KR20100089212A - 모노옥시게네이즈 유전자를 내포시킨 재조합 대장균을 이용한 고농도 인디루빈의 생물학적 제조방법 - Google Patents

모노옥시게네이즈 유전자를 내포시킨 재조합 대장균을 이용한 고농도 인디루빈의 생물학적 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT의(기탁번호 : KCTC 12909)에서 분리된 서열번호 1의 염기서열을 지니는 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 유전자를 내포하고 있는 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 이용하여 고농도의 인디루빈을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상기 서열번호 1의 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 유전자를 분리 증폭시킨후 벡터에 삽입하고 대장균에 삽입 형질전환시킨 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 트립토판에 아미노산을 첨가시킨 최적배지에서 배양하여 트립토판에서 유래된 인돌을 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 활성을 이용하여 2-인독실과 3-인독실로 전환시킨 후, 산화적 이량화 과정에서 인디루빈의 선택적 전환율을 증가시켜 고농도로 인디루빈을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
인디고, 인디루빈, 옥시게네이즈, 효소, 재조합, 대장균, 트립토판

Description

모노옥시게네이즈 유전자를 내포시킨 재조합 대장균을 이용한 고농도 인디루빈의 생물학적 제조방법{Biological methods for producing high concentrated indirubin by the recombinant E. coli cells harboring a monooxygenase}
본 발명은 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT의(기탁번호 : KCTC 12909)에서 분리된 서열번호 1의 염기서열을 지니는 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 유전자를 내포하고 있는 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 이용하여 고농도의 인디루빈을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 상기 서열번호 1의 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 유전자를 분리 증폭시킨후 벡터에 삽입하고 대장균에 삽입 형질전환시킨 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 트립토판에 아미노산을 첨가시킨 최적배지에서 배양하여 트립토판에서 유래된 인돌을 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 활성을 이용하여 2-인독실과 3-인독실로 전환시킨 후, 산화적 이량화 과정에서 인디루빈의 선택적 전환율을 증가시켜 고농도로 인디루빈을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
인디루빈(indirubin)은 인디고(indigo)의 이성질체로 주로 자연산 식물 및 인공 조직 배양한 식물 세포에서 생산된다. 중국 전통 한방에서 만성 백혈병 치료제로 당귀(Danggui Longhui Wan)를 주로 사용하여 왔는데 최근 이 당귀의 주성분이 인디루빈으로 분석되었고, 이들이 cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor로서 작용한다는 사실이 밝혀지면서 만성백혈병 치료제로 사용될 수 있는 가능성이 제시되었다 (Nature Cell Biology, 1:60-67, 1999). 미생물에 의한 인디루빈의 생산은 옥시게네이즈 유전자의 활성을 이용한 인디고 생산 과정에서 자발적으로 소량의 인디루빈이 생산된다.
미생물에 의한 인디고의 생산은 1928년 Gray에 의해 보고되었다. 그 후 많은 발명자들에 의해 미생물에서 인디고가 생산된다는 것이 보고되었다(Yen et al. 1991, Eaton and Champman 1995, O′Connor et al. 1997, O′Connor and Hartmans 1998, Doukyu et al. 1998, 2002). 인디고 생산에 관련된 효소는 일반적으로 하나 또는 그 이상으로 구성되어있다. 대체로 이와 관련된 효소는 모노옥시게네이즈(monooxygenase)와 다이옥시게네이즈(dioxygenase) 등이 있으며, 각각의 효소가 포함된 유전자를 대장균(Escherichia coli) 에 도입하여 글루코스 또는 영양 배지(nutrient medium)에서 인디고를 생산하였다(Ensley et al. 1983, Hart et al. 1992, Murdock et al. 1993, Kim et al. 1997, Bhushan et al. 2000, Drewlo et al. 2001).
미생물 및 동물유래의 모노옥시게네이즈 및 다이옥시게네이즈 유전자를 대장균 및 슈도모나스(Pseudomonas)에서 발현시켜 인디고 생성 실험을 하였지만, 이들 실험 중 가장 많은 인디고를 생성하는 것은 나프탈렌 다이옥시게네이즈(dinaphthalene dioxygenase)(9개 유전자)을 이용하는 것으로, 포도당으로부터 인디고가 135mg/l의 농도로 전환되었다.
