ES2339297T3 - Regulacion de la produccion de metabolitos acidos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para regular la producción de un metabolito ácido producido por una célula microbiana, que comprende la regulación de la saturación del oxígeno de un medio de cultivo que comprende la célula microbiana, en el que la célula microbiana es una cepa única de Penicillium con el número de registro de CCM 8364, y el metabolito ácido es el ácido micofenólico (MPA).
Description
Regulación de la producción de metabolitos
ácidos.
La presente invención reivindica los derechos de
las siguientes solicitudes provisionales de patente US nº 60/
818.145, presentada el 29 de junio de 2006 y nº 60/847.334, presentada el 25 de septiembre de 2006.
818.145, presentada el 29 de junio de 2006 y nº 60/847.334, presentada el 25 de septiembre de 2006.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para regular la producción de ácido micofenólico
mediante Penicillium, que posee el número de registro CCM
8364, regulando el nivel de saturación de oxígeno en el medio de
cultivo, y para la cepa nuevamente aislada de Penicillium con el
número de registro CCM 8364.
El ácido micofenólico (al que se. hace
referencia como MPA) es un metabolito producido por varias especies
de Penicillium (Imperial Chemical Industries GB 1 158 387
(1967), Lilly & Co Elli GB 1 593 208 (1978)) o por cepas
mutantes obtenidas a partir de Penicillium (Ajinimoto KK/US 4
452 891 (1981). El MPA presenta actividades biológicas y
farmacológicas, por ejemplo, como antimicrobiano (Florey et
al., 1946), como agente antitumoral (Williams et al., J.
Antibiot., 21, 463 (1968), y como un agente inmunosupresor (Mitsui,
Suzuki, 1969). En terapia, se utiliza habitualmente un éster
2-morfolinoetil derivado del MPA, el micofenolato
mofetilo.
La estructura química del MPA es:
\vskip1.000000\baselineskip
Uno de lo procedimientos para producir MPA se
lleva a cabo en un cultivo de fermentación sumergido, tal como se
describe en el documento EP 1 624 070 A1; en el que NaOH se utiliza
para regular el pH del medio de fermentación, manteniéndolo entre 4
y 7.
El MPA puede aislarse a partir del medio de
fermentación mediante diversos procedimientos que incluyen los que
se dan a conocer en Imperial Chemical Industries GB 1/58 387 (1967);
BIOCON, WO 01/64931 A1 (2001); e IVAX, WO 2006/031665 (2006), WO
01/21607 y WO 2005/105768). El MPA aislado es utilizado entonces
para la producción de micofenolato mofetilo (WO 02/100855).
El documento EP 1624070 da a conocer un
procedimiento para la producción de MPA. El documenta DE 4407441 se
refiere a los procedimientos para producir ácido cítrico/citrato
utilizando levadura. WO 99/20785 se refiere a la producción de
glutamato, utilizando Bacillus methanolicus de tipo
salvaje.
Es deseable un elevado nivel de producción de
MPA para la producción eficiente y económica de medicamentos basados
en el ingrediente farmacéuticamente activo micofenolato mofetilo. La
presente invención proporciona dicho procedimiento.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un procedimiento para regular la producción de un metabolito ácido
producido por una célula microbiana, que comprende la regulación de
la saturación de oxígeno de un medio de cultivo que incluye la
célula microbiana, en el que la célula microbiana es una cepa única
de Penicillium con el número de registro CCM 8364 y al
metabolito ácido es ácido micofenólico (MPA). En una forma de
realización preferida, el procedimiento comprende proporcionar
células microbianas que dan lugar a un metabolito ácido, en un
sistema de cultivo fermentativo sumergido y que produce el
metabolito ácido a partir de las células microbianas en dicho
cultivo, en el que la saturación de oxígeno del medio de cultivo es
regulada para controlar el pH del medio de cultivo, en el que la
célula microbiana es una cepa única de Penicillium con el
número de registro CCM 8364 y el metabolito ácido es el ácido
micofenólico (MPA).
