀，然后继续加入聚乙烯醇，充分混合后，将混合液缓慢喷雾至20L饱和硼酸溶液中，室温中放置12h使其硬化，倾去溶液部分，采用生理盐水洗涤3次得到的细胞，得到固定化细胞 (Immobilization cell-1)，于4℃冰箱保存备用；
S4：按S3步骤放大制备固定化细胞，取500kg固定化细胞，加入5t去离子水，加入2.5t蔗糖，继续加入25kg对苯二酚，于30℃下反应，反应过程中，每隔1h添加20kg对苯二酚，共进行转化反应10h，在10h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物205kg，最终测定获得的α-熊果苷产量为491kg；
S5：反应结束后，将催化液静置，过100目筛网，滤液为浅黄色透明澄清液体，将滤液通入树脂柱(西安蓝晓科技新材料股份有限公司，采用3根树脂柱串联模式，每根树脂柱含4m3树脂)，吸附产品，上样结束后，加入15m3纯水冲洗树脂，随后采用16m3、40％体积分数的乙醇洗涤，获得无色澄清洗脱液，其中含α-熊果苷478kg。进一步于60℃、-0.9MPa下减压浓缩，至α-熊果苷的质量分数含量为50％，降温结晶，同时保持搅拌，降温至室温后，通入5℃冷冻水，保温12h，得到结晶溶液；
S6：将结晶溶液经离心后，获得α-熊果苷固体，将α-熊果苷固体于70℃下真空干燥8h，最终获得α-熊果苷成品247kg。
实施例2酶活力测试方法
将5g实施例1中的步骤S3制备得到的大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-amy637固定化细胞转移至100-mL烧杯，加入50mL去离子水，加入25g蔗糖，继续加入0.25g对苯二酚，30℃反应0.5h，产生的α-熊果苷量(g/L)的数值即为酶活。经测定IC-1催化1h后产生α-熊果苷的浓度为8.8g/L，即酶活为8.8。
实施例3细胞稳定剂在固定化细胞的制备过程中的应用
将0.1kg湿菌体悬浮于0.5L生理盐水中，加入5g甘油葡萄糖苷，形成的菌悬液与2L海藻酸钠溶液混匀，海藻酸钠终质量浓度为15g/L，继续加入聚乙烯醇，使其浓度达到100g/L，充分混合后，将混合液缓慢喷雾至20L饱和硼酸溶液中，室温中放置12h使其硬化。倾去溶液部分，生理盐水洗涤3次，于4℃冰箱保存备用，编号IC-2。测定其酶活为9.6。
实施例4
按实施例1中的步骤S3制备得到固定化细胞，将甘油葡萄糖苷分别用甘油、葡萄糖、壳聚糖、海藻糖、低聚果胶(常见的糖类酶稳定剂)替代然后进行实验，编号IC-3至IC-7。酶活测定结果如下表：
Figure BDA0003006929640000061
Figure BDA0003006929640000071
从上表可见，在常见的酶稳定剂中，仅有甘油葡萄糖苷和海藻糖对酶活有促进作用，甘油葡萄糖苷具有更好的效果。
实施例5添加量优化
按实施例1中的步骤S3制备得到固定化细胞，加入甘油葡萄糖苷的量分别为1g、10g、20g、30g、40g、50g，获得固定化细胞，分别编号IC-8至IC-13。
固定化细胞编号 酶活
IC-8 8.8
IC-9 9.7
IC-10 10.5
IC-11 10.6
IC-12 10.6
IC-13 10.5
从上表可见，当甘油葡萄糖苷加量超过到30g时，酶活力提升效果已不明显。
实施例6催化反应方法
按以上方法，放大制备固定化细胞IC-10 500kg，加入5t去离子水，加入 2.5t蔗糖，继续加入25kg对苯二酚，30℃反应，反应过程中，每隔1h，每隔1 h添加20kg对苯二酚。在10h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物205kg。最终测定获得的α-熊果苷产量为491kg。
反应结束后，将催化液静置，过100目筛网，滤液为浅黄色透明澄清液体，加入树脂柱(西安蓝晓科技新材料股份有限公司，采用3根树脂柱串联模式，每根树脂柱含4m3树脂)，吸附产品，上样结束后，加入15m3纯水冲洗树脂，随后采用16m3，40％乙醇洗涤，获得无色澄清洗脱液，其中含α-熊果苷478kg。进一步经减压浓缩(60℃，-0.9MPa)，至α-熊果苷含量50％，降温结晶，同时保持搅拌，降温至室温后，通入冷冻水(5℃)，保温12h。将结晶溶液经离心后，获得α-熊果苷固体，70℃真空干燥8h，最终获得成品247kg，采用HPLC测定其含量为99.1％。
实施例7对照实验：采用菌体直接催化的工艺
将80kg菌体(与实施例6中加入的固定化细胞酶活力等同)，加入5t去离子水，加入2.5t蔗糖，继续加入25kg对苯二酚，30℃反应，反应过程中，每隔 1h，每隔1h添加20kg对苯二酚。在10h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物205kg。最终测定获得的α-熊果苷产量为503kg。
采用陶瓷膜过滤，获得深褐色清液，清液进入树脂柱(西安蓝晓科技新材料股份有限公司，采用3根树脂柱串联模式，每根树脂柱含4m3树脂)，吸附产品，上样结束后，加入15m3纯水冲洗树脂，随后采用16m3，40％乙醇洗涤，获得棕色澄清洗脱液；由于存在色素，进一步过超滤膜处理，洗脱液由棕色变为黄色，进一步过脱色树脂柱(LX98，西安蓝晓科技新材料股份有限公司，2m3)，得到淡黄色溶液，随后按实施例6进行浓缩结晶处理，得到最终获得成品255kg，采用HPLC测定其含量为98.7％。