현재까지 많은 연구자들이 인디고의 생산 과정을 억제하고 인디루빈의 생산 수율을 증가시키기 위해 유전자 재조합, 유전자 돌연변이 유도 기술 등을 이용하고 있으나 소폭의 생산량 증가 외에는 현재까지 대량 생산에 성공하지 못하고 있다.
인디고의 생성은 대장균 숙주세포가 원래 갖고 있는 트립토파나제(tryptophanase)에 의하여 배지내의 트립토판이 인돌(indole)로 전환된다. 트립토판은 인디고로 전환하는데 있어 매우 이상적이다. 이것은 트립토판이 이미 인디고 분자의 중심에 있는 고리 구조를 가지고 있기 때문이다. 약간의 화학적 변화를 주면 트립토판은 인돌로 전환된다. 이렇게 전환된 인돌은 클로닝된 DNA에 의해 발현된 FMO에 의하여 인돌옥사이드(indole oxide)로 전환된다. 이후 인돌옥사이드는 자연적인 반응에 의해 인독실(indoxyl)이 생성되며, 인디고 생성은 최종적으로 산화적 이량화(dimerizaton)를 거쳐 생성된다.
Figure 112009006614369-PAT00002
이와 같은 인디고 및 인디루빈의 생물학적 제조방법은 본 발명자들에 의해 대한민국 특허등록 제494,764호 '신규한 옥시게네이즈 유전자를 내포시킨 재조합 대장균을 이용한 인디고 및 인디루빈의 생물학적 제조방법'으로 개시한 바 있다.
그러나 본 발명자들이 상기 특허문헌에서 개시한 방법에 따르면 항암활성 물질로 인식되고 있는 인디루빈 만을 선택적으로 제조하기 어려운 문제점이 있어 새로운 옥시게네이즈 유전자를 선별하여 인디루빈의 선택성을 증진시킨 생물학적 제조방법을 연구하던 중 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT 유래의(기탁번호 : KCTC 12909) 옥시게네이즈(oxygenase)를 함유한 형질전환 대장균을 이용하여 시스테인, 아스파르트산 및 아르기닌을 소량 첨가시킨 트립토판 배지에서 발효시킬 때 높은 수율로 인디루빈을 생성함을 발견하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 새로운 옥시게네이즈 유전자를 선별하여 인디루빈의 선택성을 증진시킨 생물학적 제조방법을 개발코자 한 것으로, 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT 유래의(기탁번호 : KCTC 12909) 옥시게네이즈(oxygenase)를 함유한 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 이용하여 시스테인, 아스파르트산 및 아르기닌을 소량 첨가시킨 트립토판 배지에서 발효시켜 높은 전환율 및 선택성으로 인디루빈을 제조하는 방법을 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT의(기탁번호 : KCTC 12909)에서 분리된 서열번호 1의 DNA 염기서열을 지니는 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 유전자를 내포하고 있는 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 0.15∼0.25%의 트립토판, 0.8∼1.2% NaCl 및 0.3∼0.7% 효모 추출물이 함유된 수성 액상배지에서 배양하여 인디루빈을 발효 생성함에 있어서, 상기 액상배지에 시스테인 0.04∼0.06%, 아르기닌 0.004∼0.006%, 아스파르트산 0.004∼0.006%를 추가로 첨가함으로써 인디루빈의 전환율 및 생성량을 증진시키는 인디루빈 발효 생성방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 0.15∼0.25%의 트립토판, 0.8∼1.2% NaCl 및 0.3∼0.7% 효모 추출물이 함유된 수성 액상배지에서 배양하여 인디루빈을 발효 생성함에 있어서, 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 상기 수성 액상배지에 통기량 3 vvm으로 산소를 16∼20시간 주입하면서 배양한 후 산소 공급을 차단하고 통기량 3 vvm으로 20분간 질소를 주입한 후 3일간 방치하여 배양조 내의 용존산소량을 감소시킴으로써 인디루빈의 전환율을 증진시키는 인디루빈 발효 생성방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 효과는 새로운 옥시게네이즈 유전자를 선별하여 인디루빈의 선택성을 증진시킨 생물학적 제조방법을 제공하는 것으로, 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT 유래의(기탁번호 : KCTC 12909) 옥시게네이즈(oxygenase)를 함유한 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 이용하여 시스테인, 아스파르트산 및 아르기닌을 소량 첨가시킨 트립토판 배지에서 발 효시켜 높은 전환율 및 선택성으로 인디루빈을 제조 방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
인디루빈 생산은 대장균 숙주세포가 원래 가지고 있는 트립토파나제에 의하여 배지내의 트립토판이 인돌로 전환된다. 전환된 인돌은 메틸로파가 아미니설피디보란스 (M. aminisulfidivorans) MPT의 플라빈-함유 모노옥시게네이즈의 활성에 의해 2-인독실과 3-인독실로 전환된다. 이후 이들은 산화적 이량화를 거쳐 인디고와 인디루빈으로 생성된다.
