KR20080069571A - 산 대사산물 생성의 조절 - Google Patents

산 대사산물 생성의 조절 Download PDF

Info

Publication number
KR20080069571A
KR20080069571A KR1020087005089A KR20087005089A KR20080069571A KR 20080069571 A KR20080069571 A KR 20080069571A KR 1020087005089 A KR1020087005089 A KR 1020087005089A KR 20087005089 A KR20087005089 A KR 20087005089A KR 20080069571 A KR20080069571 A KR 20080069571A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acid
culture medium
penicillium
oxygen saturation
mpa
Prior art date
Application number
KR1020087005089A
Other languages
English (en)
Inventor
즈데네크 포크루다
요세프 사트케
플라디미르 팔라
요세프 팔리크
Original Assignee
테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 filed Critical 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드
Publication of KR20080069571A publication Critical patent/KR20080069571A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 미코페놀산과 같은 산 대사산물을 제조하는 방법, 및 증가된 수율로 미코페놀산을 생성하는 방법에 사용하는, 기탁 번호 CCM 8364인 페니실리움 종의 균주를 제공한다.

Description

산 대사산물 생성의 조절{REGULATION OF ACID METABOLITE PRODUCTION}
본 출원은 미국 가출원 60/818,145호(2006년 6월 29일 출원) 및 60/847,344호(2006년 9월 25일 출원)를 우선권으로 주장한다. 상기 출원의 내용은 본원에 참고 인용된다.
기술 분야
본 발명은 발효 배양액 중 산소 포화도를 제어하여 미생물 세포에 의한 산 대사산물 생성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 배양 배지 중 산소 포화도를 조절함으로써 페니실리움(Penicillium)에 의한 미코페놀산의 생성을 조절하는 방법, 및 기탁 번호 CCM 8364인 페니실리움의 신규한 분리 균주에 관한 것이다.
미코페놀산(MPA로서 지칭함)은 페니실리움의 몇몇 종(Imperial Chemical Industries GB 1 15S 387 (1967), Lilly & Co Elli GB 1 593 208 (1978)) 또는 페니실리움으로부터 얻어진 돌연변이주(Ajinimoto KKUS 4 452 891 (1981))에 의해 생성된 대사산물이다. MPA는, 예를 들어 항균제(Florey et al., 1946), 항종양제(Williams et al., J. Antibiot., 21, 463 (1968), 및 면역억제제(Mitsui, Suzuki, 1969)로서의 생물학적 및 약학적 활성을 갖는다. 치료에 있어서는, MPA의 2-모르폴리노에틸 에스테르 유도체인 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이 통상 사용된다.
Figure 112008015163367-PCT00001
MPA를 생성하기 위한 방법 중 하나는 EP 1 624 070 A1에 기술된 바와 같이 NaOH를 사용하여 pH 4∼7을 유지함으로써 발효 배지의 pH를 조절하는 액침 배양 발효 중에서의 방법이다.
MPA는 문헌[Imperial Chemical Industries GB 1158 387 (1967); BIOCON, WO 01/64931 Al (2001); 및 IVAX, WO 2006/031665 (2006), WO 01/21607 및 WO 2005/105768)]에 개시된 것을 포함하는 다수의 방법으로 발효 배지로부터 분리할 수 있다. 그리고나서 분리된 MPA는 미코페놀레이트 모페틸의 생성에 이용된다(WO 02/100855).
고농도의 MPA 생성은 활성 약학 성분인 미코페놀레이트 모페틸을 주성분으로 하는 약물을 효과적이며 경제적으로 생성시키는데 바람직하다.
발명의 개요
일측면에 있어서, 본 발명은 미생물 세포에 의해 생성된 산 대사산물의 생성을 조절하는 방법으로서, 미생물 세포를 포함하는 배양 배지의 산소 포화도를 조절하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 방법은 액침 발효 배양 시스템에 산 대사산물 생성 미생물 세포를 제공하는 단계 및 이러한 배양으로 미생물 세포로부터 산 대사산물을 생성하는 단계를 포함하며, 이때 배양 배지의 산소 포화도를 조절하여 배양 배지의 pH를 제어한다. 바람직하게는, 산 대사산물은 미코페놀산(MPA)이다.
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 미코페놀산 생성 미생물 세포를 포함하는 발효 배양액의 산소 포화도를 조절하여 제조되는 미코페놀산을 미코페놀레이트 모페틸로 전환시키는 단계를 포함하는 미코페놀레이트 모페틸의 제조 방법을 제공한다.
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 체코 공화국 브르노 마사리크 대학교 소재의 체코 미생물 보존 센터(Czech Collection of Microorganism; CCM)에 기탁 번호 CCM 8364로 기탁된 페니실리움 종의 균주를 추가로 제공한다. 기탁 번호 CCM 8364로 기탁된 페니실리움 종의 균주는 (배양 배지 1 ℓ 당 MPA 1 g을 초과하는) 고농도의 미코페놀산을 생성한다.
발명의 상세한 설명
본원에 사용된 바와 같이, MPA와 관련된 경우 용어 "고농도(high level 또는 high concentrations)"란 발효 배양액(배양 배지) 1 ℓ 당 MPA 약 1 g 초과, 바람직하게는 약 6∼약 10 g의 농도를 의미한다.
