KR100821266B1 - 침지막 생물반응기를 이용한 고농도 유산균의 생산 방법 - Google Patents

침지막 생물반응기를 이용한 고농도 유산균의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 침지막 생물반응기를 이용한 새로운 고농도 유산균의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 (1) 유산균은 생물반응기에서 기본 배지를 사용하여 배양하고; (2) 특정 시간이 경과한 다음 첨가 배지를 연속적으로 주입하여 균체를 유지 배양하고; 및 (3) 동시에 배양 여액은 연속적으로 분리 배출하는; 과정으로 이루어진 살아있는 유산균을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조 방법은 상기 과정에서 감압식 침지막 생물반응기를 사용하여 발효 배지 및 첨가 배지의 조성을 조정하고 상기 배지 내의 성장 저해물질을 적정 속도로 희석시켜, 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 유산균을 종래의 발효 방법과 비교하여 배지 당 생산되는 균체량 및 생균수를 각각 200% 및 300% 이상 증가시킬 수 있으므로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 유산균, 생물반응기, 감압식 막 여과기, 발효 배지, 희석 속도

Description

침지막 생물반응기를 이용한 고농도 유산균의 생산 방법 {Method for producing Bifidobactrium sp. strains in a high yield using submerged membrane bioreactor}
도 1 은 본 발명의 비피도박테리움 속 유산균의 균체 유지 배양 및 배양액 희석에 사용되는 제조 장치를 간략하게 도시한 것이다.
도 2 는 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobactrium bifidum) 균주로 본 발명의 침지막 생물반응기 또는 종래 회분식 배양을 이용하여 균체의 유지 배양 시, 유산균 균체 및 생균수의 변화를 시간별로 비교하여 나타낸 것이다.
<도면의 주요부에 대한 간단한 설명>
10: 생물반응기
11: 가스투입기
12: pH 조절용 첨가 펌프
13: 가스 배출기
20: 첨가 배지
21: 배지 첨가 펌프
30: 실관막
40: 배양여액
41: 흡입 펌프
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용한 새로운 고농도 유산균의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (1) 유산균은 생물반응기에서 기본 배지를 사용하여 배양하고; (2) 특정 시간이 경과한 다음 첨가 배지를 연속적으로 주입하여 균체를 유지 배양하고; 및 (3) 동시에 배양여액은 연속적으로 분리 배출하는; 과정으로 이루어진 살아있는 유산균을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다.
비피도박테리움 속 유산균은 그람 양성이고 이동성이 없으며 짧은 간균에서부터 Y 모양 간균에 이르기까지 다양한 모양을 가지는 혐기성 세균으로서, 인체 대장 내 미생물 중에서 약 5 내지 10% 를 차지하고 있다. 이러한 유산균은 주로 유산과 초산을 생산하여 장내 pH 를 저하시키고 많은 병원균 및 부패균의 성장을 억제하며 장의 연동 운동도 촉진시킨다. 또한, 이 유산균은 항생제가 유발하는 설사를 치료하고 비타민 B 복합체를 합성하며 혈액 내 콜레스테롤 수치를 낮추는 역할도 담당한다. 이외에도 유산균은 인체 면역 기능을 향상시키어 항암 능력을 증진시키며, 더 나아가 나이트로자민 등과 같은 암 유발 물질도 직접 또는 간접적으로 제거할 수 있어 자연 암 치료 효과도 가진다.
일반적으로 유산균은 회분식 배양으로 생산되고 있으나, 이 배양법은 유산균의 농도와 생균수가 낮아지는 단점이 있었다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위하여, 가압식 막 생물반응기를 이용하는 고농도 유산균의 생산 방법이 시도되어 왔다. 실제로 새로운 배지를 연속적으로 생물반응기에 공급하면서 균체는 반응기 내에 유지시킨 상태로 연속적으로 배양액을 제거하면 균체 증식을 저해하는 물질이 제거되고 균체가 농축되어 고농도로 유산균을 얻을 수 있다.
그럼에도 불구하고, 가압식 막 생물반응기는 여과 시 가해지는 압력이 크게 되어 균체에 손상을 주고 생존율을 높게 유지하는 것이 어려운 단점이 있었다. 또한, 상기 생물반응기에 사용되는 동력이 많이 들고 배양 중에 장치 내 막이 막히는 등의 문제점도 발생되었다.
