CN113005163B - 蛹虫草连续培养生产虫草素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种蛹虫草连续培养生产虫草素的方法。针对现有液态发酵生产虫草素要么生产效率低下，要么无法同时生长虫草子实体的问题，本发明提供了一种蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，包括以下步骤：a、配制蛹虫草种子培养基，进行种子培养2～4天；b、在反应器中加入发酵培养基，进行液态发酵，直至长出子实体；c、连续发酵，直到虫草素浓度下降30％时，发酵结束。本发明通过在发酵培养基中添加适宜量的腺嘌呤和甘氨酸，配合加入谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，同时还加入了胡萝卜汁和麸皮浸出汁，共同使得液态发酵的效率提高，液态发酵产生的虫草素显著提高。

Description

蛹虫草连续培养生产虫草素的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种蛹虫草连续培养生产虫草素的方法。
背景技术
虫草素是虫草中主要的活性成分之一。虫草素具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。虫草素的制备主要有化学合成和生物合成两种方式。由于目前化学合成虫草素生产成本高，合成工艺复杂，收率低，产物纯化比较难，所以虫草素主要由生物合成法制备。生物合成法制备虫草素有两种途径：一是固体发酵获得虫草子实体，再从中提取；二是通过虫草液体发酵，从发酵液中直接提取。由于液体发酵比固体发酵在发酵规模、菌体生长速率、生长密度以及可控性上的优势，虫草液体发酵提取虫草素成为主要的虫草素制备方法。
专利CN102559815A公开了一种虫草素的发酵生产方法，将活化后的菌株蛹虫草接入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵温度为25～28℃，搅拌转速为150～180rpm，流加氢氧化钠溶液和盐酸控制发酵液pH值保持在5.5～6.0；当碳源消耗完毕时，搅拌转速降为60～80rpm，利用间歇流加的方式向发酵罐中补加含葡萄糖和腺苷的水溶液，整个发酵时间为200～280h，生产效率达到0.25g/L/d。但该方法生产的虫草素浓度低，不出草。
专利CN102965416A公开了一种蛹虫草半连续液体发酵生产虫草素的方法。具体操作步骤如下：(1)将蛹虫草(Cordycepsmilitaris)的菌丝接到PDA固体培养基上活化，生成大量浓密菌丝的菌苔；(2)将菌苔接到种子培养基振荡培养，5天后形成大量菌球体，制得种子液；(3)将种子液转接到种子液发酵罐进行扩培；(4)将扩培种子液再转接到500L罐进行首批发酵；(5)相同条件下，500L罐10批次半连续发酵。虫草素产量为62.5mg/L，发酵强度保持在15mg/(L·d)以上。该方法生产虫草素的生产效率仍然较低，不适宜工业化应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有液态发酵生产虫草素要么生产效率低下，要么无法同时生长虫草子实体的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种蛹虫草连续培养生产虫草素的方法。该方法包括以下步骤：
a、配制蛹虫草种子培养基，在每L种子培养基中接入1.0～9.0×106个/ml的蛹虫草孢子悬液40～100ml，在温度22～28℃，转速150～250r/min条件下进行种子培养2～4天，得到种子培养液；
b、在反应器中加入发酵培养基，液面高度为2～20cm，灭菌后按5～30％的接种量接种步骤a得到的种子培养液，避光条件下，在温度22～28℃条件下进行液态发酵；所述液态发酵时底部和顶部都持续通入气体，直至菌体湿重达20～80g/L；之后，底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体，进行静置培养，直至长满白色孢子；之后再光照培养，直至长出子实体；