액침 배양 발효의 생성 배지에서 고농도의 MPA를 얻는 데에는 몇가지 요인이 중요하다. 상기 요인들은 배지의 조성 및 배양 조건을 포함한다. 특히, 발효 배양액의 최적의 pH는 생성기 동안 유지되어야만 한다. 통상 NaOH의 첨가를 이용하여 발효 배양액의 pH를 조절하고 pH 4∼7을 유지한다. 또한 NaOH를 이용하여 대수증식기(log phase of growth)가 종료된 후 pH 이동을 유발한다. 본 발명은 발효 배양액/배양 배지에 화학 물질의 첨가 없이 산소 농도를 조절함으로써 발효 배양액/배양 배지의 pH를 조절하여 MPA의 생성을 조절하는 신규한 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 천연 공급원만을 사용하여 발효 배양액/배양 배지의 pH를 조절한다. 이러한 호기성 공정의 조절된 폭기에 의해 공기를 사용하여 산소를 포화시킴으로써 공정의 pH를 조절한다. 따라서, 본 발명의 공정은 유해 산 및/또는 알칼리 화합물의 소비량을 감소시킨다.
본 발명은 발효 배양액의 산소 포화도를 조절함으로써 산 대사산물 생성 미생물 세포의 생성을 조절하는 방법을 제공한다. 더욱 자세하게는, 상기 방법은 배양 배지의 산소 포화도를 조절/제어하여 산 대사산물을 생성하는 액침 발효 배양 시스템에 미생물 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 배양 배지의 산소 포화도를 조절 또는 제어하는 단계는 배양 배지의 pH가 pH 4∼pH 7, 바람직하게는 pH 4∼pH 6, 더욱 바람직하게는 pH 4∼pH 5.5를 유지한다. 그러한 조절은 발효 배양액(배양 배지)에서 고농도의 산 대사산물이 얻어지는 산 대사산물의 생성 방법을 제공한다. 바람직하게는, 산 대사산물은 우론산, 파스팔산, 리세르그산의 메틸카르비놀아민, 및 미코페놀산으로 이루어진 군에서 선택한다. 바람직하게는 산 대사산물은 미코페놀산이다.
바람직하게는, 미생물 세포는 진균 세포 및 박테리아 세포로 이루어진 군에서 선택한다. 바람직하게는, 미생물 세포는 진균 세포이고, 더욱 바람직하게는, 미생물 세포는 미코페놀산을 생성하는 페니실리움 종 세포, 파스팔산을 생성하는 클라비셉스(Claviceps) 종 세포 및 메틸카르비놀아민, 또는 우론산을 생성하는 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) 세포이다. 바람직하게는, 페니실리움 종 세포는 페니실리움의 단일 균주이다. 바람직하게는, 페니실리움의 균주는 기탁 번호가 CCM 8364인 균주이다.
본 발명의 방법에 있어서, 적당한 배양 배지는 기초 및 복합 질소 공급원을 포함한다. 기초 질소 공급원은, 예를 들어 단순 무기 분자, 아미노산, 또는 질소를 함유하는 기타 유기 화합물, 예컨대 암모니아/암모늄 염, 임의의 천연 발생 아미노산 등일 수 있다. 바람직한 복합 질소 공급원은 가수분해된 카세인 및/또는 옥수수 침지물이다. 배양 배지는 또한 탄소 공급원을 포함한다. 배양 배지에 사용하기 적당한 탄소 공급원은 탄수화물, 바람직하게는 당류, 더욱 바람직하게는 단당류, 더욱 바람직하게는 자당일 수 있다.
또한, 배양 배지는 복합 질소 공급원 이외에 특정 아미노산 보충물을 포함하거나, 또는 기초 질소 공급원은 단순 아미노산이다. 바람직하게는, 아미노산 보충물은 글리신, 메티오닌 및 아스파라긴 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는 메티오닌은 D,L-메티오닌이다. 바람직하게는 아스파라긴은 L-아스파라긴이다.
아미노산 보충물에서 아미노산은 통상 약 1∼약 30 g/ℓ, 바람직하게는 약 5∼약 8 g/ℓ의 농도로 사용된다. 글리신은 통상 약 1∼약 30 g/ℓ의 농도로 사용되고, 바람직하게는 글리신은 약 2∼약 20 g/ℓ의 농도로 사용되고, 더욱 바람직하게는 글리신은 약 30∼약 15 g/ℓ의 농도로 사용되며, 더욱 더 바람직하게는 글리신은 약 5∼약 8 g/ℓ의 농도로 사용된다.
D,L-메티오닌은 통상 약 0.01∼약 10 g/ℓ의 농도로 사용되고, 더욱 바람직하게는 D,L-메티오닌은 약 0.1∼약 1 g/ℓ의 농도로 사용된다.
L-아스파라긴은 통상 약 1∼약 30 g/ℓ의 농도로 사용되고, 더욱 바람직하게는 L-아스파라긴은 약 2∼약 20 g/ℓ의 농도로 사용되고, 더욱 더 바람직하게는 L-아스파라긴은 약 3∼약 15 g/ℓ의 농도로 사용되며, 더욱 더 바람직하게는 L-아스파라긴은 약 5∼약 8 g/ℓ의 농도로 사용된다.
페니실리움 종이 규정된 산소 포화도를 갖는 액침 발효 배양에서 성장하는 경우 MPA 생성의 조절이 일어난다. 그러한 액침 발효 배양에 있어서, 배양 배지의 산소 포화도는 생성기의 적어도 일부분 동안 조절된다. 대안적으로, 산소 포화도는 전체 생성기에 걸쳐 조절된다. 따라서, 배양 배지의 산소 포화도는 0∼24시간, 또는 0∼48시간, 또는 24∼48시간 또는 48시간 동안 조절될 수 있다. 바람직하게는, 산소 포화도는 생성기의 마지막에 탄소 공급원의 고갈로 인한 pH의 증가 때까지 조절된다.