본 발명자들은 상기 단점을 극복하기 위하여, 감압식 및 가스 분사식 막 생물반응기인 침지막 생물반응기를 개발하고자 하였다. 이러한 침지막 생물반응기는 가압식 막 반응기보다 동력의 소비가 적고 막 여과 및 막 막힘 과정이 잘 조절되며 유산균 균체도 효과적으로 유지된다.
이에 본 발명자들은 새로운 고농도 유산균의 생산 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 상기 침지막 생물반응기를 유산균의 생산에 도입하고 새로운 배지를 연속적으로 생물반응기에 공급하면서 균체는 반응기 내에 유지시킨 상태로 연속적으로 배양액을 제거하는 연속 배양 공정을 적용하여 균체 증식 저해물질 등을 제거하면서 균체를 농축시키어 고농도의 살아있는 유산균을 적은 비용으로 생산하는 방법을 제공함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 새로운 유산균의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 유산균은 생물반응기에서 기본 배지를 사용하여 배양하고; (2) 특정 시간이 경과한 다음 첨가 배지를 연속적으로 주입하여 균체를 유지 배양하고; 및 (3) 동시에 배양여액은 연속적으로 분리 배출하는; 과정으로 이루어진 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용한 고농도의 살아있는 유산균을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은
(1) 유산균은 생물반응기에서 기본 배지를 사용하여 배양하고;
(2) 특정 시간이 경과한 다음 첨가 배지를 연속적으로 주입하면서 균체를 배양하고; 및
(3) 상기 균체는 유지 배양시키면서 배양여액은 연속적으로 분리 배출하는; 과정으로 이루어진 살아있는 유산균을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 (1) 과정에서 상기 생물반응기로는 침지막 생물반응기를 사용하는 것이 바람직하고, 또한 감압식 또는 가스 분사식인 생물반응기를 사용하는 것이 바람직하며, 감압식 침지막 생물반응기를 사용하는 것은 더욱 바람직하다.
또한 상기 발효 과정 전체에서 유가식 배양 방법을 적용하는 것이 바람직하 고, 발효 배지로는 탄소원인 슈크로스 농도가 배양액 기준으로 5 내지 200 g/ℓ가 포함되는 배지를 사용하는 것이 바람직하고, 5 내지 20 g/ℓ가 포함되는 배지를 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 이 때, 교반 속도는 100 내지 300 rpm 으로 조절하고, 가스는 질소 90%, 이산화탄소 5%, 수소 5% 로 구성된 것을 공급 속도 0.01 내지 0.05 vvm 로 유지하여 공급하는 것이 바람직하다.
상기 (1) 과정에서 상기 기본 배지로는 슈크로스 5 내지 200 g/ℓ, 대두펩톤 1 내지 20 g/ℓ, 효모 추출물 1 내지 40 g/ℓ, 쇠고기 추출물 1 내지 20 g/ℓ, 일인산칼륨 1 내지 20 g/ℓ, 이인산칼륨 1 내지 10 g/ℓ, 황산구연산 0.1 내지 5 g/ℓ, 황산마그네슘 0.01 내지 1 g/ℓ, 말레산 0.01 내지 1 g/ℓ, 황산철 0.01 내지 1 g/ℓ, 시스테인 0.1 내지 5 g/ℓ 및 트윈80 0.1 내지 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (1) 과정에서 상기 유산균은 배양 시간 10 내지 14시간 범위 이내에서 배양되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (2) 과정에서 상기 첨가 배지로는 슈크로스 50 내지 200 g/ℓ, 대두펩톤 1 내지 20 g/ℓ, 효모 추출액 1 내지 40 g/ℓ, 쇠고기 추출물 1 내지 20 g/ℓ, 일인산칼륨 1 내지 20 g/ℓ, 이인산칼륨 1 내지 10 g/ℓ, 황산철 0.05 내지 2 g/ℓ 및 황산마그네슘 0.01 내지 1 g/ℓ의 조성으로 이루어진 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 (2) 과정에서 상기 첨가 배지는 희석 속도 0.03 내지 0.1 h-1로 상기 생물반응기 내 통과시키는 것이 바람직하고, 희석 속도 0.05 내지 0.07 h-1 이상으로 통과시키는 것은 더욱 바람직하다. 이 과정에서 유산균 균체의 성장 저해물질인 유기산 및 암모늄 이온 등이 희석되어 살아있는 유산균의 균체량 및 생균수 등이 증가된다.