본 발명에서는 서열번호 1의 플라빈-함유 모노옥시게네이즈 유전자(NCBI GenBank 등록번호 AF494423)를 내포하고 있는 재조합 대장균을 이용하고, 배지에 첨가하는 아미노산 및 그 조성의 최적화와 용존 산소량 조절을 통하여 인디루빈의 생산량을 증가시킨 것이다.
본 발명은 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT의(기탁번호 : KCTC 12909) 옥시게네이즈(oxygenase) 유전 자를 내포하고 있는 재조합 대장균을 이용하여 고수율의 인디루빈을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명자들은 상기 재조합 대장균을 생명공학연구원 미생물 기탁센터에 2008년 월 일 자로 KCTC 11438BP호로 부다페스트 조약에 의한 국제기탁을 실시하였다.
즉, 메틸로파가 아미니설피디보란스 MPT의 플라빈-함유 모노옥시게네이즈 (flavin-containing monooxygenase)의 오픈리딩프레임 (NCBI GenBank 등록번호 AF494423)를 포함하는 1686bp의 유전자(서열번호 1)를 클로닝하여 대장균에서 발현하고, 동시에 대장균이 본래 가지고 있는 트립토파나제 활성에 의해 트립토판으로부터 전환된 2-인독실과 3-인독실의 산화적 이량화 과정을 거쳐 인디고 및 인디루빈이 생산된다.
이 때 시스테인 등의 몇 가지 아미노산의 첨가를 통한 배지의 조성을 다양화 함으로써, 즉 시스테인, 아스파르트산, 아르기닌 등의 아미노산을 트립토판 배지에 첨가함으로써 이러한 배지 조성의 변화가 인디고 및 인디루빈의 생산성 향상을 야기하는 지를 측정하였다.
이에 따라 상기 배지내에 시스테인 0.05% (w/v), 아스파르트산 0.005%, 아르기닌 0.005%를 트립토판 배지에 각각 첨가한 경우 93∼97 mg/L 인디루빈과 3∼7 mg/L 인디고가 생산되었다.
또한 발효조 내의 용존산소량 조절이 인디루빈 생산량 증가에 미치는 영향을 확인하였다. 초기 트립토판 배지 (tryptophan 2g/L, yeast extract 5g/L, sodium chloride 10g/L)에서 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)에 의해 3∼7 mg/L의 인디루빈과 670∼690 mg/L의 인디고가 생산된다.
즉 트립토판 배지에서 재조합 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 18시간 배양 후 산소공급을 차단하고 3일간 방치하였을 경우 인디루빈과 인디고의 생성 중량비는 31∼35:65∼69 이었으나, 트립토판 배지에서 18시간 배양 후 산소공급을 차단하고 20분간 질소를 주입한 후 3일간 방치하여 용존산소량을 감소시켰을 경우 인디루빈과 인디고의 생성 중량비는 41∼45:55∼59을 나타내었다. 그러나 이 경우 총 인디고이드 생산량은 감소하였다.
트립토판 배지에서 18시간 배양 후 산소를 차단한 경우에서 인디루빈과 인디고가 각각 최대 210mg/L와 432mg/L가 생성되었다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)의 제조
전체적인 재조합 DNA 기술은 Sambrook et al.(1989) 방법을 이용하여 실험하였다. 시약 및 제한효소의 사용 등은 제조회사에서 추천하는 방법에 따라 수행하였다.
메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT의(기탁번호 : KCTC 12909) 옥시게네이즈 DNA 분리방법은 Goldberg와 Ohman (1984) 방법을 이용하여 준비하였다.