액침 발효 중 MPA의 생성은 배양 배지의 산소 포화도를 조절함으로써 증가시킬 수 있다. 바람직하게는 산소 포화도는 5∼40% 범위이고, 더욱 바람직하게는 산소 포화도는 5∼35% 범위이고, 더욱 더 바람직하게는 산소 포화도는 5∼30% 범위이다. % 산소 포화율이란 pO2 전극으로 측정된 pO2를 의미함으로써, 100% 산소 포화율은 미생물 세포 배양 없이 배양 배지의 최대 폭기와 서로 관련된다.
바람직한 구체예에 있어서, 페니실리움 종은 배양의 접종 단계 및 생성 단계에서 상이한 배양 배지에서 성장한다. 제1 단계(접종 단계)는 T=O 시간에서 시작하고, 제2 단계는 T=24 시간에서 시작하며 제3 단계(생성 단계)는 T=48 시간에서 시작할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 접종 배지에서 미생물 세포가 성장하는 단계, 및 생성 배지 부피의 20% 이상, 바람직하게는 25% 이상의 접종물을 생성 배지에 접종시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 배지의 pH는 pH 4 이상, 바람직하게는 pH 4∼pH 7을 유지한다. 바람직하게는, 배양 배지의 산소 포화도를 조절함으로써 이를 유지한다. pO2 전극을 사용하여 산소 농도를 연속적으로 모니터링하고, 필요시 교반 속도 및 첨가된 공기 부피를 조정함으로써 산소 농도를 조절하여 배양 배지의 산소 포화도를 조절한다. 따라서, 배양 배지의 pH는 산 대사산물이 발효 배양 시스템에서 활성적으로 생성되는 시기인 배양의 생성 단계 동안 pH 4보다 높은 pH에서 유지될 수 있다. 이 기간은 미생물 세포가 사용된 접종 물질을 발효 배양 시스템으로 이전한 후 시작될 수 있다. 바람직하게는 pH는 배양 중 생성 단계 동안 pH 4.5보다 크고, 더욱 바람직하게는 pH는 배양 중 생성 단계 동안 약 pH4.5∼약 pH 5.5이다.
상기와 같이 조절된 액침 배양의 온도는 MPA를 생성하기에 적당한 시간 동안 약 20℃∼약 30℃를 유지한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 있어서 액침 배양의 온도는 약 240시간∼약 300시간 동안 약 24℃∼약 26℃를 유지한다.
배양 배지 중 산소 포화도를 조절하는 본 발명의 방법에 따른 MPA 생성의 조절은 최종 농도(g/배양 배지의 ℓ)가 1 g/ℓ 초과, 더욱 바람직하게는 2 g/ℓ 초과 또는 3 g/ℓ 초과, 더욱 더 바람직하게는 4 g/ℓ 초과, 더욱 더 바람직하게는 5 g/ℓ 초과, 6 g/ℓ 초과 또는 8 g/ℓ를 초과하는 MPA를 유발한다.
또한 본 발명은 고농도, 예컨대 1 g/ℓ 등을 초과하는 MPA를 생성하는 페니실리움 종(기탁 번호 CCM 8364로 기탁됨)의 신규한 균주를 제공한다. 상기 균주는 균주 CCM 8364가 생성하였던 야생형 페니실리움 종 균주와 비교하였을 때 고농도의 MPA를 생성한다. 그러한 야생형 페니실리움 종 균주는 액침 배양으로 성장하는 경우 약 600 mg/ℓ의 평균 수율로 MPA를 생성한다.
또한 상기 균주의 배양, 바람직하게는 순수한 배양, 예컨대 기탁 번호 CCM8364인 진균 균주의 세포를 성장시키는 단계만을 포함하는 배양을 제공한다. 상기 배양은 바람직하게는 그러한 진균 균주가 약 90% 이상이다. 배양시 이 균주는 임의의 표면 또는 환경 상에서 또는 그 안에서 개별 세포, 세포 응집체, 균사, 사상체, 및 이의 응집체의 형태로 존재할 수 있다.
기탁 번호가 CCM8364인 페니실리움 종의 균주는 최종 농도(g/배양 배지의 ℓ)가 1 g/ℓ 초과, 더욱 바람직하게는 2 g/ℓ 초과 또는 3 g/ℓ 초과, 더욱 더 바람직하게는 4 g/ℓ 초과, 더욱 더 바람직하게는 5 g/ℓ 초과, 6 g/ℓ 초과 또는 8 g/ℓ를 초과하는 MPA를 생성할 수 있다.
페니실리움 종 균주인 CCM 8364는 양성 선택 배지를 겸비한 화학적 및 물리적 돌연변이 방법의 시스템을 사용하여 생성된다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 미코페놀산을 제조하여 미코페놀레이트 모페틸을 제조하는 단계, 및 이를 미코페놀레이트 모페틸로 추가 전환하는 단계에 관한 방법을 추가로 제공한다. 미코페놀산은, 예를 들어 WO 02/100855에 기술된 방법에 따라 미코페놀레이트 모페틸로 전환될 수 있다.