또한, 상기 (3) 과정에서 상기 배양여액은 감압식 미세여과관 (microfiltration system using vacuum pressure)을 사용하여 여과되는 균체 유지 배양방법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 감압식 미세여과관은 생물 반응기와 별도로 부착하여 사용할 수도 있고, 생물 반응기 내에 설치하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 생산 방법은 모든 유산균 균주에서 살아있는 균체를 고농도로 얻는데 사용할 수 있으나, 상기 유산균 균주에는 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 균주 등을 포함하는 것이 바람직하고 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) 균주를 포함하는 것은 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명의 생산 방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1 에서 보는 바와 같이, 감압식 미세여과기를 내부에 장착한 생물반응기 장치를 사용하여 고농도의 살아있는 유산균을 다음과 같이 생산한다.
생물반응기 (bioreactor) 10 에서 균체를 배양하고 특정 시간 (약 10 내지 14 시간)이 경과한 다음 첨가 배지 20 을 이송 펌프 (peristaltic pump) 21 을 사용하여 생물반응기 10 에 연속적으로 첨가하고 원활한 여과를 위하여 생물반응기 내의 미세여과관 (microfiltration system)을 통하여 질소 90%, 이산화탄소 5% 및 수소 5% 으로 구성된 가스를 0.01 내지 0.05 vvm의 공급 속도로 생물반응기 하부 가스 토출구로부터 연속적으로 주입한다. 미세여과관 양쪽 끝에 고정된 실관막 (hollow fiber) 30 에 연결된 흡입 펌프 (vacuum pump) 41 을 작동하면 상기 미세여과관 내부가 감압되고 압력차가 발생되어 상기 배양액이 미세여과관 양쪽 끝에 고정된 실관막을 통과하게 된다. 이 때, 상기 실관막 30 을 통과하지 못하는 균체는 생물반응기 10 에 유지되고, 실관막 30 을 통과한 여액 40 은 흡입 펌프 41 에 의해 연속적으로 밖으로 배출된다.
상기 과정에서 슈크로스 농도는 BP-100 탄수화물 칼슘 칼럼 (Millipore, USA)이 장착된 HPLC (Shimadzu C-R6A, Japan) 장치 내 측정기 (Refractive Index Detector; Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정할 수 있다. 이 때 용매로는 물을 사용하고, 온도는 80℃ 로 유속은 0.5 ㎖/min 로 조절된다. 총 질소량은 질소/단백질 결정기 (LECO Model FP428, USA)를 사용하여 측정하고, 암모니아 농도는 화학적 색도를 이용하여 측정하는 인돌페놀 (indophenol)법을 사용하여 측정한다. 또한 유산과 초산은 IonPac ICE-AS6 칼럼이 장착된 Bio-LC (Dinoex ED-50, USA)의 탐지기 (Suppressed Conductivity Detector)를 이용하여 측정한다. 이 때 용매로는 0.4 mM 헵타플루오르부틸산 (heptaflurobutyric acid)을 사용하고, 유속은 1.0 ㎖/min 로 조절한다. 또한 균체 농도는 탁도계를 이용하여 600 nm 에서 현탁도를 측정하고 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 그 결과를 건조 중량으로 전환한다. 또한 균체의 생균수는 표준 평판법을 사용하여 측정한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 침지막 생물반응기의 첨가 배지 내 탄소원 최적화 조사
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용하는 유산균의 배양 공정 중에서 첨가 배지 내의 탄소원 최적화를 조사하기 위하여, 다음과 같이 종균 배양 및 본 배양을 실시하였다. 먼저 공시 균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3202 균주를 MRS 배지 20 ㎖ 가 들어있는 25 ㎖ 테스트 튜브에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 그 다음 슈크로스 30 g/ℓ, 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 황산구연산 2 g/ℓ, 황산마그네슘 0.05 g/ℓ, 말레산 0.1 g/ℓ, 황산철 0.1 g/ℓ, 시스테인 0.5 g/ℓ 및 트윈80 1 ㎖/ℓ으로 구성된 기본 배지가 2 ℓ 가 들어있는 5 ℓ용 발효조 (바이오트론 주식회사)에 상기 종균 배양액을 넣어 배양하였다. 상기 배양 시간이 12시간 경과한 다음, 다시 슈크로스 90 내지 110 g/ℓ, 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모추출액 20 g/ℓ 및 쇠고기 추출물 10 g/ℓ으로 구성된 첨가 배지를 희석속도 0.045 h-1로 연속적으로 감압식 미세여과 생물반응기에 통과시키는 과정으로 연속식 균체 유지 배양을 실시하였다.