对比实施例6和实施例7，实施例6中，工艺更为简单，省去了陶瓷膜除菌体步骤，直接过滤即可获得清液，同时避免了超滤和脱色树脂脱色工段，所得产品纯度也较高。另一方面，也大幅减少了发酵过程和分离过程中，废水的排放，以及超滤和脱色树脂再生所产生的废水。
实施例8
将实施例6中得到的固定化细胞IC-10重复催化使用，每批次使用结束后，按实施例3测定其酶活力，当重复使用3次后，酶活力结果为10.1。
将IC-1按实施例6方法重复使用，每批次使用结束后，按实施例3测定其酶活力，当重复使用3次后，酶活力结果降为6.2，已不可继续使用，可见甘油葡萄糖苷的加入，可促进固定化细胞保持酶活力。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (9)

1.一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将大肠杆菌Escherichia coli IFE-amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；
S2：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m3的发酵罐，向所述发酵罐中装入2.5m3的发酵培养基，于30℃～37℃，培养4h～6h后；加入α-乳糖，控制发酵温度在22℃～25℃，继续发酵12h～18h，得到生产α-熊果苷的催化剂，经高速离心，获得菌体，将所述菌体加0.9％生理盐水洗涤3次，得到湿菌体，将所述湿菌体保存于-18℃备用；
S3：取0.1kg的湿菌体悬浮于0.5L生理盐水，加入20g酶稳定剂，形成的菌悬液与2L含有海藻酸钠的水溶液混匀，然后继续加入聚乙烯醇，充分混合后，将混合液缓慢喷雾至20L饱和硼酸溶液中，室温中放置12h使其硬化，倾去溶液部分，采用生理盐水洗涤3次得到的细胞，得到固定化细胞，于4℃冰箱保存备用；所述S3步骤中的酶稳定剂为甘油葡萄糖苷；
S4：按S3步骤放大制备固定化细胞，取500kg固定化细胞，加入5t去离子水，加入2.5t蔗糖，继续加入25kg对苯二酚，于30℃下反应，反应过程中，每隔1h添加20kg对苯二酚，共进行转化反应10h，在10h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物205kg，最终测定获得491kg的α-熊果苷；
S5：反应结束后，将催化液静置，过100目筛网，滤液为浅黄色透明澄清液体，将所述滤液通入树脂柱，吸附产品，上样结束后，加入15m3纯水冲洗树脂，随后采用16m3、40％体积分数的乙醇洗涤，获得无色澄清洗脱液，其中含α-熊果苷478kg；进一步于60℃、-0.9MPa下减压浓缩，至α-熊果苷的质量分数含量为50％，降温结晶，同时保持搅拌，降温至室温后，通入5℃冷冻水，保温12h，得到结晶溶液；
S6：将所述结晶溶液经离心后，获得α-熊果苷固体，将所述α-熊果苷固体于70℃下真空干燥8h，最终获得247kg的α-熊果苷成品。
2.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述种子培养基的成分为含有5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、8.9g/L的NaHPO4·12H2O、3.4g/L的KH2PO4、2.67g/L的NH4Cl、0.71g/L的Na2SO4、0.49g/L的MgSO4·7H2O、50mg/L的卡那霉素的去离子水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述种子培养基的酸碱度为pH 7.0。
4.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为含有10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母提取粉、15g/L甘油、9g/L Na2HPO4、3.4g/L KH2PO4、3g/L NH4Cl、0.71g/L Na2SO4、5g/L MgSO4的去离子水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述发酵培养基的酸碱度为pH 6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述步骤S2中加入的α-乳糖的终浓度为5g/L-20g/L。
7.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述S3步骤中加入海藻酸钠后的混合溶液中，所述海藻酸钠的终浓度为15g/L。
8.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述S3步骤中加入聚乙烯醇后的混合溶液中，所述聚乙烯醇的终浓度为100g/L。
9.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，采用HPLC测定所述S6步骤得到的α-熊果苷成品中，纯α-熊果苷的含量为99.1％。
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