따라서, 특정 바람직한 구체예 및 예시와 관련하여 본 발명을 기술하였으나, 당업자는 명세서에 개시된 본 발명의 범위와 취지가 벗어나지 않도록 기술 및 예시된 본 발명의 변형을 알 수 있다. 본 특허 출원에 제시된 참조 문헌의 개시물은 본원에 참고 인용된다. 또한, 하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 추가로 예시하고 있으나, 사실상 한정하는 것은 아니다.
도 1: 산소 포화도를 조절함으로써 배양 배지 pH를 조절하여 pH 4.5 이상을 얻는 것을 도시하는 그래프.
도 2: 산소 포화도를 조절함으로써 배양 배지 pH를 조절하여 pH 4.5 이하를 얻는 것을 도시하는 그래프.
실시예 1: 페니실리움 균주 CCM 8364의 성장 특징
거시적 형태
한천 증점 맥아 배지(agar-thickened malt medium) - MEA - (35 g 맥아 추출물, 5 g 펩톤, 13 g 한천, 1000 ㎖ H2O)에서 부패 유기성 성장 동안, 균주 CCM 8364 는 7일 배양 후 직경이 1.1 cm인 스파셀루스 공동 균사체의 콜로니를 형성한다. 표면 질감은 벨벳형 단모(velutinous)이고, 중심부에 돌기가 있으며 가장자리는 백색이다. 분생자 발생 수준은 중간이고, 콜로니는 갈색에 가까운 담황색이고, 반대편은 담황색이며, 삼출물이 존재한다.
한천 증점 Czapek 이스트 배지에서 부패 유기성 성장 동안, 균주 CCM 8364는 7일 배양 후 직경이 2.3 cm인 스파셀루스 공동 균사체의 콜로니를 형성한다. 표면 질감은 벨벳형 단모이고, 방사형으로 홈이 있고, 가장자리가 백색이며, 중심부에 돌기가 있다. 분생자 발생 수준은 중간이고, 콜로니는 갈색에 가까운 적갈색이고, 반대편은 황갈색이며, 삼출물이 존재한다.
한천 증점 생성 배지 G25N에서 부패 유기성 성장 동안, 균주 CCM 8364는 7일 배양 후 직경이 0.3 cm인 스파셀루스 공동 균사체의 콜로니를 형성한다. 표면 질감은 벨벳형 단모이다. 분생자 발생 수준은 약중간이고, 콜로니는 중간이 편평하거나 또는 백색 가장자리가 돌출되고, 암회색-녹색이 감도는 연한 청록색의 회색, 반대편은 담색이며, 삼출물은 없다.
미시적 형태
균사체는 균병 300-600 x 4-6 μm로 이루어지고, 표면은 평탄하고, 페니실리움 변종이며, 불균일 패턴으로 발생하는 분지점이 더욱 많은 3윤생체(terveticillate)의 불규칙한 것으로서, 2-3의 윤생체의 분기가 있고, 12-20 x 4-4.5 μm의 윤생체의 기저경자가 있고, 13-16 x 2.5-3 μm로 측정된 경자 단지형-바늘형이 있고, 단쇄의 분생자가 있고, 분리부가 있는 회전 타원체 3.5-5.5 μm, 타원체 4-6 x 2-4 μm이고, 뚜렷하게 울퉁불퉁한 벽을 가진다.
실시예 2: MPA 분석
MPA 생성에 대해 각 분리물을 평가하였다. 이러한 분석은 2 단계-접종 및 생성로 이루어진다. 접종 배지(IM)는 탄소 공급원(예, 자당), 질소 공급원(적당한 공급원은 가수분해된 카세인 및 옥수수 침지물을 포함함) 및 무기 염(예, KH2PO4)을 포함한다. IM 50 ㎖를 250 ㎖ Erlenmeyer 플라스크에서 20분 동안 120℃로 멸균하였다. 분리물의 포자를 멸균수 20 ㎖와의 한천 경사 배양으로 세척하였다. 상기 포자 현탁액 5 ㎖를 IM용 접종물로 사용한 후 진탕 동안 280 회전/분의 교반 속도로 24∼28℃에서 3∼5일 동안 배양하였다. 생성된 IM을 총 부피의 10%를 첨가함으로써 생성 배지(PM)의 접종에 사용하였다. MPA 분석을 위해 본 발명에 사용된 PM은 탄소 공급원 (예, 자당), 질소 공급원 (적당한 공급원은 글리신, 아스파라긴, 메티오닌으로서 카세인 및 아미노산을 포함함) 및 무기 염(예, K3PO4, MgSO4)을 포함한다. PM 50 ㎖을 250 ㎖ Erlenmeyer 플라스크에서 20분 동안 120℃로 멸균하였다. 그리고나서 10∼14일 동안 진탕하면서 24∼28℃에서 호기성 조건 하에 테스트 배양을 수행하였다. 교반 속도는 280 회전/분이었다. 상기 기술된 pH 측정기를 사용하여 접종 전(pH 4.9∼pH 5.1)에 배지의 pH를 측정하고 실험 종료 전에 2회 또는 3회 측정하였다. 산소 포화도를 실험실 또는 공장 발효기에서 연속적으로 측정하였다. 당업자에게 공지된 표준 기술에 따라 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 MPA 함유 분액을 분석하여 표준과 대조하여 MPA 함량을 측정하였다(연구 리포트 RR/RD/CH024/01- A, 재실험 RR/RD/AN061/05-A에 따른 내부 IVAX 표준 MPA). 사용된 컬럼: Chromolith speed ROD, RP18e, 50x4.6mm(MERCK사 제조), 이동상: 아세토니트릴 40%, H3PO4/ℓ H2O 680 ㎕를 함유하는 물 60%, 플로우 5-6.5 ㎖/분 및 온도 30℃.