이 때 교반 속도는 200 rpm으로 맞추고, pH 는 발효 초기에 6.8 로 하고 배양이 진행되면서 pH 가 감소하여 6.0 에 다다르고 나면 암모니아수를 첨가하여 다시 6.0으로 조절하였다. 또한, 첨가 배지의 pH 는 가성소다로 8.5로 조절하여 암모니아수의 첨가를 최소화시켰다. 배양 온도는 37℃로, 교반 속도는 200 rpm로 조절하고 질소 90%, 이산화탄소 5% 및 수소 5% 로 조절된 가스의 공급 속도는 0.02 vvm 으로 유지하였다.
그 결과, 슈크로스 농도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수는 표 1 에 나타난 바와 같고, 실제로 100 g/ℓ의 슈크로스를 사용하였을 때 배양시간 36시간에서 각각 8.3 g/ℓ의 미생물 균체와 1.7 × 1010의 생균수를 얻을 수 있었다.
첨가 배지 내 탄소원 농도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수
슈크로스 (g/ℓ) 균체농도 (g/ℓ) 생균수 (cfu/㎖) 잔존 슈크로스 (g/ℓ)
90 7.7 1.2×1010 2.1
100 8.3 1.7×1010 5.1
110 8.3 1.6×1010 11.5
실시예 2. 침지막 생물반응기의 첨가 배지 내 질소원 최적화 조사
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용하는 유산균의 배양 공정 중에서 첨가 배지 내의 질소원 최적화를 조사하기 위하여, 다음과 같이 종균 배양 및 본 배양을 실시하였다. 먼저 공시 균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3202 균주를 MRS 배지 20 ㎖ 가 들어있는 25 ㎖ 테스트 튜브에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 그 다음 슈크로스 30 g/ℓ, 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 황산구연산 2 g/ℓ, 황산마그네슘 0.05 g/ℓ, 말레산 0.1 g/ℓ, 황산철 0.1 g/ℓ, 시스테인 0.5 g/ℓ 및 트윈80 1 ㎖/ℓ으로 구성된 기본 배지가 2 ℓ 가 들어있는 5 ℓ용 발효조 (바이오트론 주식회사)에 상기 종균 배양액을 넣어 배양하였다. 상기 배양 시간이 12시간 경과한 다음, 다시 슈크로스 100 g/ℓ, 대두펩톤 8 내지 12 g/ℓ, 효모추출액 16 내지 24 g/ℓ 및 쇠고기 추출물 8 내지 12 g/ℓ으로 구성된 첨가 배지를 희석속도 0.045 h-1로 연속적으로 감압식 미세여과 생물반응기에 통과시키는 과정으로 연속식 균체 유지 배양을 실시하였다. 이 때 교반 속도는 200 rpm으로 맞추고, pH 는 발효 초기에 6.8 로 하고 배양이 진행되면서 pH 가 감소하여 6.0 에 다다르고 나면 암모니아수를 첨가하여 다시 6.0으로 조절하였다. 또한, 첨가 배지의 pH 는 가성소다로 8.5로 조절하여 암모니아수의 첨가를 최소화시켰다. 배양 온도는 37℃로, 교반 속도는 200 rpm로 조절하고 질소 90%, 이산화탄소 5% 및 수소 5% 로 조절된 가스의 공급 속도는 0.02 vvm 으로 유지하였다.
그 결과, 질소원 농도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수는 표 2 에 나타난 바와 같고, 실제로 100% 질소원을 사용하였을 때 배양시간 36시간에서 각각 8.3 g/ℓ의 미생물 균체와 1.7 × 1010의 생균수를 얻을 수 있었다.