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para preparar micofenolato mofetilo que
comprende la conversión del ácido micofenólico en micofenolato
mofetilo, en el que el ácido micofenólico se prepara regulando la
saturación de oxígeno de un caldo de fermentación, que incluye una
célula microbiana que produce ácido micofenólico, en el que la
célula microbiana es una cepa única de Penicillium con el
número de registro CCM 8364.
Todavía en otro aspecto, la presente invención
proporciona además una cepa de Penicillium sp. depositado con
el número de registro CCM 8364 en la Colección Checa de
Microorganismos (CCM) en la Universidad Masaryk, Bro, República
Checa. La cepa de Penicillium sp. depositada con el número
de registro CCM 8364 produce ácido micofenólico a altas
concentraciones (en exceso de Ig MPA por litro de medio de
cultivo).
Figura 1: Una representación gráfica que muestra
la regulación del pH del medio de cultivo, regulando el nivel de
saturación del oxígeno, para obtener un pH superior a 4,5.
Figura 2: Una representación gráfica que muestra
la regulación del pH del medio de cultivo, regulando el nivel de
saturación del oxígeno, para obtener un pH inferior a 4,5.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las
expresiones "niveles altos" o "altas concentraciones"
cuando están relacionadas con el MPA, se refieren a un nivel (o
concentración) de más de 1 g aproximadamente de MPA por litro,
preferentemente de entre 6 a 10 g de MPA por 1 litro de caldo
termentador (medio de cultivo).
Varios factores son importantes para obtener
altas concentraciones de MPA en el medio productor del cultivo de
fermentación sumergido. Estos factores incluyen la composición del
medio y las condiciones de cultivo. En particular, un pH óptimo del
caldo fermentador tiene que mantenerse durante la fase de
producción. Normalmente, se utiliza la adición de NaOH para regular
el pH del caldo fermentador y mantenerlo entre un pH 4 y 7.
Asimismo, se utiliza el NaOH par producir un cambio en el pH después
de que finalice la fase logarítmica del crecimiento. La presente
invención se refiere a un nuevo procedimiento para regular la
producción de MPA, regulando el pH del caldo fermentador/medio de
cultivo, regulando el nivel de oxígeno sin añadir una substancia
química al caldo fermentador/medio de cultivo. Como tal, la presente
invención utiliza sólo una fuente natural para regular el pH del
caldo fermentador/medio de cultivo. La saturación por el oxígeno
utilizando aire, se lleva a cabo mediante aireación controlada del
proceso aeróbico, regulando por tanto el pH del proceso. De acuerdo
con esto, el presente procedimiento disminuye el consumo de ácidos
peligrosos y/o de compuestos alcalinos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para regular la producción de MPA producido por
Penicillium CCM 8364 mediante la regulación de la saturación del
oxígeno del caldo de fermentación. Más específicamente, el
procedimiento comprende el suministro de las células microbianas a
un sistema de cultivo fermentador sumergido, en el que la saturación
de oxígeno del medio de cultivo del cultivo fermentador sumergido se
regula/controla, para producir un metabolito ácido. La regulación o
el control de la saturación del oxígeno de dicho medio de cultivo
asegura que el pH del medio de cultivo se mantiene entre pH 4 y pH
7, preferentemente entre pH 4 y pH 6, más preferentemente entre pH 4
y pH 5,5. Dicha regulación proporciona un procedimiento para
producir el metabolito ácido obteniendo una alta concentración del
metabolito ácido en el caldo de fermentación (medio de cultivo).
En el procedimiento de la presente invención un
medio de cultivo apropiado comprende una fuente básica de nitrógeno
y una fuente compleja de nitrógeno. La fuente básica de nitrógeno
pueden ser, por ejemplo, moléculas inorgánicas simples, aminoácidos
u otros compuestos orgánicos que contengan nitrógeno, tales como por
ejemplo sales amoníaco/amónicas, y cualquier aminoácido que esté
presente. Una fuente preferida compleja de nitrógeno es la caseína
hidrolizada y/o extracto de maíz. El medio de cultivo contiene
también una fuente de carbono. Una fuente apropiada de carbono para
utilizar en el medio de cultivo puede ser un hidrato de carbono,
preferentemente un azúcar, más preferentemente un monosacárido, muy
preferentemente sacarosa.