c、待步骤b发酵过程中的葡萄糖浓度降至1～5g/L以下时，向反应器中流加葡萄糖溶液；或当腺嘌呤浓度降至0.5～1g/L、甘氨酸浓度降至1～4g/L时，流加底物溶液；或当无机磷浓度降至0.01～0.05g/L时，流加营养液进行连续发酵，直到虫草素浓度下降30％时，发酵结束。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤a所述的种子培养基的组成包括：每L培养基中含葡萄糖20～40g、蛋白胨10～25g、酵母膏5～20g、磷酸氢二钾0.1～2g、硫酸镁0.1～2g、硫酸亚铁0.02～1g，余量为水。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤a所述的种子培养基的pH值为4.5～6.5。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的发酵培养基的组成包括：每L培养基中的葡萄糖20～50g、蛋白胨10～30g、酵母膏5～30g、胡萝卜汁20～200mL、麸皮浸出汁40～400mL、腺嘌呤1～5g、甘氨酸2～20g、谷氨酸1～8g、精氨酸1～8g、天冬氨酸1～8g、磷酸氢二钾0.05～1g、硫酸镁0.05～1g和硫酸亚铁0.05～1g，余量为水。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的发酵培养基的pH值为4.5～6.5。
进一步的，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述发酵培养基中的胡萝卜汁的制备方法为：取10～100g胡萝卜切块，加1～3倍水制浆，2～4层纱布过滤，滤液即为胡萝卜汁。
进一步的，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述发酵培养基中的麸皮浸出汁的制备方法为：取10～50g麸皮，加5～12倍水，60～120℃处理30～60分钟，冷却后用2～4层纱布过滤，收集过滤液即为麸皮浸出汁。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的反应器包括带夹套发酵罐、进气管路、排气管路，进料管路、出料管路以及底部微孔曝气盘；所述的进气管路为2个，一个从进气出口位于液面之上，一个进气出口位于液面之下，与微孔曝气盘相连接。
进一步的，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的反应器直径为8～20cm。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的底部和顶部通气通入的为压缩空气或氧气，通入气体的压力为0.03～0.08Mpa。目的是为了增加溶氧，得到更多的虫草素。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤c所述的葡萄糖溶液浓度为300～800g/L；所述的底物溶液中每升含腺嘌呤2～6g、甘氨酸20～60g；所述的营养液中每升含胡萝卜汁40～400mL、磷酸二氢钾0.5～4g、硫酸镁0.5～4g和硫酸亚铁0.1～0.5g。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤c所述的连续发酵时底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体。
进一步的，所述的间歇性通入气体是指每1～5小时通气1～10分钟，通气流量为0.1～0.8L/L/min。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种采用蛹虫草连续液态发酵培养生产虫草素的方法，通过在发酵培养基中添加适宜量的腺嘌呤和甘氨酸，配合加入谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，同时还加入了胡萝卜汁和麸皮浸出汁，共同使得液态发酵的效率提高，液态发酵产生的虫草素显著提高。并且，本发明还可以连续液态发酵培养，进一步将虫草素的产量提高2倍以上，具有显著的经济效益。本发明方法发酵效率高；操作方便，易于自动化生产控制。
附图说明
图1所示为发酵反应器的示意图。1发酵罐；2微孔曝气盘；3视镜灯；4阀门；5压力表；L1底部进气；L2上部进气；L3补糖管路；L4补底物管路；L5补营养液管路；L6尾气管路；L7排液管路。
具体实施方式
本发明提供了一种蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，包括以下步骤：
a、配制蛹虫草种子培养基，在每L种子培养基中接入1.0～9.0×106个/ml的蛹虫草孢子悬液40～100ml，在温度22～28℃，转速150～250r/min条件下进行种子培养2～4天，得到种子培养液；
b、在反应器中加入发酵培养基，液面高度为2～20cm，灭菌后按5～30％的接种量接种步骤a得到的种子培养液，避光条件下，在温度22～28℃条件下进行液态发酵；所述液态发酵时底部和顶部都持续通入气体，直至菌体湿重达20～80g/L；之后，底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体，进行静置培养，直至长满白色孢子；之后再光照培养，直至长出子实体；