첨가 배지 내의 질소원 농도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수
질소원 (%)* 균체농도 (g/ℓ) 생균수 (cfu/㎖) 잔존 질소원 (g/ℓ)
80 5.4 1.0×1010 0.00
100 8.3 1.7×1010 0.21
120 7.9 1.5×1010 0.57
* 질소원 100% = 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모추출액 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ
실시예 3. 침지막 생물반응기의 첨가 배지 내 인산원 및 무기원 최적화 조사
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용하는 유산균의 배양 공정 중에서 첨가 배지 내 인산원 및 무기원의 최적화를 조사하기 위하여, 다음과 같이 종균 배양 및 본 배양을 실시하였다. 먼저 공시 균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3202 균주를 MRS 배지 20 ㎖ 가 들어있는 25 ㎖ 테스트 튜브에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 그 다음 슈크로스 30 g/ℓ, 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 황산구연산 2 g/ℓ, 황산마그네슘 0.05 g/ℓ, 말레산 0.1 g/ℓ, 황산철 0.1 g/ℓ, 시스테인 0.5 g/ℓ 및 트윈80 1 ㎖/ℓ으로 구성된 기본 배지가 2 ℓ 가 들어있는 5 ℓ용 발효조 (바이오트론 주식회사)에 상기 종균 배양액을 넣어 배양하였다. 상기 배양 시간이 10 내지 14시간 경과한 다음, 다시 탄소원으로 슈크로스 100 g/ℓ, 질소원으로 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모추출액 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 인산원으로 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 무기원으로 황산철 0.08 g/ℓ 및 황산마그네슘 0.04 g/ℓ으로 구성된 첨가 배지를 희석속도 0.045 h-1로 연속적으로 감압식 미세여과 생물반응기에 통과시키는 과정으로 연속식 균체 유지 배양을 실시하였다.
이 때 교반 속도는 200 rpm으로 맞추고, pH 는 발효 초기에 6.8 로 하고 배양이 진행되면서 pH 가 감소하여 6.0 에 다다르고 나면 암모니아수를 첨가하여 다시 6.0으로 조절하였다. 또한, 첨가 배지의 pH 는 가성소다로 8.5로 조절하여 암모니아수의 첨가를 최소화시켰다. 배양 온도는 37℃로, 교반 속도는 200 rpm로 조절하고 질소 90%, 이산화탄소 5% 및 수소 5% 로 조절된 가스의 공급 속도는 0.02 vvm 으로 유지하였다.
그 결과, 인산원 및 무기원의 첨가 유무에 따른 유산균의 균체량 및 생균수는 표 3 에 나타난 바와 같고, 실제로 인산원 및 무기원 모두를 사용하였을 때 배양시간 36 시간에서 9.8 g/ℓ의 미생물 균체와 2.0 × 1010의 생균수를 각각 얻을 수 있었다.
첨가 배지 내 인산원 및 무기원에 따른 유산균의 균체량 및 생균수
인산원 무기원 균체농도 (g/ℓ) 생균수 (cfu/㎖)
- - 8.9 1.7×1010
+ - 9.5 1.8×1010
+ + 9.8 2.0×1010
실시예 4. 침지막 생물반응기의 첨가 배지 내 희석 속도 최적화 조사
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용하는 유산균의 배양 공정 중에서 첨가 배지의 희석 속도 최적화를 조사하기 위하여, 다음과 같이 종균 배양 및 본 배양을 실시하였다. 먼저 공시 균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3202 균주를 MRS 배지 20 ㎖ 가 들어있는 25 ㎖ 테스트 튜브에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 그 다음 슈크로스 30 g/ℓ, 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 황산구연산 2 g/ℓ, 황산마그네슘 0.05 g/ℓ, 말레산 0.1 g/ℓ, 황산철 0.1 g/ℓ, 시스테인 0.5 g/ℓ 및 트윈80 1 ㎖/ℓ으로 구성된 기본 배지가 2 ℓ 가 들어있는 5 ℓ용 발효조 (바이오트론 주식회사)에 상기 종균 배양액을 넣어 배양하였다. 상기 배양 시간이 10 내지 14시간 경과한 다음, 다시 탄소원으로 슈크로스 100 g/ℓ, 질소원으로 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모추출액 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 인산원으로 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 무기원으로 황산철 0.08 g/ℓ 및 황산마그네슘 0.04 g/ℓ으로 구성된 첨가 배지를 희석속도 0.03 h-1 내지 0.075 h-1 로 변화를 주면서 연속적으로 감압식 미세여과 생물반응기에 통과시키는 과정으로 연속식 균체 유지 배양을 실시하였다. 또한, 잔존 슈크로스 농도를 기반으로 하여 여러 번의 실험을 실시한 결과, 희석 속도 0.03 h-1에서는 첨가 배지 농도를 0.045 h-1의 1.25배, 희석 속도 0.06 h-1에서는 첨가배지 농도를 0.045 h-1의 0.83배, 0.075 h-1에서는 첨가배지 농도를 0.045 h-1의 0.70배로 조절하는 것을 정하였다.