Además, el medio de cultivo comprende un
suplemento aminoácido específico que se añade a la fuente compleja
de nitrógeno, o en el que la fuente básica de nitrógeno es un
aminoácido único. Preferentemente, el suplemento aminoácido incluye
un o más glicinas, metioninas y asparaginas. La metionina preferida
es la D,L-metionina. La asparagina preferida es la
L-asparagina.
El aminoácido en el suplemento aminoácido se
utiliza habitualmente a una concentración comprendida entre 1 y 30
g/l aproximadamente, preferentemente a una concentración comprendida
entre 5 y 8 g/l aproximadamente. La glicina se utiliza habitualmente
a una concentración comprendida entre 1 y 30 g/l aproximadamente,
preferentemente a una concentración comprendida entre 2 y 20 g/l
aproximadamente, más preferentemente a una concentración comprendida
entre 3 y 15 g/l aproximadamente, más preferentemente incluso a una
concentración comprendida entre 5 y 8 g/l aproximadamente.
La D.L-metionina se utiliza
habitualmente a una concentración comprendida entre 0,01 y 10 g/l
aproximadamente, más preferentemente a una concentración comprendida
entre 0,1 y 1 g/l aproximadamente.
La L-asparagina se utiliza
habitualmente a una concentración comprendida entre 1 y 30 g/l
aproximadamente, más preferentemente a una concentración comprendida
entre 2 y 20 g/l aproximadamente, todavía más preferentemente a una
concentración comprendida entre 3 y 15 g/l aproximadamente, más
preferentemente incluso a una concentración comprendida entre 5 y 8
g/l aproximadamente.
La regulación de la producción de MPA tiene
lugar cuando el Penicillium con el número de registro CCM
8364 se hace crecer en un cultivo fermentador sumergido que posee un
nivel definido de saturación del oxígeno. En dicho medio fermentador
sumergido, el nivel de saturación del oxígeno en el medio de cultivo
se controla durante, por lo menos, una parte de la fase de
producción. Alternativamente, el nivel de la saturación de oxígeno
se controla a través de la fase productiva completa. Como tal, el
nivel de saturación del oxígeno en el medio de cultivo puede
controlarse durante un período de tiempo comprendido entre 0 y 24
horas, o en el período de tiempo comprendido entre 0 y 48 horas, o
entre las 24 y las 48 horas, o a partir de las 48 horas.
Preferentemente, el nivel de saturación de oxígeno se controla hasta
que el pH aumenta debido al agotamiento de la fuente de carbono al
final de la fase de
producción.
producción.
La producción de MPA en la fermentación
sumergida puede aumentarse controlando el nivel de la saturación de
oxígeno en el medio de cultivo. Preferentemente, el nivel de la
saturación de oxígeno es del orden de 5 a 40%, más preferentemente
el nivel de saturación de oxígeno es del orden de 5 a 35%, más
preferentemente incluso, el nivel de saturación del oxígeno es del
orden de 5 al 30%. El porcentaje de saturación de oxígeno se refiere
a la pO_{2} medida mediante el electrodo pO_{2}, por lo cual el
100% de saturación del oxígeno se correlaciona con la aireación
máxima del medio de cultivo sin el cultivo celular microbiano.
En una forma de realización preferida, el
Penicillium con el número de registro CCM 8364 se hace
crecer, en las etapas de inoculación y producción del cultivo, en un
medio de cultivo distinto. La primera etapa (estadio de inoculación)
empieza a las T-0 horas, pudiendo empezar una
segunda etapa a las T-24 horas, y la tercera etapa
(estadio de producción) puede empezar a las T-48
horas.
Preferentemente, el procedimiento comprende
además el crecimiento de las células microbianas en un medio de
inoculación, e inoculando el medio de producción con un inoculo por
lo menos del 20%, preferentemente por lo menos del 25% del volumen
del medio de producción.