실시예 3: 돌연변이 및 선택 방법
1. 선택
절차의 제1 단계에 있어서, 야생형 페니실리움 종의 포자 형성된 경사를 물에 현탁시켜 분사체 분획을 결여시킨다. 그리고나서 현탁액을 100 포자/㎖로 희석하고 MEA를 포함하는 패트리 플레이트 상에 전개하였다. 그리고나서 플레이트를 7일 동안 24∼27℃에서 항온처리하였다. 한천 플레이트 상에서 성장한 콜로니를 골라서 Blacke 플라스크에서 동일한 영양소 한천 배지의 경사를 유지하였다. 배양 16일 후, 단일콜로니 분리물을 생성 테스트로 테스트하였다. 최상의 생성물인 분리물(발효 배양액 중 1.2 g MPA/ℓ)을 다음 단계에서 돌연변이시켰다.
2. N-메틸-N'-니트로-N-니트로소-구아니딘(NG)을 이용한 돌연변이
포자가 형성된 경사를 물에 현탁시켜 분사체 분획을 결여시킨다. 그리고나서 8시간 동안 식염수 중 0.2 M NG 용액에 분생자 집단을 노출시켰다. 이러한 돌연변이 처리에 있어서, 대략 포자의 99.9%가 살생되었다. 그리고나서 테스트된 포자를 돌연변이체가 없도록 세척하고 MEA를 포함하는 패트리 플레이트 상에 전개하였다. 플레이트를 7일 동안 24∼27℃에서 항온처리하였다. 한천 플레이트 상에서 성장한 콜로니를 골라서 Blacke 플라스크에서 동일한 영양소 한천 배지의 경사를 유지하였 다. 배양 16일 후, 단일콜로니 분리물을 생성 테스트로 테스트하였다. 최상의 생성물인 분리물(발효 배양액 중 2.4 g MPA/ℓ)을 다음 단계에서 돌연변이시켰다.
3. 에틸메탄설포네이트(EMS)를 이용한 돌연변이
포자가 형성된 경사를 물에 현탁시켜 분사체 분획을 결여시킨다. 16시간 동안 식염수 중 0.2 M EMS 용액에 분생자 집단을 노출시켰다. 이러한 돌연변이 처리에 있어서, 대략 포자의 99.9%가 살생되었다. 그리고나서 포자를 돌연변이체가 없도록 세척하고 MEA를 포함하는 패트리 플레이트 상에 접종하였다. 콜로니가 플레이트 상에 형성될 때까지 플레이트를 24∼27℃에서 항온처리하였다. 콜로니를 골라서 Blacke 플라스크에서 동일한 영양소 한천 배지의 경사를 유지하였다. 배양 16일 후, 단일콜로니 분리물을 생성 테스트로 테스트하였다. 최상의 생성물인 분리물(발효 배양액 중 5.6 g MPA/ℓ)을 다음 단계에서 돌연변이시켰다.
4. UV 조사를 이용한 돌연변이
포자가 형성된 경사를 물에 현탁시켜 분사체 분획을 결여시킨다. 1x105 포자/㎖에 현탁액을 희석시키고 MEA를 포함하는 패트리 플레이트 상에 전개하였다. 방사선 적량이 약 500초 동안 약 15 Jm-2s-1인 UV 조사에 플레이트를 노출시켰다. 이러한 돌연변이 처리에 있어서, 대략 포자의 99.9 %가 살생되었다. 그리고나서 패트리 플레이트를 7일 동안 24∼27도에서 항온처리하였다. 한천 플레이트 상에서 성장한 콜로니를 골라서 Blacke 플라스크에서 동일한 영양소 한천 배지의 경사를 유지하였다. 배양 16일 후, 단일콜로니 분리물을 생성 테스트로 테스트하였다. 최상의 생성 물인 분리물(발효 배양액 중 6.O g MPA/ℓ)을 다음 단계에서 돌연변이시켰다.
5. 감마선 조사를 이용한 돌연변이
포자가 형성된 경사를 물에 현탁시켜 분사체 분획을 결여시킨다. 현탁액을 1x105 포자/㎖로 희석시키고 방사선 적량이 1500 Gy인 감마선에 노출시켰다. 조사된 분리물을 MEA가 포함된 패트리 플레이트 상에 전개하였다. 그리고나서 패트리 플레이트를 콜로니가 플레이트 상에 형성될 때까지 24∼27℃에서 항온처리하였다. 콜로니를 골라서 Blacke 플라스크에서 동일한 영양소 한천 배지의 경사를 유지하였다. 배양 16일 후, 단일콜로니 분리물을 생성 테스트로 테스트하였다. 최상의 생성물인 분리물(발효 배양액 중 1O g MPA/ℓ)을 Blacke 플라스크 내 한천 배지에서 2회 계대하였다. 각 계대 후, 생성 테스트를 수행하여 연속된 MPA의 높은 생성율을 입증하였다.
상기 신규로 생성된 균주를 체코 공화국 브르노 티브르데호 14 마사리크 대학교 소재의 체코 미생물 보존 센터(Czech Collection of Microorganisms; CCM)에 부다페스트 조약 하에 기탁 번호 CCM 8364로 기탁하였다.
양성 선택 절차가 겸비되었을 경우 돌연변이 절차의 시스템은 MPA 분석에 따라 MPA 평균 함량이 모균주용 발효 배양액 600 mg MPA/ℓ에서 균주 CCM 8364용 발효 배양액 1O g MPA/ℓ로 증가한다.