M. aminisulfidivorans MPT 로부터 서열번호 1의 염기서열을 지니는 플라빈-함유 모노옥시게네이즈 유전자를 분리 증폭한 후 pBluescript SK 벡터에 서브클로닝 하였고, 이를 pBlue 1.7이라 명명하였다. 이 재조합 플라스미드 pBlue1.7을 E. coli DH5α에 형질 전환시킨 후 형질전환 대장균주를 트립토판 배지(트립토판 2g/L, 효모 추출물 5g/L, 염화나트륨 10g/L)를 사용하여 30℃에서 18시간 동안 배양하였다.
상기 형질전환 대장균 균주는 생명공학연구원 미생물 기탁센터에 2008년 월 일 자로 KCTC 11438BP호로 부다페스트 조약에 의한 국제기탁하였다.
(실시예 2) 발효 배지의 조성 조절에 따른 인디루빈의 생성량 측정
5∼15mM 트립토판, 0.5∼1.5% NaCl 및 0.2∼0.8% 효모 추출물을 함유한 트립토판 배지에 시스테인, 아르기닌, 아스파르트산을 각각 0.05%(w/v)를 첨가하고 재조합 플라스미드 pBlue 1.7을 포함하고 있는 재조합 대장균을 배양한 결과 도 1A와 같이 첨가된 아미노산에 따라 생성물의 색이 변화되는 것을 확인하였으며, 또한 도 1B와 같이 각각의 생성물의 흡수스펙트럼을 분석한 결과 시스테인을 포함한 아미노산을 첨가하였을 경우에 540nm (붉은색) 에서 최대 흡수파장을 나타내었다.
반응표면모델 (RSM) 분석을 통해 모델식을 이용하여 시스테인, 아르기닌, 아스파르트산의 최적 농도를 예측한 결과 시스테인 0.055%, 아르기닌 0.045%, 아스파르트산 0.055%로 분석되었으며, 이때 인디루빈 90.34 mg/L가 생산되는 것으로 나타났다.
또한 인디루빈의 생산에 가장 큰 영향을 미치는 아미노산은 시스테인으로 나타났으며, 아르기닌 및 아스파르트산은 유의성이 낮은 것으로 분석되었다. 분석된 결과를 응용하여 시스테인 0.05%, 아르기닌 0.005%, 아스파르트산 0.005%가 첨가된 배지를 이용하여 인디루빈 생산을 수행한 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 인디루빈 95mg/L 와 인디고 5mg/L가 생산되는 것을 확인하였다.
(실시예 3) 발효 배지의 용존산소량 조절에 따른 인디루빈의 생성량 측정
용존산소량 조절에 따른 인디루빈 및 인디고의 생산비를 알아보기 위하여 다음의 조건으로 실험을 수행하였다. 5L 배양기를 이용하여 각각 pH 7.0, 30℃, 180rpm을 유지하도록 조절한 후 pBlue 1.7이 포함된 재조합 대장균을 배양하였다. 고농도 인디루빈을 생산하기 위해 아래와 같이 두 가지 조건에서 실험을 수행하였다. 첫 번째 조건은 배양 완료시점인 18시간까지 산소 통기량을 3vvm의 유량으로 공급한 후 산소공급을 차단하고 3일간 방치한 것(조건 1)이고, 두 번째 조건은 위와 동일한 조건에서 배양한 후 산소공급을 차단하고 질소 통기량을 3vvm의 유량으로 20분간 공급하여 용존산소량을 감소시킨 후 3일간 방치한 것(조건 2)이다.
정상적으로 18시간 배양이 끝났을 경우(대조군)에는 인디루빈 5mg/L와 인디고 681mg/L가 생산되었으며, 3일간 배양을 유지하였을 경우 5mg/L의 인디루빈과 696mg/L의 인디고가 생산되어 별 차이를 보이지 않았다. 반면, 배양 시작 18시간 후 산소공급을 차단하고 3일간 방치한 (조건 1)에서는 210mg/L의 인디루빈과 432mg/L의 인디고가 생산되었으며, 이때 인디루빈과 인디고의 생산비는 33:67로 나타나 대조군에 비해 인디루빈의 생산비가 증가하였다.
배양 시작 18시간 후 산소공급을 차단하고 대신에 질소를 20분간 3vvm으로 공급하여 무산소 상태를 형성한 (조건 2)에서는 176mg/L의 인디루빈과 238mg/L의 인디고가 생산되었으며 이때 인디루빈과 인디고의 생산비는 43:57로 나타났다. 이 경우 인디고에 대한 인디루빈의 생산비는 증가하였으나 전체 인디고이드 생산량 및 인디루빈의 생산량은 감소되었다.