이 때 교반 속도는 200 rpm으로 맞추고, pH 는 발효 초기에 6.8 로 하고 배양이 진행되면서 pH 가 감소하여 6.0 에 다다르고 나면 암모니아수를 첨가하여 다시 6.0으로 조절하였다. 또한, 첨가 배지의 pH 는 가성소다로 8.5로 조절하여 암모니아수의 첨가를 최소화시켰다. 배양 온도는 37℃로, 교반 속도는 200 rpm로 조절하고 질소 90%, 이산화탄소 5% 및 수소 5% 로 조절된 가스의 공급 속도는 0.02 vvm 으로 유지하였다.
또한, 상기에서 감압식 미세 여과관은 일본 미쓰비시 레이온사에서 제조된 공극이 0.45㎛ 이고 폴리에틸렌 재질로 구성된 실관막 (hollow fiber membrane)을 미세 여과관 양끝의 실리콘 튜브에 연결하고 부착시킨 다음 펌프를 이용하여 감압 여과 하도록 사용하였으며, 균체의 농도 및 생균수는 상기 실시예들과 동일한 과정을 수행하여 확인하였다.
그 결과 침지막 생물반응기에서 첨가 배지의 희석 속도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수는 표 4에 나타난 바와 같고, 실제로 희석속도 0.06 h-1일 때 배양시간 36 시간에서 각각 12.0 g/ℓ의 미생물 균체와 2.2 × 1010의 생균수를 얻을 수 있었다. 이 때 최적의 첨가 배지로서 슈크로스 83 g/ℓ, 질소원으로 대두펩톤 8.3 g/ℓ, 효모추출액 16.6 g/ℓ, 쇠고기 추출물 8.3 g/ℓ, 인산원으로 일인산칼륨 8.3 g/ℓ,이인산칼륨 4.15 g/ℓ, 무기원으로 황산철 0.066 g/ℓ 및 황산마그네슘 0.033 g/ℓ 으로 구성된 배지를 사용하였다.
첨가 배지의 희석 속도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수
희석속도 (h-1) 균체 농도 (g/ℓ) 생균수 (cfu/㎖) 잔존 슈크로스(g/ℓ)
0.030 8.8 1.8 × 1010 5.6
0.045 9.8 2.0 × 1010 3.0
0.060 12.0 2.2 × 1010 5.1
0.075 11.8 2.2 × 1010 4.7
따라서 균체 유지 배양 시 첨가배지를 연속적으로 첨가하고 균체가 포함되지 않은 여과액만을 연속적으로 배출하게 되므로, 배양액 내의 유기산과 암모니아 농도가 낮은 수준으로 유지되어 최종 유기산과 암모니아 농도가 각각 1.5 g/ℓ와 1.0 g/ℓ 이내로 유지될 수 있고 이로 인하여 성장 저해정도가 낮게 유지되어 높은 균체 농도 및 생균수를 얻을 수 있음을 확인하였다 (도 2 참조).
실시예 5. 생물반응기 장치를 이용한 유산균의 배양
본 발명은 도 1 에서 보는 바와 같이, 감압식 미세여과기를 내부에 장착한 생물반응기 장치를 사용하여 살아있는 유산균을 다음과 같이 고농도로 생산하였다.
구체적으로, 생물반응기 (bioreactor) 10 에서 균체를 배양하고 특정 시간 (약 10 내지 14 시간)이 경과한 다음 첨가 배지 20 을 이송 펌프 (peristaltic pump) 21 을 사용하여 생물반응기 10 에 연속적으로 첨가하고 원활한 여과를 위하여 생물반응기 내의 미세여과관 (microfiltration system)을 통하여 질소 90%, 이산화탄소 5% 및 수소 5% 으로 구성된 가스를 0.01 내지 0.05 vvm의 공급 속도로 생물반응기 하부 가스 토출구로부터 연속적으로 주입하였다. 미세여과관 양쪽 끝에 고정된 실관막 (hollow fiber) 30 에 연결된 흡입 펌프 (vacuum pump) 41 을 작동하면 상기 미세여과관 내부가 감압되고 압력차가 발생되어 상기 배양액이 미세여과관 양쪽 끝에 고정된 실관막을 통과하게 되었다. 이 때, 상기 실관막 30 을 통과하지 못하는 균체는 생물반응기 10 에 유지되었고, 실관막 30 을 통과한 여액 40 은 흡입 펌프 41 에 의해 연속적으로 밖으로 배출되었다.