실시예 4: 높은 산소 포화 배양 중 발효 동안의 MPA 생성
총 부피가 약 14 입방 미터인 액침 발효기에서 발효를 위해 균주 CCM 8364를 사용하였다. 초기 pH 5.0에서 생성 배지는 탄소 공급원으로서 자당 및 질소 공급원으로서 가수분해된 카세인, 글리신, 아스파라긴과 메티오닌 및 K, P 및 Mg를 비롯한 무기물을 포함하였다. 생성 배지를 제3 단계 접종물(대략 26% w/w)로 접종하였다. 배양 온도는 24∼26℃이고 생성 발효 시간은 285시간이었다. 30%보다 높은 농도로 산소를 포화시켜 배양 배지의 pH를 조절하였다. 용해된 산소, 배양 중 pH 및 생성 단계 종료시 MPA의 농도 값을 하기 표에 요약한다. 생성 배지의 산소 포화도때문에 pH는 pH 4 이하로 떨어졌고 최종 MPA 생성 농도는 5.7 g MPA/ℓ에 도달하였다.
번호 시간 24 48 72 120 144 164 192 240 MPA g/ℓ
1 산소 포화도 45% 37% 36% 60% 64% 64% 76% 79% 5.7
pH 4.52 4.82 4.45 3.84 3.96 3.77 3.91 4.65
실시예 5: 배지 산소 포화 배양 중 발효 동안의 MPA 생성
총 부피가 14 입방 미터인 액침 발효기에서 발효를 위해 균주 CCM 8364를 사용하였다. 초기 pH 5.0에서 생성 배지는 탄소 공급원으로서 자당 및 질소 공급원으로서 가수분해된 카세인, 글리신, 아스파라긴과 메티오닌 및 K, P 및 Mg를 비롯한 무기물을 포함하였다. 생성 균주인 페니실리움 종(CCM 8364)을 발효에 사용하였다. 생성 배지를 제3 단계 접종물(대략 26% w/w)로 접종하였다. 배양 온도는 24∼26℃이고 생성 발효 시간은 278시간이었다. 산소를 포화시킴으로써 배양 배지의 pH를 조절하였다. 용해된 산소, 배양 중 배양 배지의 pH 및 생성 단계 종료시 MPA의 농도 값을 하기 표에 요약한다.
번호 시간 24 48 72 120 144 164 192 240 MPA g/ℓ
2 산소 포화도 24% 18% 17% 24% 20% 21% 18% 16% 7.5
pH 4.24 4.54 4.77 5.15 5.37 5.14 4.47 4.41
실시예 6: 낮은 산소 포화 배양 중 발효 동안의 MPA 생성
총 부피가 14 입방 미터인 액침 발효기에서 발효를 위해 균주 CCM 8364를 사용하였다. 초기 pH 5.0에서 생성 배지는 탄소 공급원으로서 자당 및 질소 공급원으로서 가수분해된 카세인, 글리신, 아스파라긴과 메티오닌 및 K, P 및 Mg를 비롯한 무기물을 포함하였다. 생성 배지를 제3 단계 접종물(대략 26% w/w)로 접종하였다. 143시간 동안 탄소 공급원(1x10% w/w)을 발효 배양액에 공급하고 생성 발효 시간은 257시간에서 종료되었다. 산소를 포화시킴으로써 배양 배지의 pH를 조절하였다. 용해된 산소, 배양 중 배양 배지의 pH 및 생성 단계 종료시 MPA의 농도 값을 하기 표에 요약한다.
번호 시간 24 48 72 120 144 164 192 240 MPA g/ℓ
3 산소 포화도 30% 25% 17% 18% 13% 11% 9% 9% 8.2
pH 4.03 4.19 4.65 5.05 5.09 5.06 4.86 5.65
실시예 7: WO 02/100855에 따른 미코페놀산으로부터의 미코페놀레이트 모페틸의 생성
실시예 5에 따라 제조된 미정제 미코페놀산 100 g을 200 ㎖ 디부틸 에테르와 함께 환류 냉각기가 구비된 반응 플라스크에 투입하였다. 연속적인 교반 하에서 혼합물을 최대 50∼60℃로 가온한 후 2-모르폴리노에탄올 40 ㎖를 첨가하였다. 물의 공비적 분리 하에서 반응 혼합물을 최대 비점으로 가온하였다. 48시간 후, 혼합물 을 최대 23℃로 냉각하고 디클로로메탄 200 ㎖를 첨가하였다. 0.5 M 수성 K2CO3 100 ㎖로 2회 물 100 ㎖로 1회 용액을 추출하였다. 그리고나서 디클로로메탄을 진공 하에서 증류시키고 현탁액을 최대 10∼15℃로 냉각하였다. 상기 물질에 있어서, 합성된 결정성 미코페놀레이트 모페틸을 에틸 아세테이트로부터 재결정화시켰다. 결정체를 건조 후, 미코페놀레이트 모페틸 110 g을 99.0%(HPLC)보다 높은 순도로 얻었다.