En el procedimiento de la presente invención, el
pH del medio de cultivo se mantiene a un pH superior al pH 4,
preferentemente entre el pH 4 y pH 7. Preferentemente, se mantiene
regulando el nivel de la saturación de oxígeno en el medio de
cultivo. El nivel de saturación del oxígeno en el medio de cultivo
se regula mediante control continuo del nivel de oxígeno, utilizando
un electrodo pO_{2} y ajustando el nivel de oxígeno cuando sea
necesario, ajustando la velocidad de agitación y añadiendo volumen
de aire. Como tal, el pH del medio de cultivo puede mantenerse a un
pH superior a 4 durante el estadio productivo del cultivo, que es el
período en el que el metabolito ácido se produce activamente en el
sistema del medio de fermentación. Este período puede empezar
después de una inoculación con las células microbianas se ha
transferido al sistema del cultivo de fermentación. Preferentemente,
el pH es superior a pH 4,5 durante la etapa de producción del
cultivo, y más preferentemente, el pH está entre 4,5 y 5,5
aproximadamente durante la etapa de producción del cultivo.
La temperatura del cultivo sumergido que se
regula de esta forma se mantiene entre 20 y 30ºC aproximadamente
durante un tiempo suficiente para producir el MPA. Preferentemente,
la temperatura del cultivo sumergido en el procedimiento de la
presente invención se mantiene entre 24ºC y 26ºC aproximadamente
durante un período de tiempo de entre 240 a 300 horas
aproximadamente.
La regulación de la producción de MPA según el
procedimiento de la presente invención, para regular el nivel de
saturación de oxígeno en el medio de cultivo, produce una
concentración final de MPA (g/l de medio de cultivo) que excede en 1
g/l), más preferentemente excede en 2 g/l o excede en 3 g/l,
excediendo todavía más preferentemente en 4 /l, excediendo más
preferentemente, incluso, en 5 g/l, en 6 g/l, o en 8 g/l.
La presente invención proporciona asimismo una
nueva cepa de Penicillium sp. (que está depositada como CCM
8364)que produce niveles altos de MPA, tales como, por
ejemplo, 1 g/l en exceso. Esta cepa produce niveles más altos de MPA
cuando se compara con una cepa Penicillium sp. de tipo
salvaje, a partir de la cual se obtuvo la CCM 8634. Dicha cepa
salvaje de Penicillium sp. produce MPA con un rendimiento
promedio de 600 mg/l aproximadamente cuando se hace crecer en un
medio sumergido.
Asimismo, se proporciona un cultivo de dicha
cepa, preferentemente un cultivo biológicamente puro, tal como que
comprenda sólo células en crecimiento de la cepa fúngica depositada
con el nº CCM8364. Dicho cultivo posee preferentemente, por lo
menos, aproximadamente el 90% de dicha cepa fúngica. La cepa en
cultivo puede estar en forma de células individuales, agregados
celulares, hifas, filamentos, y sus agregados en o sobre cualquier
superficie o entorno.
La cepa de Penicillium sp con el número
de registro CCM8364 puede producir una concentración final de MPA
(g/l de medio de cultivo) que excede en 1 g/l, más preferentemente
excede en 2 g/l o excede en 3 g/l, excediendo todavía más
preferentemente en 4 g/l, excediendo más preferentemente, incluso,
en 5 g/l, en 6 g/l, o en 8 g/l.
La cepa Penicillium sp, CCM8364, se
produce utilizando un sistema de procedimientos de mutación química
y física, combinados con medios de selección positiva.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para preparar micofenolato mofetilo. El ácido
micofenólico puede convertirse a micofenolato mofetilo, por ejemplo,
según el procedimiento que se da a conocer en el documento WO
02/100855.
Los siguientes ejemplos tienen el propósito de
ilustrar además ciertas formas de realización preferidas de la
invención, que no son limitativas.
Durante el crecimiento saprofítico en medio de
malta engrosado con agar -MEA- (35 g de extracto de malta, 5 g de
peptona, 13 g de agar, 1000 ml H_{2}O), la cepa CCM 8364 forma
colonias de micelio estácelo ligero con un diámetro de 1,1 cm
después de 7 días de cultivo. La textura superficial está cubierta
con pelos cortos, densos y blandos, centralmente umbonada y tiene
márgenes blancos. El nivel de conidiogénesis es moderado, las
colonias están coloreadas con un color próximo al castaño, y
presentan un exudado de color ante, ante en el reverso.