결국 배양 시작 후 18시간이 지나 배양을 완료한 다음 산소공급을 차단하고 3일간 방치하였을 때(조건 1) 인디루빈의 생산량이 가장 높았으며 이때 인디루빈 210mg/L 및 인디고 432mg/L 이 혼합된 상태로 존재하였다. 도 3은 용존산소량 조건에 따른 인디루빈 생산량을 나타낸 그래프이다.
이 혼합된 인디루빈 및 인디고를 C18 컬럼을 이용하여 푸른색과 핑크색을 분리한 다음 핑크색 시료를 NMR 분석한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 인디루빈(핑크색)임을 확인 할 수 있었다.
(실시예 4) 인디루빈 및 인디고의 특성 분석
재조합 플라스미드 pBlue 1.7을 포함하고 있는 E. coli DH5α를 트립토판 배지에서 30℃로 18시간 동안 배양한 후 생산된 검붉은색의 펠레트를 획득하였다. 검붉은색의 펠레트를 증류수로 두 번에 걸쳐 씻은 후 10 ㎖의 디메틸 술폭사이드(DMSO, Sigma)로 재현탁 하였다. 이 후 마이크로프로브를 이용하여 분쇄하였다. 10,000 ㅧ g 로 1분간 원심분리한 후 상층액을 얻어 인디루빈 및 인디고 분석에 사용하였다. Ultrospec 2000 스펙트로포토미터(Amersham Bioscience)를 이용하여 400에서 700nm까지의 파장 범위에서 흡수파장을 측정하였다. 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석은 Agilent 사의 Agilent 1200 HPLC 를 사용하였으며 YMC-pack ODS-A 컬럼(C18, 250ㅧ 4.6 mm)을 이용하여 메탄올과 물 혼합비율이 80 : 20 (v/v)인 혼합 이동상을 1ml/min의 속도로 흘려보내 포토다이오드 분석을 이용하여 최대 흡수 파장 및 인디루빈 생산량을 분석하였다.
도 1은 본 발명의 트립토판 배지내의 아미노산 조성 변화를 통해 형질전환 대장균으로부터 생성되는 인디고 류의 변화를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 1A는 트립토판 배지내의 아미노산 조성변화를 통해 수득된 인디고 류의 다양한 색상 변화를 나타낸다.
도 1B는 트립토판 배지내의 아미노산 조성변화를 통해 형질전환 대장균으로부터 생성되는 인디고 류 생성량 변화에 따른 분광광도계 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 트립토판 함유 배지에서 아미노산을 추가로 첨가시킨 최적 배지(0.15∼0.25%의 트립토판, 0.8∼1.2% NaCl 및 0.3∼0.7% 효모 추출물, 시스테인 0.04∼0.06%, 아르기닌 0.004∼0.006%, 아스파르트산 0.004∼0.006%)에서 인디루빈과 인디고의 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 트립토판 액상배지에서 배양함에 있어서, 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 상기 수성 액상배지에 통기량 3 vvm으로 산소를 18시간 주입하면서 배양한 후 산소 공급을 차단한 조건(조건 1), 상기 수성 액상배지에 통기량 3 vvm으로 산소를 18시간 주입하면서 배양한 후 통기량 3 vvm으로 20분간 질소를 주입한 후 3일간 방치한 조건(조건 2)에서 생성된 인디루빈과 인디고의 함량을 나타내는 그래프이다. 대조군은 정상적으로 통기량 3 vvm으로 산소를 18시간 주입하여 배양을 종료시킨 경우를 나타낸다.
도 4는 인디루빈 색소의 NMR 분석 데이터를 나타낸 것이다.