c、待步骤b发酵过程中的葡萄糖浓度降至1～5g/L以下时，向反应器中流加葡萄糖溶液；或当腺嘌呤浓度降至0.5～1g/L、甘氨酸浓度降至1～4g/L时，流加底物溶液；或当无机磷浓度降至0.01～0.05g/L时，流加营养液进行连续发酵，直到虫草素浓度下降30％时，发酵结束。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤a所述的种子培养基的组成包括：每L培养基中含葡萄糖20～40g、蛋白胨10～25g、酵母膏5～20g、磷酸氢二钾0.1～2g、硫酸镁0.1～2g、硫酸亚铁0.02～1g，余量为水。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤a所述的种子培养基的pH值为4.5～6.5。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的发酵培养基的组成包括：每L培养基中的葡萄糖20～50g、蛋白胨10～30g、酵母膏5～30g、胡萝卜汁20～200mL、麸皮浸出汁40～400mL、腺嘌呤1～5g、甘氨酸2～20g、谷氨酸1～8g、精氨酸1～8g、天冬氨酸1～8g、磷酸氢二钾0.05～1g、硫酸镁0.05～1g和硫酸亚铁0.05～1g，余量为水。
本发明采用了特别的液态发酵培养基，主要在于添加了腺嘌呤1～5g、甘氨酸2～20g，同时加入了谷氨酸1～8g、精氨酸1～8g、天冬氨酸1～8g，氨基酸可能强化了虫草素代谢途径，有利于提高前提物合成浓度。更进一步加入了胡萝卜汁20～200mL、麸皮浸出汁40～400mL，其中可能富含生长因子，促进菌体生长。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的发酵培养基的pH值为4.5～6.5。
进一步的，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述发酵培养基中的胡萝卜汁的制备方法为：取10～100g胡萝卜切块，加1～3倍水制浆，2～4层纱布过滤，滤液即为胡萝卜汁。
进一步的，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述发酵培养基中的麸皮浸出汁的制备方法为：取10～50g麸皮，加5～12倍水，60～120℃处理30～60分钟，冷却后用2～4层纱布过滤，收集过滤液即为麸皮浸出汁。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的反应器包括带夹套发酵罐、进气管路、排气管路，进料管路、出料管路以及底部微孔曝气盘；所述的进气管路为2个，一个从进气出口位于液面之上，一个进气出口位于液面之下，与微孔曝气盘相连接。
本发明还特别的要求发酵培养基加入的量为培养基的2～20cm，超过这个液面，溶氧降低，无法产生虫草素。本发明在步骤b液态发酵的时候进行了底部和顶部通气，目的也是为了增加发酵过程中的溶氧，提高虫草素的产量。
进一步的，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤b所述的反应器直径为8～20cm。本发明在限定了发酵培养基的液体高度的情况下，选择直径越大的容器，液体蒸发损失越大；直径越小，与空气接触面越小，影响氧交换。因此，发明人经过大量试验发现，容器直径为8～20cm最为合适。
本发明在液态发酵时底部和顶部都持续通入气体，直至菌体湿重达20～80g/L；之后，底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体，进行静置培养，直至长满白色孢子；之后再光照培养，直至长出子实体。其中的底部进气是主要为了增加溶液溶氧和搅拌的目的，顶部进气主要是保压，其次是增加氧分压。由于虫草素合成的时候对液体波动很敏感，如果连续通气培养，虫草素合成浓度将很低，甚至只长菌丝体，不产虫草素，前期连续通气是为了提高菌体浓度，后期间歇式是为了提高虫草素产量。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤c所述的葡萄糖溶液浓度为300～800g/L；所述的底物溶液中每升含腺嘌呤2～6g、甘氨酸20～60g；所述的营养液中每升含胡萝卜汁40～400mL、磷酸二氢钾0.5～4g、硫酸镁0.5～4g和硫酸亚铁0.1～0.5g。
其中，上述蛹虫草连续培养生产虫草素的方法中，步骤c所述的连续发酵时底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体。
进一步的，所述的间歇性通入气体是指每1～5小时通气1～10分钟，通气流量为0.1～0.8L/L/min。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例所用各原料均为普通市售产品。