Durante el crecimiento saprofítico en medio de
levadura Czapek engrosado con agar, la cepa CCM 8364 forma colonias
de micelio esfácelo ligero, con un diámetro de 2,3 cm después de 7
días de cultivo. La textura superficial está cubierta con pelos
cortos, densos y blandos, está sulcada radialmente y está umbonada
centralmente con márgenes blancos. El nivel de conidiogénesis es
moderado, las colonias están coloreadas con un color similar al
castaño y presentan un exudado, rojo castaño, canela en el
reverso.
Durante el crecimiento saprofítico en medio de
producción G25N, engrosado con agar, la cepa CCM 8364 forma colonias
de micelio esfácelo ligero con un diámetro de 0,3 cm después de 7
días de cultivo. La textura superficial está cubierta con pelos
cortos, densos y blandos. El nivel de conidiogénesis es de ligero a
moderado, las colonias son centralmente planas o elevadas con
márgenes blancos, están coloreadas gris ahumado-gris
glauco con tono verdoso, no presentan exudado, y son pálidas en el
reverso.
\vskip1.000000\baselineskip
El micelio está formado por hifas de
300-600 x 4-6 \mum, siendo la
superficie lisa, los penicilios variables, terveticilados e
irregulares, con más puntos de ramificación que se encuentran en un
patrón no uniforme, ramas en verticilos de 2-3,
metulae en verticilos, 12-20 x 4-4,5
\mum, fialides aceroso-ampuliformes, que miden
13-16 x 2,5-3 \mum, conidios en
cadenas cortas, esferoidales de 3,5-5,5 \mum y
elipsoidales de 4-6 x 2-4 \mum
con disyuntores, paredes rugosas de formas distintas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada aislamiento se evaluó con respecto a su
producción de MPA. Este ensayo consiste en dos
etapas-inoculación y producción. El medio de
inoculación (IM) contiene fuentes de carbono (por ejemplo,
sacarosa), fuentes de nitrógeno (las fuentes apropiadas incluyen
caseína hidrolizada y extracto de maíz) y sales inorgánicas (tales
como KH_{2}PO_{4}). Se esterilizaron 50 ml de IM a 120ºC durante
20 minutos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Las esporas del
aislamiento se lavaron en un cultivo sesgado de agar con 20 ml de
agua estéril. 5 ml de esta suspensión de esporas se utilizó como el
inoculo para IM y se cultivaron entonces durante 3-5
días a 24-28ºC con una tasa de agitación de 280
revoluciones/minuto mientras se lleva cabo ésta. El IM resultante se
utilizó para la inoculación del medio productor (PM) añadiendo el
10% del volumen total.
El PM que se utiliza en la presente invención
para el ensayo del PMA, contiene fuentes de carbono (por ejemplo,
sacarosa), fuentes de nitrógeno (las fuentes apropiadas incluyen
caseína y aminoácidos como glicina, asparagina, metionina) y sales
inorgánicas (por ejemplo, KH_{3}PO_{4}, MgSO_{4}). 50 ml del
PM se esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos en un matraz
Erlenmeyer de 250 ml. A continuación, se llevó a cabo un cultivo de
prueba bajo condiciones aeróbicas a 24-28ºC con
agitación durante 10 a 14 días. La tasa de agitación fue de 280
revoluciones/minuto. El pH del medio se midió antes de la
inoculación (pH 4,9 a 5,1) y dos o tres veces antes del final del
experimento utilizando un peachímetro tal como se ha descrito
anteriormente. El nivel de saturación de oxígeno se midió
continuamente en termentadores de laboratorio o de instalaciones
industriales.*Los alícuotas que contenían MPA se ensayaron
utilizando cromatografía HPLC según los procedimientos estándar
conocidos por los expertos en la técnica, para determinar su
contenido en MPA con respecto a un estándar (estándar MPA interno
IVAX según el informe de Investigación
RR/RD/CH024/01-A, reensayo
RR/RD/AN061/05-A). La columna que se utilizó fue una
Chromolith, velocidad ROD, RP18e, 50x4.6 mm, (fabricada por MERCK),
fase móvil: acetonitrilo al 40%, agua al 60% conteniendo 680 \mul
H_{3}PO_{4}/litro de agua, flujo de 5-6,5 ml/min
y temperatura de 30ºC.
