KR101740968B1 - L-글루탐산의 유가식 공급을 통한 유산균으로부터의 가바 생산방법 - Google Patents

L-글루탐산의 유가식 공급을 통한 유산균으로부터의 가바 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감마 아미노 부틸산 (이하, '가바'라 함)을 제조하는 방법에 관한 것으로, 유산균을 L-글루탐산이 함유된 배지에서 배양하고 일정시간이 경과한 후, pH에 연동하여 고체상태의 글루탐산을 유가식으로 투입함으로써, 고농도, 고순도의 가바를 효율적으로 제조할 수 있다.

Description

L-글루탐산의 유가식 공급을 통한 유산균으로부터의 가바 생산방법 {Method for production of GABA with lactic acid bacteria through L-glutamic acid feeding}
본 발명은 글루탐산을 유가식으로 투입하여 유산균으로부터 고농도의 감마 아미노 부틸산 (이하, '가바'라 함)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 유산균을 L-글루탐산이 함유된 배지에서 배양하고 일정시간이 경과한 후, pH에 연동하여 고체상태의 글루탐산을 유가식으로 투입함으로써, 고농도, 고순도의 가바를 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
'가바'는 '감마 아미노 부틸산(γ-Aminobutyric acid ; GABA)'의 줄임말로서, 비단백질 구성 아미노산이며, L-글루탐산의 α-탄소에 결합되어 있는 -COOH가 글루탐산 데카르복실라아제 (Glutamic cid decarboxylase, GAD)의 촉매작용에 의해 탈탄산되어 만들어진다.
가바는 사람의 신경계, 혈액에 함유되어 있으며, 대부분은 뇌의 골수에 존재하여 아세틸콜린(acetylcholine)이라 불리는 신경전달물질을 증가시키고, 뇌기능을 촉진시키는 등의 생리작용을 한다. 또한, 오래전부터 혈압저하작용, 이뇨작용, 항우울, 항산화, 체중감소, 알콜중독치료 등의 용도가 알려져 왔다. 가바는 사람 이외의 고등동물, 무척추 동물 및 곤충 등에서도 신경전달 물질로 작용하는데, 식물계에 널리 분포되어 있고, 식물체 대부분의 조직에서 발견된다.
한편, 가바를 공업적으로 제조하는 방법은 합성법, 효소법, 발효법 등이 있다.
'합성법'은 반응이 간편하고 비용이 다른 방법에 비해 저렴하다는 장점이 있으나, 사용하는 용매가 식품의 용도로는 적합하지 않은 경우가 많아 사료용으로만 사용이 국한되는 단점이 있다.
'효소법'은 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)의 촉매작용을 이용하여, L-글루탐산 (L-Glutamic acid, 이하 GA)를 탈탄산하여 가바로 전환시키는 방법이다. 효소는 정제효소를 사용할 수도 있고, 유산균을 배양한 후 세포막을 파괴하여 수득한 GAD 함유 조효소액을 사용할 수도 있다. 이때, 외래 미생물 유래의 GAD를 대장균에서 대량 발현시킨 후 조효소액을 회수함으로써, 효소의 생산비용을 획기적으로 절감할 수도 있다. 하지만, 유전자 재조합 균주로부터 유래한 효소를 식품에 사용할 경우, 안전성 검증 및 관계 기관의 허가를 받아야 하는 등의 번거로움이 있어 크게 바람직하지는 않다.
한편, '발효법'은 미생물의 발효를 통해 가바를 생산하는 것인데, 유산균을 이용한 발효법이 대표적이다. 유산균은 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 인정되어 있으므로, 유산균 발효를 이용하여 생산한 가바는 식품의 용도로 사용함에 있어 제약이 없는 큰 장점이 있다.
유산균 발효를 이용한 방법 역시, 유산균 배양을 통해 생성된 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)을 이용하는데, 외부로부터 L-글루탐산(GA)을 기질로 투입하여 가바를 얻게 된다. 대부분의 유산균은 GAD 효소를 보유하고 있는데, 그중에서도 특히 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 GAD활성이 높은 균이 많다(대한민국 특허 제10-0631857호). 락토바실러스가 만들어 내는 GAD는 세포 내에 존재하는데, GA가 세포막을 투과하여 세포 내에 들어가서 GAD에 의하여 가바로 전환되고, 전환된 가바가 GA와 1:1로 교환되는 형식으로, 세포 밖으로 배출되는 과정을 거친다.