상기 과정에서 슈크로스 농도는 BP-100 탄수화물 칼슘 칼럼 (Millipore, USA)이 장착된 HPLC (Shimadzu C-R6A, Japan) 장치 내 측정기 (Refractive Index Detector; Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이 때 용매로는 물을 사용하였고, 온도는 80℃ 로 유속은 0.5 ㎖/min 로 조절되었다. 총 질소량은 질소/단백질 결정기 (LECO Model FP428, USA)를 사용하여 측정하였고, 암모니아 농도는 화학적 색도를 이용하여 측정하는 인돌페놀 (indophenol)법을 사용하여 측정하였다. 또한 유산과 초산은 IonPac ICE-AS6 칼럼이 장착된 Bio-LC (Dinoex ED-50, USA)의 탐지기 (Suppressed Conductivity Detector)를 이용하여 측정하였다. 이 때 용매로는 0.4 mM 헵타플루오르부틸산 (heptaflurobutyric acid)을 사용하였고, 유속은 1.0 ㎖/min 로 조절하였다. 또한 균체 농도는 탁도계를 이용하여 600 nm 에서 현탁도를 측정하고 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 그 결과를 건조 중량으로 전환하였다. 균체의 생균수는 표준 평판법을 사용하여 측정하였다.
비교예 1. 유산균의 회분식 배양
본 발명은 침지막 생물반응기를 이용하는 유산균의 배양 공정을 종래의 회분식 배양 공정과 비교하기 위하여, 다음과 같이 종균 배양 및 본 배양을 실시하였다. 먼저 공시 균주인 비피도박테리움 비피덤 KCTC 3202 균주를 MRS 배지 20 ㎖ 가 들어있는 25 ㎖ 테스트 튜브에 접종하고 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 그 다음 슈크로스 30 내지 60 g/ℓ, 대두펩톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 20 g/ℓ, 쇠고기 추출물 10 g/ℓ, 일인산칼륨 10 g/ℓ,이인산칼륨 5 g/ℓ, 황산구연산 2 g/ℓ, 황산마그네슘 0.05 g/ℓ, 말레산 0.1 g/ℓ, 황산철 0.1 g/ℓ, 시스테인 0.5 g/ℓ 및 트윈80 1 ㎖/ℓ으로 구성된 기본 배지가 2 ℓ 가 들어있는 5 ℓ용 발효조 (바이오트론 주식회사)에 상기 종균 배양액을 넣어 25시간 동안 배양하였다. 배양 시간이 25시간이 넘으면 균체 농도 및 생균수가 감소하였다. 교반속도를 200 rpm으로 하고 pH는 발효 초기 6.8로 하고 배양이 진행됨에 따라 pH가 감소하여 특정 값에 다다르면 그 이후부터 암모니아 수를 첨가하여 특정 값으로 조절하였다. 배양 온도는 37℃로, 교반 속도는 200 rpm의 조절하고 질소 90%, 이산화탄소 5%, 수소 5%로 구성된 가스의 공급 속도는 0.02 vvm으로 유지하였다.
그 결과, 30 g/ℓ슈크로스 배지에서 유지하는 pH 에 따른 유산균의 균체량 및 생균수는 표 5 에 나타난 바와 같고, 또한 유지하는 pH 를 6.0으로 하여 슈크로스 농도에 유산균 균체량 및 생균수는 표 6 에 나타난 바와 같았다. 회분식 배양에서 최적 배지를 사용하는 경우 배양시간 25시간에서 4.5 g/ℓ의 미생물 균체와 3.0 × 109의 생균수를 얻을 수 있었다. 배양 후에 유기산의 농도는 2.4 g/ℓ이고, 암모니아 농도는 3.4 g/ℓ로 비교적 높은 농도를 나타냈으며, 이들 높은 농도가 균체 증식을 저해하여 회분식 배양에서는 최종 유산균의 균체량 및 생균수가 낮게 나타난 것으로 확인되었다.