实施例1蛹虫草发酵培养基制备与摇瓶静置发酵对比
种子培养基：(1000mL)：葡萄糖25g、蛋白胨15g、酵母膏10g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.4g、硫酸亚铁0.08g，其余为水。培养基配制好后分装于若干1L三角瓶中，每瓶各装200mL，121℃灭菌，冷却后备用。
发酵培养基(1000mL)：葡萄糖36g、蛋白胨15g、酵母膏10g、胡萝卜汁100mL、麸皮浸出汁100mL、腺嘌呤2g、甘氨酸6g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.4g和硫酸亚铁0.08g，其余为水。用盐酸调pH6.0。其中胡萝卜汁处理方式为：80g胡萝卜切块，加2倍水，用匀浆机制浆后，4层纱布过滤，收集过滤液。麸皮浸出汁处理方式为：20g麸皮，加10倍水，100℃处理45分钟，冷却后用4层纱布过滤，收集过滤液。培养基配制好后分装于若干1L三角瓶中，每瓶各装200mL，121℃灭菌，冷却后备用。
于种子培养基中接入3×106个/ml的蛹虫草孢子悬液10ml(蛹虫草孢子悬液的制备方法为：将琼脂表面上长好的蛹虫草孢子刮入到装有5mL无菌水和玻璃珠的50mL三角瓶中，充分震荡后用神奇滤布进行过滤，并用无菌水洗涤2～3次，最终用无菌水稀释到一定浓度制得孢子悬液。蛹虫草菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNo.18581)。26℃、180r/min条件下培养3天，然后按10％接种量接入发酵培养基中26℃静置培养21天。结果如下表1所示。
表1不同腺嘌呤和甘氨酸组合对虫草素产量影响
编号 腺嘌呤g/L 甘氨酸g/L 虫草素(g/L)
1 0 12 4.09
2 0 16 4.45
3 0 20 5.2
4 1 12 4.98
5 1 16 5.44
6 2 6 5.75
7 2 12 5.37
8 2 16 5.83
9 4 0 3.82
由表1可见，在腺嘌呤2g/L、甘氨酸6g/L时虫草素的产量最高(作为后续对照组)。
采用腺嘌呤2g/L、甘氨酸6g/L的培养基作为对照组，分别考察了在培养基中添加其他不同的氨基酸对虫草素产量的影响，结果如下表2所示。
表2不同氨基酸对虫草素产量影响
Figure BDA0002992967390000061
通过上表发现，谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸对虫草素合成均有明显提升作用。
在添加腺嘌呤2g/L、甘氨酸6g/L、添加谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的前提下，考察在培养基中再加入胡萝卜汁和麸皮水对虫草素产量的影响，结果如下表3所示。
表3胡萝卜汁和麸皮水对发酵影响
对照 不加胡萝卜汁 不加麸皮水 两者同时不加
菌体干重g/L 19.2 17.8 18.3 17.1
虫草素g/L 5.75 4.22 4.01 3.59
通过上表发现，胡萝卜汁和麸皮水对虫草素合成均有显著提升作用。
实施例2发酵罐子实体培养
种子培养基和种子培养同实施例1。发酵培养基(1000mL)配制：葡萄糖36g、蛋白胨15g、酵母膏10g、胡萝卜汁100mL、麸皮浸出汁100mL、腺嘌呤2g、甘氨酸6g、谷氨酸6g、精氨酸3g和天冬氨酸6g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.4g和硫酸亚铁0.08g，其余为水，用盐酸调pH6.0，其中胡萝卜汁处理方式和麸皮处理方式同实施例1。
反应器装入高度4cm的发酵培养基，灭菌冷却后按15％接种量将种子液接入罐内。底部通气培养，至菌体湿重达70g/L。再从顶部通气保压(底部通气关闭)，压力0.03Mpa,25℃下避光培养至表面长满子实体，然后光照培养，前7天持续光照(同时每5小时通气1分钟)，后期每天光照12小时(同时每5小时通气2分钟，通气量均为0.2L/L/min)。培养周期21天，结果如下表4所示：
表4不同液位高度和底部通气对发酵的影响
编号 1 2 3 5 6 7
液面高度cm 3 6 6 9 9 12
底部阶段通气 不通气 不通气 通气 不通气 通气 不通气
干重g/L 20.3 16.2 18.4 10.1 12.6 8.2
虫草素g/L 6.4 4.9 5.7 2.5 4.3 1.1
由实施例2可看出，随着装液高度提高，菌体生长和虫草素合成均有显著下降，但阶段性通气对菌体生长和虫草素产量均有显著提高的作用。即阶段性通入微气泡可以抵消液面对虫草素发酵的不利影响。
实施例3连续发酵