En el primer estadio del procedimiento, el
cultivo sesgado esporulado del Penicillium sp. de tipo
salvaje se suspendió en agua y fue desprovisto de los fragmentos
micélicos. La suspensión se diluyó entonces hasta 100 esporas/ml y
se extendió sobre placas Petri que contenían MEA. Las placas se
incubaron a 24-27ºC durante siete días. Las colonias
que crecieron en la placa de agar se pincharon y mantuvieron en
cultivos sesgados del mismo medio nutritivo agar en un matraz
Blacke. Después de 16 días de cultivo, se ensayaron aislados
monocolonias en la prueba de producción. El aislado con la mejor
producción (1,2 g MPA/I en caldo de fermentación) se sometió a
mutación en la próxima etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cultivo sesgado esporulado se suspendió en
agua y fue desprovisto de fragmentos micélicos. Las poblaciones
conidiásicas se expusieron entonces a una solución de 0,2 M NG en
solución salina durante 8 horas. En este tratamiento mutacional, se
eliminó el 99,9% aproximadamente de las esporas. Las esporas
tratadas se lavaron entonces libres de mutágenos y se extendieron
sobre placas de Petri que contenían MEA. Las placas se incubaron a
24-27ºC durante siete días. Las colonias que
crecieron en la placa de agar se pincharon y se mantuvieron en
cultivos sesgados del mismo medio nutriente de agar en un matraz
Blacke. Tras 16 días de cultivo, se ensayaron aislados
monocoloniales en la prueba de producción. El aislado con la mejor
producción (2,4 g MPA/I en caldo de fermentación) se sometió a
mutación en la próxima etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cultivo sesgado esporulado se suspendió en
agua y fue desprovisto de fragmentos micélicos. Las poblaciones
conidiásicas se expusieron a una solución de 0,2 M EMS en solución
salina durante 16 horas. En este tratamiento mutacional, se eliminó
el 99,9% aproximadamente de las esporas. Las esporas tratadas se
lavaron entonces libres de mutágenos y se inocularon en placas de
Petri que contenían MEA. Las placas se incubaron a
24-27ºC durante siete días, hasta que las colonias
se formaron sobre las placas. Las colonias se pincharon y se
mantuvieron en cultivos sesgados del mismo medio nutriente de agar
en un matraz Blacke. Tras 16 días de cultivo, se ensayaron aislados
monocoloniales en la prueba de producción. El aislado con la mejor
producción (5,6 g MPA/I en caldo de fermentación) se sometió a
mutación en la próxima etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cultivo sesgado esporulado se suspendió en
agua y fue desprovisto de fragmentos micélicos. La suspensión se
diluyó hasta 1 x 10^{5} esporas/ml y se extendió sobre placas de
Petri que contenían MEA. Las placas se expusieron a irradiación UV,
siendo la dosis irradiada de 15 Jm^{-2}s^{-1} durante
aproximadamente 500 segundos. En este tratamiento mutacional, se
eliminó el 99,9% aproximadamente de las esporas. Las placas de Petri
se incubaron a 24-27ºC durante siete días. Las
colonias que crecieron sobre las placas de agar se pincharon y se
mantuvieron en cultivos sesgados del mismo medio nutriente de agar
en un matraz Blacke. Tras 16 días de cultivo, se ensayaron aislados
monocoloniales en la prueba de producción. El aislado con la mejor
producción (6,0 g MPA/I en caldo de fermentación) se sometió a
mutación en la próxima etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
Un cultivo sesgado esporulado se suspendió en
agua y fue desprovisto de fragmentos micélicos. La suspensión se
diluyó hasta 1 x 10^{5} esporas/ml y se expuso a la radiación
Gamma, siendo la dosis de ésta de 1500 Gy, extendiéndose los
aislamientos irradiados sobre placas de Petri que contenían MEA. Las
placas de Petri se incubaron entonces a 24-27ºC
durante siete días, hasta que las colonias se formaron sobre las
placas. Las colonias se pincharon y se mantuvieron en cultivos
sesgados del mismo medio nutriente de agar en un matraz Blacke.