Claims (32)

  1. 미생물 세포를 포함하는 배양 배지의 산소 포화도를 조절하는 단계를 포함하는, 미생물 세포가 생산하는 산 대사산물의 생성을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 액침 발효 배양 시스템에 산 대사산물 생성 미생물 세포를 제공하는 단계 및 이러한 배양으로 미생물 세포로부터 산 대사산물을 생성하는 단계를 포함하고, 이때 배양 배지의 산소 포화도를 조절하여 배양 배지의 pH를 제어하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 산 대사산물은 우론산, 파스팔산, 리세르그산의 메틸카르비놀아민, 및 미코페놀산으로 이루어진 군에서 선택하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 산 대사산물은 미코페놀산(MPA)인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 미코페놀산은 1 g/ℓ를 초과하는 최종 MPA 농도(g/배양 배지의 ℓ)로 배양 배지 중에 생성되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 농도가 5 g/ℓ를 초과하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 농도가 8 g/ℓ를 초과하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 미생물 세포는 진균 세포 및 박테리아 세포로 이루어진 군에서 선택하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 미생물 세포는 페니실리움(Penicillium) 종 세포인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 페니실리움 종 세포는 기탁 번호가 CCM 8364인 페니실리움의 단일 균주인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양 배지는 기초 질소 공급원 및 복합 질소 공급원을 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 복합 질소 공급원은 가수분해된 카세인, 옥수수 침지물 또는 이의 혼합물에서 선택하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 기초 질소 공급원은 아미노산 보충물을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 아미노산 보충물은 글리신, 메티오닌 및 아스파라긴 중 하 나 이상인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산소 포화도는 5∼40%의 범위에서 제어하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산소 포화도는 전체 생성기에 걸쳐 제어하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 배양 배지의 산소 포화도는, 접종 후 0∼24시간, 0∼48시간, 24∼48시간, 및 48시간에서 선택된 시간 동안 제어하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 산소 포화도는 생성기 종료시 탄소 공급원의 고갈로 인해 pH가 증가할 때까지 제어하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 배양 배지는 pH 4보다 높은 pH로 유지하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, pH는 산 대사산물의 생성기 동안 배양 배지의 산소 포화도를 조절하여 유지하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, pH는 생성기 동안 약 pH 4.5∼약 pH 5.5인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산 대사산물은 미코페놀산이고, 미코페놀산은 미코페놀레이트 모페틸로 전환되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 미코페놀산은 2-모르폴리노에탄올과 반응하여 미코페놀레이트 모페틸로 전환되는 방법.
  24. 체코 공화국 브르노 마사리크 대학교 소재의 체코 미생물 보존 센터(Czech Collection of Microorganisms; CCM)에 기탁 번호 CCM 8364로 기탁된 페니실리움 종의 균주.
  25. 제24항에 있어서, 임의의 표면 또는 환경 상에서 또는 그 안에서 개별 세포, 세포 응집체, 균사, 사상체 및 이의 응집체의 형태로 존재하는 페니실리움 종의 균주.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 1 g/ℓ를 초과하는 최종 농도(g/배양 배지의 ℓ)로 MPA를 생성할 수 있는 페니실리움 종의 균주.
  27. 제26항에 있어서, 농도가 5 g/ℓ를 초과하는 페니실리움 종의 균주.
  28. 제27항에 있어서, 농도가 8 g/ℓ를 초과하는 페니실리움 종의 균주.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 따른 균주를 발효시키는 단계를 포함하는 산 대사산물의 생성 방법.
  30. 제29항에 있어서, 산 대사산물은 우론산, 파스팔산, 리세르그산의 메틸카르비놀아민, 및 미코페놀산으로 이루어진 군에서 선택하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 산 대사산물은 미코페놀산(MPA)인 방법.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 따른 방법에서 제24항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 따른 균주의 용도.
KR1020087005089A 2006-06-29 2007-06-29 산 대사산물 생성의 조절 KR20080069571A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US81814506P 2006-06-29 2006-06-29
US60/818,145 2006-06-29
US84734406P 2006-09-25 2006-09-25
US60/847,344 2006-09-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080069571A true KR20080069571A (ko) 2008-07-28

Family

ID=38626338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087005089A KR20080069571A (ko) 2006-06-29 2007-06-29 산 대사산물 생성의 조절

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20080009050A1 (ko)
EP (1) EP2032712B1 (ko)
JP (1) JP2009505681A (ko)
KR (1) KR20080069571A (ko)
AT (1) ATE457358T1 (ko)
BR (1) BRPI0702901A2 (ko)
DE (1) DE602007004728D1 (ko)
DK (1) DK2032712T3 (ko)
ES (1) ES2339297T3 (ko)
PL (1) PL2032712T3 (ko)
SI (1) SI2032712T1 (ko)
WO (1) WO2008002665A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200904982A (en) * 2007-04-11 2009-02-01 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Method for reducing impurity level in mycophenolic acid fermentation
CN109929890B (zh) * 2019-05-08 2020-12-04 广东蓝宝制药有限公司 一种麦考酚酸的发酵工艺

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4115197A (en) * 1977-03-21 1978-09-19 Eli Lilly And Company Procedure for obtaining penicillium species mutants with improved ability to synthesize mycophenolic acid
DE4407441C2 (de) * 1993-03-10 1996-02-29 Forschungszentrum Juelich Gmbh Fermentationsverfahren zur kontinuierlichen Citronensäuregewinnung