한편, 종래에 고농도 및 고순도의 가바를 얻기 위한 방법으로, 효소반응에 의해 L-글루탐산을 감마 아미노 부틸산으로 전환시키고, 감마 아미노 부틸산이 고농도로 함유된 반응액을 정제하여 고순도의 감마 아미노 부틸산을 제조하는 방법이 알려져 있다 (대한민국 특허 제10-0857215호). 그러나, 이 방법은 세포막을 파쇄하거나 정제된 효소를 사용해야 하며, 반응시간이 길어지면 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)의 역가가 급격히 떨어지므로 단기간에 효소반응을 완결시켜야 하는 단점이 있다.
한편, 유산균 발효를 이용한 가바의 생산은 세포막 파쇄의 필요가 없고, 식품에 사용할 수 있는 큰 장점이 있는데, 경제적으로 고농도의 가바를 생산하기 위해서는 데카르복실라제의 기질이 되는 L-글루탐산(GA)이나 글루탐산소다(MSG)를 배양 초기 혹은 배양 도중에 다량으로 첨가해야 한다. 유가식 배양을 위해서는 통상적으로 기질을 물에 녹여 수용액상태로 발효기에 공급한다. 그런데, 상온에서 L-글루탐산(GA)의 용해도는 3g/l 정도로 낮아, 고농도의 피딩액 용액 (feeding solution)의 공급이 요구되는 유가식 배양을 수행할 수 없다. 따라서, 생산성 및 경제성이 낮은 문제를 수반할 수밖에 없는 근본적인 문제점이 있다.
이에 용해도가 높은 글루탐산소다(MSG)를 L-글루탐산(GA)에 대한 대안으로 발효 중 수 회 투입하는 경우가 있었으나, 60시간 동안에 생성된 가바의 양은 11.1%에 불과하였다(Haixing Li et. al., Microbial Cell Factories - MICROB CELL FACT , vol. 9, no. 1, pp. 85-7, 2010).
상기 논문에서 GA 대신 MSG를 사용한 이유는 MSG의 물에 대한 용해도가 740g/l로 높아 멸균된 액체상태로 투입 가능할 수 있는 장점이 있기 때문이다. 일반적으로, GA가 가바로 전환되는 과정에 이산화탄소가 발생하면, 배양액의 pH가 6.0 이상으로 상승하여, 가바로 전환반응이 정지되거나 감속되는데, 전환반응을 지속시키려면 배양액의 pH를 5.0 근방으로 낮춰야 한다. 그런데, MSG를 투입할 경우 pH가 오히려 증가하여 추가적으로 산을 투입해야 한다. 하지만, 산을 투입하여 반응액의 pH를 맞추면, 생성되는 가바의 함량에 비례하여, 염이 다량으로 생성되기 때문에 고농도 또는 고순도의 가바를 얻을 수 없다.
또한, 이 방법은 생성된 염을 제거하기 위하여 이온교환수지 공정, 재결정과 같은 정제공정이 부수적으로 필요하게 되고, 수율 저하, 폐수 발생 등과 같은 문제를 수반하게 되므로, 생산성이 저하되는 큰 문제를 안고 있는 것이다. 즉, 기존의 유산균 발효를 이용한 방법에서는 고형분 중의 가바의 함량이 50%를 넘을 수 없었고, 대부분 순도가 20%를 넘지 못하였던 것이다.
본 출원인이 등록받은 대한민국 특허 제10-0857215호(등록일자 2008.09.01)에는, 효소반응에 의해 L-글루타민산을 감마 아미노 부틸산으로 전환시키고, 감마 아미노 부틸산이 고농도로 함유된 반응액을 정제하여 고순도의 감마 아미노 부틸산을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명은 유산균 발효를 이용함으로써, 식품에 사용이 적합하고, 고농도이면서 고순도의 가바를 효율적으로 제조하기 위한 것으로, 유산균이 살아 있거나 휴지기 시점에서, 비교적 장기간에 걸쳐 pH에 연동하여, '고체상태'의 L-글루탐산(GA)을 유가식으로 첨가함으로써, 고농도, 고순도의 가바를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 배지에 유산균을 접종하여 배양함으로써 감마 아미노 부틸산(γ-Aminobutyric acid ; GABA)을 생산함에 있어서, 상기 배양은, 배양 중, 고체상태의 L-글루탐산을 지속적 또는 간헐적으로 배지에 공급하고, 배지의 pH를 3.5~6.0으로 유지하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법을 제공한다. 도 1은 본 발명의 가바의 제조공정도를 나타내는데, 종래 유산균 발효를 이용한 가바 제품의 경우, 가바 함량이 20%에 불과하나, 본 발명의 고체상태 L-글루탐산 공급에 의한 유가식 배양을 이용하면, 함량 80~99%의 가바 제품을 효율적으로 제조할 수 있다.