Después de 16 días de cultivo, se ensayaron aislados monocoloniales
en la prueba de producción. El aislado con la mejor producción (10,0
g MPA/I en caldo de fermentación) se sometió a dos pases sobre el
medio de agar en un matraz Blacke. Después de cada pase, se llevó a
cabo el ensayo de producción para comprobar que continuaba la alta
producción de MPA.
Esta nueva cepa producida fue depositada bajo el
Tratado de Budapest con el número de registro CCM 8364 en la
Colección Checa de Microorganismos (CCM) en la Universidad Masaryk,
Tvrdého, Bmo, República Checa.
El sistema de procedimientos mutantes, cuando se
combina con los procedimientos se selección positiva, da lugar a un
aumento en el contenido promedio de MPA a partir de 600 mg de MPA/I
del caldo de fermentación para la cepa parental, a 10 g de MPA/I
del caldo de fermentación para la cepa CCM 8364, según el ensayo
MPA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa CCM 8364 para la fermentación
en un termentador sumergido, con un volumen total de alrededor de 14
metros cúbicos. El medio productor contenía sacarosa como fuente de
carbono y caseína hidrolizada, glicina, asparagina y metionina como
fuentes de nitrógeno, y minerales incluyendo K, P y Mg con un pH
inicial de 5,0. El medio de producción se inoculó mediante un
inoculo en la tercera etapa (aproximadamente 26% peso/peso). La
temperatura del cultivo fue de 24-26ºC y el
procesamiento de la producción de fermentación fue de 285 horas. El
pH del medio de cultivo se controló saturándolo con oxígeno hasta un
nivel superior al 30%. Los valores del oxígeno disuelto, del pH
durante el cultivo y de la concentración de MPA al final de la etapa
de producción, se sumarizan en la tabla siguiente. Debido a la
saturación del oxígeno del medio de producción el pH disminuyó por
debajo de 4 y el nivel final de producción de MPA alcanzó 5,7g de
MPA/I.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa CCM 8364 para la fermentación
en un fermentador sumergido, con un volumen total de alrededor de 14
metros cúbicos. El medio productor contenía sacarosa como fuente de
carbono y caseína hidrolizada, glicina, asparagina y metionina como
fuentes de nitrógeno, y minerales incluyendo K, P y Mg con un pH
inicial de 5,0. La cepa productora Penicillium sp. (CCM
8364) se utilizó para la fermentación. El medio de producción se
inoculó mediante un inoculo en la tercera etapa (aproximadamente 26%
peso/peso). La temperatura del cultivo fue de
24-26ºC y el procesamiento de la producción de
fermentación fue de 278 horas. El pH del medio de cultivo se
controló saturándolo con oxígeno. Los valores del oxígeno disuelto,
del pH del medio de cultivo durante éste y de la concentración de
MPA al final de la etapa de producción, se dan en la tabla
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó la cepa CCM 8364 para la fermentación
en un fermentador sumergido, con un volumen total de alrededor de 14
metros cúbicos. El medio productor contenía sacarosa como fuente de
carbono y caseína hidrolizada, glicina, asparagina y metionina como
fuentes de nitrógeno, y minerales incluyendo K, P y Mg con un pH
inicial de 5,0. El medio de producción se inoculó mediante un
inoculo en la tercera etapa (aproximadamente 26% peso/peso). La
temperatura del cultivo fue de 24-26ºC. El caldo de
fermentación se alimentó mediante un medio con una fuente de carbono
(1 x 10% peso/peso) 143 horas y la fermentación productiva finalizó
a las 257 horas. El pH del medio de cultivo se controló saturándolo
con oxígeno. Los valores para el oxígeno disuelto, el pH del cultivo
durante éste y de la concentración de MPA al final de la etapa de
producción, se sumarizan en la tabla siguiente.