US6225073B1 (en) * 1994-07-07 2001-05-01 Dade Behring Marburg Gmbh Immunoassay for mycophenolic acid
ID18663A (id) * 1996-04-12 1998-04-30 Novartis Ag Komposisi farmasi berlapis enterik
US6083728A (en) * 1997-10-17 2000-07-04 Regents Of The University Of Minnesota Production of glutamate using wild type Bacillus methanolicus
GB9812413D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Glaxo Group Ltd Compound and its use
US6107052A (en) * 1999-06-09 2000-08-22 Roche Diagnostics Corporation Enzymatic measurement of mycophenolic acid
EP1259631B1 (en) * 2000-02-29 2005-10-12 Biocon Limited Manufacture and purification of mycophenolic acid
CZ292123B6 (cs) * 2001-06-08 2003-08-13 Ivax Pharmaceuticals S.R.O. Způsob přípravy mykofenolátu mofetilu
JP4275069B2 (ja) * 2002-08-29 2009-06-10 バイオコン リミテッド 免疫抑制剤の製造方法
US6955892B2 (en) * 2002-11-12 2005-10-18 Akzo Nobel N.V. Feeding processes for fermentation
EP1667987B1 (en) * 2003-09-11 2008-07-23 Sandoz AG Process for the production of mycophenolate mofetil
EP1718644A1 (en) * 2004-02-20 2006-11-08 IVAX Pharmaceuticals s.r.o. Process for the manufacture of lysergic acid
US7683188B2 (en) * 2004-04-26 2010-03-23 TEVA Gyógyszergyár Zártkōrūen Mūkōdō Részvénytársaság Process for preparation of mycophenolic acid and ester derivatives thereof
CA2555454C (en) * 2004-04-27 2009-12-15 Sandor Molnar Mycophenolate mofetil impurity
CN101014584A (zh) * 2004-07-20 2007-08-08 特瓦药厂私人有限公司 结晶霉酚酸钠的制备方法
EP1624070A1 (en) * 2004-08-05 2006-02-08 Tecnimede-Sociedade Tecnico-Medicinal, S.A. Process for the production of mycophenolic acid
US7138504B2 (en) * 2004-08-12 2006-11-21 Microgenics Corporation Reagents and methods for mycophenolic acid immunoassay

Also Published As

Publication number Publication date
PL2032712T3 (pl) 2010-07-30
ATE457358T1 (de) 2010-02-15
US20080009050A1 (en) 2008-01-10
BRPI0702901A2 (pt) 2011-03-15
WO2008002665A1 (en) 2008-01-03
DE602007004728D1 (de) 2010-03-25
JP2009505681A (ja) 2009-02-12
EP2032712B1 (en) 2010-02-10
EP2032712A1 (en) 2009-03-11
SI2032712T1 (sl) 2010-06-30
DK2032712T3 (da) 2010-05-25
ES2339297T3 (es) 2010-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006075395A1 (ja) β−ラクタム抗生物質の活性増強剤及びその製造法
US8067212B2 (en) Bacillus pumilus strain for high yield of tetramethylpyrazine
CN110951821A (zh) 一株产辅酶q10的类球红细菌突变株及发酵产辅酶q10方法
Singh et al. Optimization of different process variables for the production of an indolizidine alkaloid, swainsonine from Metarhizium anisopliae
CN105969702B (zh) 粘质沙雷氏菌rz 21-c6及其应用
CN113637607B (zh) 一株拟无枝酸菌及其应用
JP6527521B2 (ja) 新規なストレプトマイセス・フィラメントサス変異株及びこれを用いたダプトマイシンの生産方法
KR20080069571A (ko) 산 대사산물 생성의 조절
US9365880B2 (en) Fermentation process for the production of rapamycin
CN107058173B (zh) 一株发酵生产(3r)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用
Holmalahti et al. Production of dihydroabikoviromycin by Streptomyces anulatus: production parameters and chemical characterization of genotoxicity
Ul-Haq et al. Microbiological transformation of L-tyrosine to 3, 4-dihydroxyphenyl L-alanine (L-dopa) by a mutant strain of Aspergillus oryzae UV-7
KR20080026387A (ko) 침지막 생물반응기를 이용한 고농도 유산균의 생산 방법
RU2323973C1 (ru) ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Aspergillus foetidus BKM F 3890D - ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ ПРОТЕАЗЫ И КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ПЕКТИНАЗУ (ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗУ), КСИЛАНАЗУ, β-ГЛЮКАНАЗУ, АРАБИНАЗУ, ГАЛАКТАНАЗУ, КСИЛОГЛЮКАНАЗУ, САХАРАЗУ, α-L-АРАБИНОФУРАНОЗИДАЗУ, β-ГЛЮКОЗИДАЗУ И АМИЛАЗУ
KR20140007425A (ko) 일종의 사이클릭 리포펩티드 화합물의 제조방법
Nguyen et al. Citric acid production by Aspergillus niger using media containing low concentrations of glucose or corn starch
RU2001949C1 (ru) Штамм гриба TRICHODERMA REESEI - продуцент целлюлолитических ферментов
KR101258699B1 (ko) 멜라닌 생성억제물질 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터의 대량생산방법
KR20020087004A (ko) 바실러스 서브틸리스 변이주를 이용한 자일로스로부터라이보스의 생물학적 생산 방법
Šturdiková et al. Production of 3‐methylthioacrylic acid by Streptomyces kasugaensis
CN117801972A (zh) 西弗威克汉姆酵母菌和四乙酰基植物鞘氨醇的制备方法
KR100955325B1 (ko) 신규한 브레비박테리움속 미생물 및 이를 이용한ｌ-오르니친의 제조방법
Han et al. Influence of inoculum type, inorganic salt and nitrogen to carbon ratio on sclerotium formation and carotenoid production in surface culture of Penicillium sp. PT95
CN115637278A (zh) 出芽短梗霉在发酵生产普鲁兰多糖中的应用
CN108486014A (zh) 一种提高小单孢菌生产能力的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application