种子培养和子实体培养同实施例2，其中装液高度6cm。在子实体长出后，检测培养基中葡萄糖、底物和无机磷等指标。待3个控制指标葡萄糖浓度降至2g/L以下、腺嘌呤和甘氨酸浓度降至1g/L和2g/L以下、无机磷浓度降至0.02g/L，分别流加葡萄糖溶液、底物溶液和营养液。其中葡萄糖溶液为浓度300～800g/L的葡萄糖溶液，底物溶液(1000mL)配制为：腺嘌呤6、甘氨酸60g，营养液(1000mL)为：胡萝卜汁200mL、磷酸二氢钾4g、硫酸镁4g、硫酸亚铁0.5g。底部通气采用间歇式，即每3小时通气2分钟，通气流量为0.1L/L/min。待液面超过原始液面时，从排料口排出发酵液。待葡萄糖流速和底物流加速率显著下降结束反应(培养周期约为40天)。结果单位时间内总生产的虫草素质量为实施例2中的编号3的2.1倍，子实体高度提高67％。
本发明提供了一种连续液态发酵蛹虫草生产虫草素的方法，通过配制发酵培养基，配合使用特别的发酵方法，可显著提高虫草素产量，并且可以连续生产，虫草素产量进一步提高，具有重要的现实意义。

Claims (8)

1.蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、配制蛹虫草种子培养基，在每L种子培养基中接入1.0～9.0×106个/ml 的蛹虫草孢子悬液40～100ml，在温度22～28℃，转速150～250r/min条件下进行种子培养2～4天，得到种子培养液；
b、在反应器中加入发酵培养基，液面高度为2～20cm，灭菌后按5～30%的接种量接种步骤a得到的种子培养液，避光条件下，在温度22～28℃条件下进行液态发酵；所述液态发酵时底部和顶部都持续通入气体，直至菌体湿重达20～80g/L；之后，底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体，进行静置培养，直至长满白色孢子；之后再光照培养，直至长出子实体；所述的发酵培养基的组成包括：每L培养基中的葡萄糖20～50g、蛋白胨10～30g、酵母膏5～30g、胡萝卜汁20～200mL、麸皮浸出汁40～400mL、腺嘌呤1～5g、甘氨酸2～20g、谷氨酸1～8g、精氨酸1～8g、天冬氨酸1～8g、磷酸氢二钾0.05～1g、硫酸镁0.05～1g和硫酸亚铁0.05～1g，余量为水；
c、待步骤b发酵过程中的葡萄糖浓度降至1～5g/L以下时，向反应器中流加葡萄糖溶液；或当腺嘌呤浓度降至0.5～1g/L、甘氨酸浓度降至1～4g/L时，流加底物溶液；或当无机磷浓度降至0.01～0.05g/L时，流加营养液进行连续发酵，直到虫草素浓度下降30%时，发酵结束；步骤c所述的葡萄糖溶液浓度为300～800g/L；所述的底物溶液中每升含腺嘌呤2～6g、甘氨酸20～60g；所述的营养液中每升含胡萝卜汁40～400mL、磷酸二氢钾0.5～4g、硫酸镁0.5～4g和硫酸亚铁0.1～0.5g。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：步骤a所述的种子培养基的组成包括：每L培养基中含葡萄糖20～40g、蛋白胨10～25g、酵母膏5～20g、磷酸氢二钾0.1～2g、硫酸镁0.1～2g、硫酸亚铁0.02～1g，余量为水。
3.根据权利要求1所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：步骤a所述的种子培养基的pH值为4.5～6.5。
4.根据权利要求1所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：步骤b所述的发酵培养基的pH值为4.5～6.5。
5.根据权利要求1所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：步骤b所述的反应器包括带夹套发酵罐、进气管路、排气管路，进料管路、出料管路以及底部微孔曝气盘；所述的进气管路为2个，一个从进气出口位于液面之上，一个进气出口位于液面之下，与微孔曝气盘相连接。
6.根据权利要求1所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：步骤b所述的底部和顶部通气通入的为压缩空气或氧气，通入气体的压力为0.03～0.08Mpa。
7.根据权利要求1所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：步骤c所述的连续发酵时底部间歇性通入气体，顶部持续通入气体。
8.根据权利要求7所述的蛹虫草连续培养生产虫草素的方法，其特征在于：所述的间歇性通入气体是指每1～5小时通气1～10分钟，通气流量为0.1～0.8L/L/min。
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