본 발명에서와 같이 배지의 pH가 3.5~6.0으로 유지되는 경우, 유산균은 L-글루탐산을 균체 내로 흡수하는데, 흡수된 L-글루탐산은 균체 내에 존재하는 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)에 의해 가바로 전환한 후, 균체 외부로 배출된다. pH 3.5~6.0은 산성 조건으로, 이 범위의 pH에서는 다른 오염균들의 생육이 원활하지 못하다. 따라서, 용해도가 아주 낮은 'L-글루탐산'을 액체상태가 아닌 고체상태 (바람직하게는 분말)로 배지에 공급해도 배양액의 오염이 발생하지 않는 것이다.
L-글루탐산(GA)을 액상이 아닌 고체 상태로 배지에 첨가할 수 있는 것은 생산성 측면에서 큰 장점인데, 바로 유가식 배양이 가능하기 때문이다. 유가식 배양이라 함은 배양 중 기질을 지속적 또는 간헐적으로 배지에 공급하여 그에 따른 반응물의 생산을 극대화하는 배양 방법인데, 반응물의 생산을 극대화하기 위해서는 기질을 배지 중에 계속 공급해야 한다. 일반적인 유가식 배양의 경우, 오염 문제 때문에 기질을 고농도로 용액(물)에 녹여 멸균한 후, 멸균상태로 배지에 공급한다.
그런데, 'L-글루탐산'의 경우, 용해도가 현저히 낮기 때문에, 액상으로 유가식 피딩(feeding)할 수 없는 문제가 있다. 하지만, 본 발명의 경우, 배양 중 배양액의 pH가 3.5~6.0의 산성 상태로 유지되기 때문에, 균주 오염에 대한 부담이 적어, L-글루탐산을 고체상태로 공급할 수 있는 것이다. 하기 본 발명의 실험을 통해 균주 오염이 최소화된 상태에서 고체상태의 L-글루탐산을 기질로 사용하여 가바를 고농도로 생산할 수 있음이 확인되었다.
또한, 본 발명에서는 L-글루탐산을 첨가함으로써 배지의 pH가 자동적으로 낮아지기 때문에, 별도의 산(acid) 첨가 없이도, 유산균이 L-글루탐산의 가바로의 전환을 지속할 수 있다. 즉, 유산균이 L-글루탐산을 가바로 전환하기 위해서는 pH가 3.5~6.0의 산성 상태로 유지되어야 하는데, 본 발명에서와 같이 L-글루탐산을 넣으면 pH가 자연스럽게 떨어지기 때문에, 별도의 산을 배지 중에 첨가할 필요가 없는 것이다.
본 발명에서는 유산균을 사용하는데, 유산균은 식품 적합성이 확인된 균주이기 때문에 어느 것을 사용하여도 무방하다. 다만, 바람직하게는 높은 활성의 데카르복실라아제(GAD)를 발현하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균을 사용하면 좋다. 이때, 상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균은 일 예로, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 힐가르디 (Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 배지는 유산균이 생육할 수 있는 배지라면 어느 것을 사용하여도 무방하다. 다만, 유산균 균체 내 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)의 생성을 유도하기 위해, 배양 개시 전 글루탐산(GA) 또는 글루탐산염이 이미 배지에 첨가되어 있는 것이 좋다. 배지에 첨가되는 글루탐산염은 나트륨염 외에도 K, 암모늄염이 이용될 수 있다. 배지 중에 첨가하는 GA 또는 'GA염의 GA 상당량'은 1.0~6.0%(w/v)가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 3.0~4.0%(w/v)이 좋다. GA농도가 1.0%(w/v)보다 낮으면 GAD 발현량이 상대적으로 낮고, 6.0%(w/v)보다 높으면 균의 생육이 저해되기 때문이다.