Se dispusieron 100 g de ácido micofenólico en
bruto, preparado según el ejemplo 5 en un matraz de reacción con un
reflujo enfriado, junto con 200 ml de éter dibutilo. Bajo agitación
continua, la mezcla se calentó hasta una temperatura de 50 a 60ºC, y
entonces se añadieron 40 ml de 2-morfolinoetanol. La
mezcla reactiva se calentó hasta hervir bajo separación azeotrópica
del agua. Después de 48 horas la mezcla se enfrió hasta 23ºC y se
añadieron 200 ml de diclorometano. La solución se extrajo dos veces
con 100 ml de 0,5 M de K_{2}CO_{3} y una vez con 100 ml de agua.
A continuación, se destiló el diclorometano al vacío y la suspensión
se enfrió hasta entre 10 y 15ºC. De esta forma, el micofenolato
mofetilo cristalino sintetizado se recristalizó a partir del acetato
de etilo. Después de secar los cristales se obtuvieron 110 g de
micofenolato mofetilo, con una pureza de más del 99,0% (HPLC).
Claims (21)
-
\global\parskip0.870000\baselineskip
1. Procedimiento para regular la producción de un metabolito ácido producido por una célula microbiana, que comprende la regulación de la saturación del oxígeno de un medio de cultivo que comprende la célula microbiana, en el que la célula microbiana es una cepa única de Penicillium con el número de registro de CCM 8364, y el metabolito ácido es el ácido micofenólico (MPA). - 2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende proporcionar células microbianas que producen el metabolito en un sistema de cultivo sumergido de fermentación y que produce el metabolito ácido a partir de las células microbianas en dicho cultivo, en el que la saturación de oxígeno del medio de cultivo se regula para controlar el pH del medio de cultivo.
- 3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el ácido micofenólico se produce en el medio de cultivo a una concentración final de MPA (g/l de medio de cultivo) que excede en 1 g/l.
- 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de cultivo comprende una fuente básica de nitrógeno y una fuente compleja de nitrógeno.
- 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la fuente compleja de nitrógeno se selecciona de entre caseína hidrolizada, extracto de maíz o sus mezclas.
- 6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que la fuente básica de nitrógeno comprende un suplemento aminoácido.
- 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el suplemento aminoácido es una o varias glicinas, metioninas y asparaginas.
- 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de saturación del oxígeno es controlado en el intervalo comprendido entre 5 y 40%.
- 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de saturación del oxígeno es controlado durante toda la fase completa de producción.
- 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el nivel de saturación de oxígeno en el medio de cultivo es controlado durante un período de tiempo que se selecciona de entre el periodo de tiempo comprendido entre 0 y 24 horas, el periodo de tiempo comprendido entre 0 y 48 horas, entre 24 y 48 horas, y a partir de las 48 horas desde la inoculación.
- 11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, en el que el nivel de saturación de oxígeno es controlado hasta que el pH aumenta debido al agotamiento de la fuente de carbono al final de la fase de producción.
- 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio de cultivo se mantiene a un pH superior al pH 4.
- 13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el pH se mantiene regulando el nivel de saturación de oxígeno en el medio de cultivo durante una etapa de producción para el metabolito ácido.
- 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el pH está comprendido entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5 durante la etapa de producción.
- 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido micofenólico se convierte en micofenolato mofetilo.
- 16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el ácido micofenólico se convierte en micofenolato mofetilo mediante reacción con el 2-morfolinoetanol.
- 17. Cepa de Penicillium depositada con el número de registro CCM 8364 en la Colección Checa de Microorganismos (CCM) en la Universidad Masaryk, Brno, República Checa.
- 18. Cepa según la reivindicación 17, en forma de células individuales, agregados celulares, hifas, filamentos y sus agregados en o sobre cualquier superficie o entorno.
- 19. Cepa de Penicillium sp según la reivindicación 17 ó 18, en la que la cepa puede producir una concentración final de MPA (g/l de medio de cultivo) que excede en 1 g/l.
- 20. Procedimiento para producir un metabolito ácido que comprende la fermentación de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que el metabolito ácido es el ácido micofenólico (MPA).
- 21. Utilización de una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 en un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
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