회분식 배양에서 pH 에 따른 유산균의 균체량 및 생균수
pH* 균체농도 (g/ℓ) 생균수 (cfu/㎖) 최종 암모니아(g/ℓ)
5.0 2.7 1.4 × 109 0.6
5.5 2.9 1.5 × 109 2.8
6.0 3.4 1.8 × 109 3.2
6.5 2.9 1.5 × 109 5.6
* 초기 pH는 6.8
회분식 배양에서 슈크로스 농도에 따른 유산균의 균체량 및 생균수
슈크로스 (g/ℓ) 균체농도 (g/ℓ) 생균수 (cfu/㎖) 잔존 슈크로스(g/ℓ)
30 3.4 1.8 × 109 0.0
40 4.1 2.4 × 109 0.0
50 4.5 3.0 × 109 2.2
60 4.4 2.6 × 109 22.3
따라서 상기 실시예 4 및 비교예 1 을 비교한 결과, 침지막 생물반응기를 사용한 균체 유지 배양이 회분식 배양 보다 균체 농도는 2.7배, 생균수는 7.3배 증가시키는 것을 알 수 있었다. 지금까지 비피도박테리움 비피덤 에 관한 문헌보고에서 최고의 생균수 기록은 가압식 막 생물반응기를 사용하여 얻은 5.3 × 109인 점을 참고할 때, 본 발명의 감압식 침지막 반응기를 사용하여 얻은 비피도박테리움 비피 덤 의 생균수는 2.2 × 1010으로 문헌보고 중의 최고 수준보다도 4.2배 높은 것을 확인하였다 (Corre, C.; Madec, M. N.; Boyaval, P. Production of concentrated Bifidobacterium bifidum. J. Chem. Technol. Biotechnol. 1992, 53, 189-194).
상술한 바와 같이, 본 발명은 (1) 유산균은 생물반응기에서 기본 배지를 사용하여 배양하고; (2) 특정 시간이 경과한 다음 첨가 배지를 연속적으로 주입하면서 균체를 배양하고; 및 (3) 상기 배양된 균체는 유지 배양시키면서 배양여액은 연속적으로 분리 배출하는; 과정으로 이루어진 살아있는 유산균을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생산 방법은 상기 과정에서 발효 배지 및 첨가 배지의 조성을 조정하고 균체와 배양 여액을 분리해내어 상기 배지 내의 성장 저해물질을 적정 속도로 희석시키므로, 비피도박테리움 속 유산균을 종래의 발효 방법과 비교하여 배지 당 생산되는 균체량 및 생균수를 각각 200% 및 300% 이상 높게 증가시킬 수 있다. 또한 감압식 또는 가스분사식 막 생물반응기를 사용하여 보다 적은 비용이 드는 간편한 과정으로 살아있는 유산균을 고농도로 생산할 수 있다. 따라서 본 발명은 살아있는 유산균을 고농도로 생산하는 모든 공정에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. (1) 유산균은 침지막 생물 반응기에서 기본 배지를 사용하여 배양하고;
    (2) 특정 시간이 경과한 다음 첨가 배지를 연속적으로 주입하여 균체를 유지 배양하고; 및
    (3) 상기 균체는 배양시키는 동시에 배양 여액은 연속적으로 분리 배출하는; 과정으로 이루어진 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서 상기 침지막 생물반응기는 감압식 또는 가스 분사식 생물반응기를 사용하는 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1) 과정의 상기 기본 배지는 슈크로스 5 내지 200 g/ℓ, 대두펩톤 1 내지 20 g/ℓ, 효모 추출물 1 내지 40 g/ℓ, 쇠고기 추출물 1 내지 20 g/ℓ, 일인산칼륨 1 내지 20 g/ℓ, 이인산칼륨 1 내지 10 g/ℓ, 황산구연산 0.1 내지 5 g/ℓ, 황산마그네슘 0.01 내지 1 g/ℓ, 말레산 0.01 내지 1 g/ℓ, 황산철 0.01 내지 1 g/ℓ, 시스테인 0.1 내지 5 g/ℓ 및 트윈80 0.1 내지 10 ㎖/ℓ의 조성으로 이루어진 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서 상기 유산균은 배양 시간 10 내지 14시간 범위에서 배양되는 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2) 과정의 상기 첨가 배지는 슈크로스 50 내지 200 g/ℓ, 대두펩톤 1 내지 20 g/ℓ, 효모 추출액 1 내지 40 g/ℓ, 쇠고기 추출물 1 내지 20 g/ℓ, 일인산칼륨 1 내지 20 g/ℓ, 이인산칼륨 1 내지 10 g/ℓ, 황산철 0.05 내지 2 g/ℓ 및 황산마그네슘 0.01 내지 1 g/ℓ의 조성으로 이루어진 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 (2) 과정에서 상기 첨가 배지는 희석 속도 0.03 내지 0.1 h-1로 상기 생물반응기 내 통과시키는 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 (3) 과정에서 상기 배양 여액은 감압식 미세여과관 (microfiltration system using vacuum pressure)을 사용하여 여과되는 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균은 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.) 균주인 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균은 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) 균주인 것을 특징으로 하는 살아있는 유산균의 고농도 생산 방법.
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