본 발명의 감마 아미노 부틸산의 생산방법에 있어서, 상기 고체상태의 L-글루탐산은, 바람직하게 유산균이 배양되어 균체 농도가 OD600 (600nm에서의 optical density) 값으로 4를 넘었을 때, 배지 중에 공급하는 것이 좋다. 즉, 유산균의 균체농도를 흡광도로 측정시, 채취한 배양액을 20배 희석하여 파장 600 nm에서 측정한 OD600의 흡광도 값이 0.2 이상이면 좋은 것이다. 균체농도 OD600 값이 4보다 낮은 상태에서 L-글루탐산이 공급되면, 가바 생성능이 떨어져 바람직하지 않기 때문이다.
한편, 본 발명에 의할 경우, 유산균의 균체 농도가 OD600 값이 4 이상의 농도에 도달하면 외부로부터의 오염에 강한 것으로 나타났으며, 3~5일간에 걸쳐 개방된 상태에서 GA를 투입해도 오염으로 인한 문제는 발견되지 않았다. 이는 유산균이 생산하는 박테리오신(bacteriocin), 유산균의 오염에 대한 저항성, 낮은 pH, 고농도의 L-글루탐산(GA) 및 가바에 기인하는 것으로 추정된다.
한편, L-글루탐산의 공급은 더욱 바람직하게는 OD600 값이 6~24, 더욱더 바람직하게는 OD600 값이 6~16 일 때 하는 것이 좋은데, OD600 값이 너무 높은 상태에서 L-글루탐산이 공급되면, 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)의 비활성(specific activity)이 낮게 되고, 발효기간이 길어져 실익이 없기 때문이다.
20배로 희석하여 측정하여 얻은 OD600 값 1.0은 유산균의 종류, 생육 상태에 다르나, 일반적으로 습균체(wet cell mass) 20~30g/l에 해당한다.
본 발명의 감마 아미노 부틸산의 생산방법에 있어서, 상기 배양은 바람직하게 고체상태의 L-글루탐산을 첨가함으로써, 배양 중 배지의 pH를 3.5~6.0으로 유지하는 것이 좋다. 유산균 균체의 성장과 GAD의 최적 pH가 4.5~5 근방임을 고려하면 배양시 pH 범위는 3.5~6.0가 바람직한 것이다.
본 발명에서는 유산균이 정해진 균체농도 (OD600 값 4 이상)에 도달하면, L-글루탐산(GA)을 투입하는 것이 좋은데, 발효기의 맨홀이나 노즐을 열고 고체상태의 GA를 투입하여 pH가 3.5~6.0 (바람직하게는 4.6~5.0)이 되도록 맞춘다. 투입한 GA가 가바로 전환되면 이산화탄소가 발생하여 배출되고 pH는 점점 올라가게 되는데, pH가 6.0을 넘으면 (더 바람직하게는 pH가 5.0을 넘으면), 다시 GA를 투입하여 pH를 낮추는 것이 좋다. 적어도 pH를 6.0 이하로 낮춰야 L-글루탐산의 가바로의 전환을 유도할 수 있기 때문이다.
L-글루탐산(GA)의 총 투입량은 초기 배양액 양 기준 150~600g/l가 좋고, 바람직하게는 300~500g/l이 좋다. GA 투입량이 150g/l보다 적으면 경제성이 떨어지고, GA 투입량이 600g/l를 넘으면 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)의 활성이 현저히 저하되어 전환에 걸리는 시간이 너무 길어지게 된다.
GA의 총 투입량이 약 150g/l 이상이 되면, 유산균은 성장을 멈추고 휴지기에 들어간다. GA의 총투입량이 400g/l 이상이 되면 유산균은 사멸을 시작하고, 600g/l를 넘으면 유산균이 거의 사멸하게 된다. 본 발명에 의할 경우, 유산균이 사멸하는 시점과 GA의 가바로의 전환속도가 급격히 감소하는 시점은 대략 일치한 것으로 나타났다.
GA의 투입기간은 유산균의 종류와 생육상태에 따라 차이가 있으나, 18~96시간에 걸쳐서 투입하는 것이 좋고, 바람직하게는 36~72시간에 걸쳐 투입하는 것이 좋다. 시간이 경과하면 가바가 축적되고, 축적됨에 따라 GA의 가바로의 전환속도는 점차 저하된다.