<110> CHOSUN UNIVERSITY FOUNDATION <120> Biological methods for producing high concentrated indirubin by the recombinant E. coli cells harboring a monooxygenase <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1686 <212> DNA <213> Methylophaga sulfidovorans <400> 1 cattttcacc gtttgatatc cattatcgtt taaccagggc agatggcact gaagtcagcg 60 tccaggataa aggccggggg ctgtactcga aaagcggtat ggtacttggt gttgaaggca 120 ttttgttact cactaacaag tgataacaac ctgattagat ttattttttt caggctaatc 180 tacccccttt tttacccttt tgggataccc acacaagagg atttctccca caaaaaaagc 240 gagctatttt ggttattaag cgctgtcgat tttcgcagca tgattgacta aataacactg 300 tatggagaga cccctatggc aactcgtatt gcgatacttg gtgcaggccc aagtggtatg 360 gcacaactca gagcattcca atccgcccag gaaaaaggtg ctgagatccc tgaactcgtt 420 tgttttgaaa aacaagctga ttggggcggc cagtggaatt acacatggcg cactggttta 480 gatgaaaatg gcgaacctgt tcatagcagt atgtatcgct atctgtggtc aaacggcccg 540 aaagaatgtc ttgaatttgc tgattacacg tttgacgaac actttggtaa gcccatcgcc 600 tcttatccac cccgtgaagt cttatgggac tatattaaag gccgtgttga aaaagccggc 660 gtcagaaaat atatccgttt taataccgct gttcgtcatg ttgaattcaa cgaagacagc 720 caaactttta ccgttaccgt gcaggaccat actactgaca caatttactc tgaagagttt 780 gactatgttg tctgttgtac cggtcacttc tcaacacctt acgtgcctga atttgaaggc 840 tttgaaaaat ttggtggccg cattctgcat gcccatgact tccgtgacgc attagaattt 900 aaagacaaaa ctgtattact ggtcggcagc agttactcag ctgaagatat cggctcacaa 960 tgttataaat acggcgcgaa aaaactgatc agctgctacc gtaccgcacc gatgggttat 1020 aaatggcctg aaaactggga tgaaagaccc aacctggttc gtgttgatac tgaaaacgct 1080 tattttgccg atggttcatc agaaaaagtc gatgcgatta ttctgtgtac cggttatatc 1140 catcacttcc ccttcctcaa tgacgatctg cgtctggtca ccaataaccg tttatggccg 1200 ctcaaccttt ataaaggcgt ggtgtgggaa gataatccaa aattcttcta cattggcatg 1260 caggatcaat ggtacagctt caatatgttt gatgcccaag cctggtatgc ccgtgatgtg 1320 attatgggtc gactgccatt gccatcaaaa gaagagatga aagccgacag catggcctgg 1380 cgtgaaaaag aactgacgct ggttacggct gaagaaatgt acacctacca gggtgactac 1440 attcagaatc tgattgatat gactgactat ccgtcatttg atattccggc aaccaacaaa 1500 actttcctgg aatggaaaca tcacaaaaaa gaaaacatca tgactttccg tgaccactca 1560 taccgttcac tgatgactgg cacgatggca ccgaaacatc acacaccatg gatagatgca 1620 ctggatgatt ctctggaagc ctatctctct gataagagcg aaattcctgt ggctaaagaa 1680 gcttaa 1686

Claims (3)

  1. 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) MPT의(기탁번호 : KCTC 12909)에서 분리된 서열번호 1의 DNA 염기서열을 지니는 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 유전자를 내포하고 있는 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)
  2. 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 0.15∼0.25%의 트립토판, 0.8∼1.2% NaCl 및 0.3∼0.7% 효모 추출물이 함유된 수성 액상배지에서 배양하여 인디루빈을 발효 생성함에 있어서, 상기 액상배지에 시스테인 0.04∼0.06%, 아르기닌 0.004∼0.006%, 아스파르트산 0.004∼0.006%를 추가로 첨가함으로써 인디루빈의 전환율 및 생성량을 증진시키는 인디루빈 발효 생성방법.
  3. 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 0.15∼0.25%의 트립토판, 0.8∼1.2% NaCl 및 0.3∼0.7% 효모 추출물이 함유된 수성 액상배지에서 배양하여 인디루빈을 발효 생성함에 있어서, 형질전환 대장균(기탁번호 : KCTC 11438BP)을 상기 수성 액상배지에 통기량 3 vvm으로 산소를 16∼20시간 주입하면서 배양한 후 산소 공급을 차단하고 통기량 3 vvm으로 20분간 질소를 주입한 후 3일간 방치하여 배양조 내의 용존산소량을 감소시킴으로써 인디루빈의 전환율을 증진시키는 인디루빈 발효 생성방법.
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