GA를 투입하는 방법은 작업자에 의해 수차례에 걸쳐 수동으로 할 수도 있고, 도 3에 나타내는 바와 같이 호파, 로타리밸브, 피더, 제어장치로 이루어지는 시스템을 구성하여 자동화할 수도 있다. 도 3은 고체상태의 글루탐산 분말을 pH와 연동하여 자동으로 공급하는 장치의 모식적 그림을 나타낸다.
본 발명의 감마 아미노 부틸산의 생산방법은 L-글루탐산의 공급이 종료된 후, 배양액을 살균하고, 분무건조하는 과정을 더 포함할 수 있다. 이때, 살균 후, 분무건조 전에, 여과를 통해 유산균 균체를 제거하는 과정을 더 포함할 수 있다. 고순도의 가바가 필요하지 않고 제품 중에 소량의 L-글루탐산(GA)이 남아 있어도 상관없을 경우, 살균한 후 바로 분무건조하여 분말 제품을 얻거나, 결정형 제품을 얻을 수 있다. 이때, 가바 함량 80% 이상, 잔류 GA 10% 이하인 분말 또는 결정성 분말을 얻을 수 있다.
본 발명의 감마 아미노 부틸산의 생산방법은 L-글루탐산의 공급이 종료된 후, 산을 추가로 첨가하는 과정을 더 포함할 수 있다. 이를 통해 배양액 중 미반응 GA의 농도를 낮춤으로써 가바의 순도를 높일 수 있는데, 상기 산은 일 예로, 무기산 또는 유기산일 수 있다. 또한, 산을 추가하여 미반응 글루탐산을 가바로 전환한 후, 배양액을 살균하고, 분무 건조하는 과정을 더 포함할 수도 있다. 또한, 살균 후, 분무 건조 전에 여과를 통해 유산균 균체를 제거하는 과정을 더욱더 포함할 수도 있다.
산(acid)은 글루탐산 데카르복실라아제(GAD)에 의한 가바로의 전환 속도가 느려진 발효 말기에 투입하는 것이 좋은데, L-글루탐산(GA)의 가바로의 전환속도가 대략적으로 '4.5g/l/시간'이하로 되었을 때 투입하는 것이 좋다. 이때, GA 투입을 중단하고, 대신 산을 투입하여, pH를 4.5~5.3으로 낮춤으로써 배양액 중 남아 있는 GA의 가바로의 전환반응을 촉진시키는 것이다. 산은 무기산, 유기산 모두 사용할 수 있다. 무기산의 구체적인 예로는 염산, 황산, 초산, 인산 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있고, 유기산의 구체적인 예로는 L-아스파라긴산, 알파케토글루타릴산, 젖산, 구연산, 주석산, 푸마르산, 말산, 이타콘산, 초산, 글루콘산, 2-케토글루콘산, 5-케토글루콘산, 코지산 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있다.
가바로의 전환에 따라 pH가 상승하여 5.3~5.8이 되면, 다시 산을 투입하여 pH를 낮추는 것이 좋다. 이와 같이 하여 pH가 더 이상 상승하지 않을 때까지 산을 투입한다. 더 이상 pH가 상승하지 않을 때의 잔류 GA 농도는 0.2~1.2%(w/v), 가바 농도는 투입한 GA 총량에 따라 다르나 100~400g/l 이었다. 이 농도에서는 1~2회의 결정화 조작만으로 순도 98% 이상의 가바를 손쉽게 얻을 수 있다. 정제 공정의 예는 특허 10-0857215에 공개되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 즉, 살균, 균체의 제거, 탈색, 농축, 결정화를 거쳐 가바 함량 98% 이상의 고순도의 가바 제품을 얻을 수 있는 것이다.
본 발명에 의하면, 고체상태의 L-글루탐산(GA)을 유가식으로 첨가하는 유산균 발효를 통해, 식품에 사용이 적합하면서도, 고농도 또는 고순도의 가바를 효율적이며 경제적으로 제조할 수 있다.
도 1은 본 발명 가바의 제조공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 있어서, 시간의 경과에 따른 유산균 배양 패턴과 가바 생성 패턴을 보여준다.
도 3은 고체상태의 글루탐산 분말을 pH와 연동하여 자동으로 공급하는 장치의 모식적 그림을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에 있어서, 시간의 경과에 따른 유산균 배양 패턴과 고체상태의 글루탐산 분말의 유가식 투입 패턴 및 가바 생성 패턴을 보여준다.
도 5는 본 발명의 실시예 4에 있어서, 시간의 경과에 따른 유산균 배양 패턴과 글루탐산소다(MSG)의 유가식 투입 패턴 및 가바 생성 패턴을 보여준다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 락토바실러스 브레비스 ( Lactobacillus brevis ) OPK3 ( KCCM 80047)의 배양]
락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) OPK3 (KCCM 80047)는 김치에서 분리한 유산균으로 가바 생성능이 우수한 특허 균주이다 (대한민국 특허 제10-0631857호).
1L 삼각 플라스크에 500ml의 MRS 배지를 조제한 후, 섭씨 120도에서 15분간 살균 후 냉각한 다음, 여기에 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) OPK3 (KCCM 80047) 균주를 접종한 후, 35℃에서 15시간 정치배양하여 종균을 얻었다.
한편, 실험에 사용할 30L 발효기에, 초기 GA 농도 (표 1)에 따른 GA가 포함된 MRS배지 15L를 계량하고, 해당 pH (표 1)로 조절한 후 살균하였다. 이어, 배지를 냉각하고 종균을 접종하여, 32℃, 회전수 100rpm에서 혐기적 상태로 18시간 배양하였다. 배양온도는 35℃이었고, 배양 pH와 초기 GA 농도에 따른 접종 후 18시간 경과의 배양 결과는 표 1과 같았다.
락토바실러스 브레비스 OPK3 (KCCM 80047)의 배양시, pH와 '배지 중 초기 GA'에 따른 균체 성장과 잔류 GA 농도의 비교

배양 pH (GA 농도=3.5%(w/v)) 초기 GA 농도 (pH=5.0)
4.0 5.0 6.0 2%(w/v) 3.5%(w/v) 5%(w/v)
습균체 농도(g/l) 16.8 14.3 18.4 14.9 14.3 12.9
잔류 GA 농도 (g/l) 1.5% 0.5% 2.0% 0.2% 0.5% 1.3%
[ 실시예 2: 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum )의 배양]
1L 삼각 플라스크에 500ml의 MRS 배지를 조제한 후, 섭씨 120도에서 15분간 살균하고, 냉각한 다음 여기에 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 균주를 접종하고, 35℃에서 15시간 정치배양하였다.
이와는 별도로 30L 발효기에 GA 1%(w/v)가 포함된 MRS배지 15L를 조제하여 살균하였다. 배지를 냉각한 후 종균을 접종하여 35℃, 초기 pH 6.0에서 회전수 100rpm으로 혐기적 상태에서 18시간 동안 배양하였다.
배양 결과, 습균체 농도 12g/l, 가바 농도 1800㎎/l를 얻었다 (도 2). 도 2는 본 발명의 실시예 2에 있어서, 시간의 경과에 따른 유산균 배양 패턴과 가바 생성 패턴을 나타낸 것이다.
[ 실시예 3: L-글루탐산( GA )의 유가식 투입에 의한 고농도 가바의 생성예 1]
상기 실시예 1에서 제조한 것과 동일한 방법으로 종균 배지 500ml를 조제한 후, 락토바실러스 브레비스 OPK3 (KCCM 80047)을 접종하여 35℃에서 15시간 동안 정치배양하였다. 30L 발효기에 GA 농도 3.5%(w/v)가 포함된 MRS배지 15L를 실시예 1과 동일한 방법으로 조제, 살균 및 냉각한 다음, 미리 배양한 종균을 접종하여 35℃, 초기 pH 6.0에서 회전수 100rpm으로 혐기적 상태에서 배양을 개시하였다.
배양 18시간 후부터 고체상태의 L-글루탐산(GA)을 다시 투입하여 pH 5.0 부근에서 투입을 중단하였고, pH가 상승하여 5.5 부근에 도달하면 다시 GA를 투입하였다. 이와 같은 과정을 반복하다가 배양 개시 64시간 후, 발효를 종료하였다.
발효시간의 경과에 따른 pH, 균체량, 가바 생성량 등을 도 4에 나타냈다. 도 4는 본 발명의 실시예 3에 있어서, 시간의 경과에 따른 유산균 배양 패턴과 고체상태의 글루탐산 분말의 유가식 투입 패턴 및 가바 생성 패턴을 보여준다. 최종 발효액량은 17.6리터가 되었다. 총 투입 GA량은 5100g이며 생성된 GABA는 3478g 이었다.
[ 실시예 4: 글루탐산소다(MSG)의 유가식 투입에 따른 가바의 생성]
상기 실시예 3과 동일한 방법으로, 30L 발효기에 GA 3.5%(w/v)가 포함된 MRS배지 15리터를 조제한 후, 여기에 미리 배양한 종균(락토바실러스 브레비스 OPK3 (KCCM 80047)) 500ml을 접종하였다. 접종 18시간 후부터 고체상태의 MSG(Monosodium glutamate)를 투입하였다. 배양 중 pH가 상승함에 따라, 2N 황산을 사용하여 pH를 5.0으로 자동 조절하였다. 배양 개시 64시간 후, 발효를 종료하였다.
최종 발효액 양은 약 19.1L가 되었다. 총 투입 MSG 양은 5,595g (GA 양으로 환산시 4,400g)이었으며, 생성된 GABA는 2253g 이었다 (도 5). 도 5는 본 발명의 실시예 4에 있어서, 시간의 경과에 따른 유산균 배양 패턴과 글루탐산소다(MSG)의 유가식 투입 패턴 및 가바 생성 패턴을 보여준다.
[ 실시예 5: L-글루탐산( GA )의 유가식 투입에 의한 고농도 가바의 생성예 2]
실시예 1에서 제조한 것과 동일한 방법으로 종균 배지 500ml를 조제한 후, 락토바실러스 힐가르디 (Lactobacillus hilgardii)을 접종하여, 35℃에서 15시간 동안 정치배양하였다. 이후, 30L 발효기에 GA농도 3.5%(w/v)가 포함된 MRS 배지 15L를 실시예 1와 동일한 방법으로 조제, 살균 및 냉각한 다음, 미리 배양한 종균을 접종하여 배양을 개시하였다. 배양 개시 18시간 후, 실시예 3과 동일한 방법으로 GA를 투입하기 시작했다.
발효 결과, 최종 발효액 양은 약 17.2L가 되었다. 총 투입 GA 양은 4,450g이었으며, 생성된 가바(GABA)는 2,828g이었다.
[ 실시예 6: L-글루탐산( GA )의 유가식 투입에 의한 고농도 가바의 생성예 3]
실시예 1에서 제조한 것과 동일한 방법으로, MRS 종균 배지 4000ml를 2L 플라스크 4개에 각각 1L씩 조제한 후 살균 냉각시키고, 락토바실러스 브레비스 OPK3 (KCCM 80047)을 접종하고, 35℃에서 15시간 동안 정치배양하였다.
500L 발효기에, GA 농도 2.5%(w/v)가 포함된 MRS배지 250L를 실시예 3과 동일한 방법으로 조제, 살균 및 냉각한 다음, 미리 배양한 종균 4L를 접종하고, 35℃, 초기 pH 6.0에서 회전수 75rpm으로 혐기적 상태에서 배양을 개시하였다.
배양 개시 15시간 만에 OD600 값 7이 얻어졌다. 이때부터 고체상태의 GA를 투입하였고, pH가 4.9에 도달하면 투입을 중단하였다. 또한, pH가 상승하여 5.6에 도달하면, 다시 GA를 투입하였다. 이와 같은 과정을 계속 반복하였다. 이후, 배양 개시 후 101시간이 경과한 시점에서 발효를 종료하였다. 최종 발효액 양은 320L가 되었다. 총 투입 GA 양은 147kg이었으며, 생성된 가바는 99.2kg이었다.
[ 실시예 7: 고농도 가바가 함유된 배양액으로부터 가바 분말의 제조]
배양이 종료된 후, 상기 실시예 3의 배양액 1L를 취하고, 6N 가성소다를 투입하여 pH를 6.8로 조정하였다. 이후, 80℃ 온도에서 15분간 열처리한 후, 55℃까지 냉각하고, 규조토 10g, 활성탄 5g을 넣고 3시간 교반하였다. 그 후, 소형 눗째를 사용하여 진공하에서 여과하였다. 여과후, 엷은 갈색의 투명한 여과액이 얻어졌다. 여과액은 32Bx이었다.
이를 소형 분무건조기에서 분무건조하여 갈색의 분말 240g을 얻었다. 이때, 열풍온도는 180℃, 배기온도는 95℃이었다. 얻어진 갈색분말의 수분은 3.2%, 고형분 중 가바 함량은 85%, GA 6.3%로 나타났다.
[ 실시예 8: 고농도 가바가 함유된 배양액으로부터 고순도 가바의 제조]
상기 실시예 3에서 배양을 종료한 발효액에, 2N 염산을 투입하여 pH를 4.9로 조정하고, 5시간 경과 후 pH가 5.5가 되면, 다시 2N 염산을 투입하여 pH를 4.9로 맞추고, 5시간 동안 교반하였다. 이때, 잔류 GA 농도는 0.85%로 측정되었다. 이후, 배양액 1L를 취하고 암모니아를 투입한 후, pH를 6.8로 조정하였다. 그 후, 80℃의 온도에서 15분간 열처리한 후, 55℃까지 냉각하고, 규조토 10g 및 활성탄 5g을 넣고, 3시간 동안 교반하였다. 이후, 소형 눗째를 사용하여 진공 하에서 여과하였다. 그 후, 상기 여과액을 3배로 희석하였는데, 측정한 여과액의 투과도(T%)는 95%이었다.
상기 여과액을 유리재질의 로타리증발기를 이용하여, 700mmHg의 진공하에서 55브릭스(Brix)까지 농축하고, 뚜껑과 쟈켓이 달린 유리베셀로 이송하였다. 유리베셀에서 서서히 교반하면서 진공도 680mmHg에서 증발시켰다. 결정이 생기는 시점에서 증발을 중단하고, 진공을 해제하고 냉각시킴과 동시에 95%에탄올을 투입하였다. 에탄올의 최종농도는 80%이었다.
결정액의 온도가 10℃가 될 때까지 계속해서 냉각시킨 다음, 원심분리기로 탈액하고, 에탄올의 함량을 80 %(v/v)로 조정한 수세액을 이용하여 두 차례 수세하였다. 상기에서 얻어진 습케이크는 열풍건조기를 이용하여 80℃의 열풍으로 1시간 건조하였다.
상기 건조된 결정의 겉보기 비중은 0.70이었고, 건조된 결정의 수득율은 71% 이었으며, 건조결정 중의 가바의 함량과 암모늄이온의 함량은 각각 99.1%, 185 ppm 이었다.

Claims (12)

  1. 배지에 유산균을 접종하여 배양함으로써 감마 아미노 부틸산(γ-Aminobutyric acid ; GABA)을 생산함에 있어서,
    상기 배양은,
    유산균이 배양되어 균체 농도가 OD600 값으로 4를 넘었을 때, 배지 중에 고체상태의 L-글루탐산 분말을 지속적 또는 간헐적으로 공급하며, 배지의 pH를 3.5~6.0으로 유지하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은,
    락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균인 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유산균은,
    락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis), 락토바실러스 힐가르디 (Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 플란타룸 ( Lactobacillus plantarum) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배지는,
    배양 개시 전, L-글루탐산 또는 글루탐산염을 L-글루탐산으로 환산하여 1~6 %(w/v)의 농도로 이미 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배양은,
    고체상태의 L-글루탐산 분말을 첨가함으로써, 배양 중 배지의 pH를 3.5~6.0으로 유지하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 감마 아미노 부틸산의 생산방법은,
    L-글루탐산의 공급이 종료된 후,
    배양액을 살균하고, 분무건조하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 감마 아미노 부틸산의 생산방법은,
    살균 후, 분무건조 전에 여과를 통해 유산균 균체를 제거하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 감마 아미노 부틸산의 생산방법은,
    L-글루탐산의 공급이 종료된 후, 산을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 산은,
    무기산 또는 유기산인 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 감마 아미노 부틸산의 생산방법은,
    산을 추가하여 미반응 글루탐산을 가바로 전환한 후,
    배양액을 살균하고, 분무건조하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 감마 아미노 부틸산의 생산방법은,
    살균 후, 분무건조 전에 여과를 통해 유산균 균체를 제거하는 것을 특징으로 하는 감마 아미노 부틸산의 생산방법.
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