KR101891999B1

KR101891999B1 - 신규 해양 유래의 양기아 속(Yangia sp.)인디고 생산 균주 및 이를 이용하여 인디고 색소를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101891999B1
Application number: KR1020170084433A
Authority: KR
Inventors: 우정희; 김해선; 박년호
Original assignee: 재단법인 경북해양바이오산업연구원
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2018-08-27

Abstract

본 발명은 인디고 생산능력이 있는 신규한 양기아 속 4종의 균주에 관한 것으로, 구체적으로 이 4종의 균주는 각각 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01 균주이다. 상기 균주들은 인돌을 기질로 인디고를 최대 29mg/L 수준으로 생합성 할 수 있다.

Description

신규 해양 유래의 양기아 속(Yangia sp.)인디고 생산 균주 및 이를 이용하여 인디고 색소를 생산하는 방법 {Yangia sp. strain from marine source and method for producing indigo dye by using the same}

본 발명은 천연색소인 인디고(Indigo)를 생산하는 세균 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 해양 유래의 인디고 생산 능력을 가지는 세균 균주, 상기 균주를 배양하는 것을 포함하는 인디고 색소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

인디고(Indigo)는 가장 광범위하게 사용되어온 청색 염료 가운데 하나로 전통적으로는 폴리고넘 틱토리움(Polygonumtinctorium),인디고페라 틱토르(Indigoferatinctor)및 이사티스 인디고티카(Isatisindigotica)등의 식물에서 추출하여 사용하였으나, 식물에서 생산되는 인디고는 대량 생산이 어렵고, 추출에 어려움이 있어 주로 화학적인 방법에 의해 대량생산되고 왔다. 하지만 이 과정에서 난분해성 환경오염물질을 발생시키며 인디고 합성에 고에너지가 요구되는 문제점이 존재한다. 또한, 화학합성 인디고는 가격이 저렴하여 주로 청바지나 값싼 옷감에 이용되었고, 고급 옷감의 경우 쪽과 같은 식물에서 추출한 천연 인디고로 염색하여 왔기 때문에 가격이 비싸며 화학합성 인디고는 단일색소로 되어 있는 반면 식물염료의 경우 다양한 색소를 포함하고 있어 염색 후 색감이 다른 것으로 알려져 있다. 따라서 만일 미생물로부터 다양한 색을 나타내는 인디고 혼합물을 대량생산하면 친환경적이면서 저렴한 가격으로 고급 색감을 나타내는 염료로 이용할 수 있다.

미생물에 의한 인디고 생산은 나프탈렌 다이옥시게네이즈(naphthalene dioxygenase)를 발현하는 재조합 E. coli 균주에서 처음 보고되었으며 (Ensly BD et al., 1983, Science, 222(4620):167-9), 페놀 하이드록실레이즈(phenol hydroxylase), 플라빈 함유 모노옥시게네이즈(flavin-containing monooxygenase), 인돌 옥시게네이즈(indole oxygenase)와 같은 multi- 혹은 single oxygenase의 발현을 유도한 재조합 균주에서도 인디고 생성능이 알려져 있다.(Choi HS et al., 2003, , 306(4):930-6, Choi KY et al., 2004, J Microbiol., 42(2):160-2, Kim JY et al., 2005, , 41(2):163-8) 또한, wild-type 균주인 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 에시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 균주에서도 인디고를 생산한 보고가 존재한다. (KEVIN E. O'CONNOR et al., 1997, Applied and Environmental Microbiology, p.4287-4291, Yuanyuan Qu et al., 2010, Bioresource Technology (101)4527-4532)

한편, 인디고 생산 균주들은 기질로써 방향족 화합물(aromatic compound)인 트립토판(tryptophan) 혹은 인돌(indole)로부터 인디고를 생산하는 것으로 알려져 있다.

하지만, 여전히 인디고를 산업적으로 이용할 수 있는 균주들의 종류에는 한계가 있으며, 인디고 생산 수율이 낮다는 문제가 있고 대량생산하는 데에도 어려움이 존재한다.

따라서, 이러한 문제점이 개선된 새로운 인디고 생산 균주 및 이를 이용한 인디고 색소의 생산방법이 요구되고 있는 상황이다.

이상과 같은 문제점을 해소하기 위해, 본 발명은 환경에 해로운 영향을 미치지 않고, 인디고의 합성과정이 단순한 새로운 미생물 및 이러한 미생물을 통해 인디고를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 갯벌에서 다환 방향족 탄화수소류(Poly aromatic hydrocarbons, PAHs)를 분해하는 세균으로부터 인디고 생산능력이 있는 균주를 분리하고, 인디고 생산능이 기존에 밝혀지지 않은 신규 균주들을 동정한 후, 이들의 인디고 생산능력을 확인하였다.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 양기아 속(Yangia sp.)의 인디고 생산 균주를 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 호기 배양하여 인디고를 생산하는 방법을 제공한다.

나아가 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주의 배양이 종료된 후, 인디고 및 균체가 포함된 배양액에서 인디고를 정량하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 갯벌에서 PAHs를 분해하는 미생물 중에서 인디고 생산능력이 있는 새로운 세균을 선별하였으며, 상기 인디고 생산 세균은 양기아 속(Yangia sp.)으로 동정되었다. 이 미생물의 발견은 기존에 밝혀지지 않은 인디고 생산능력이 있는 균주이다.

또한, 본 발명의 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01은 인디고 생산능력을 가지므로, 친환경적이며 안전하게 인디고를 생산하는데 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 미생물에서 인돌을 기질로 한 인디고 생산 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 4종의 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01에 대한 계통발생학적 관계를 분석한 계통수이다.
도 3, 4 및 5는 배지 종류, 인돌 농도, 플라스크 형태에 따른 생육 및 인디고 생성 결과를 각각 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 6은 양기아 속(Yangia sp.) YSBP01 균주에서 생산된 바이오 인디고를 이용하여 린넨 섬유를 1회부터 횟수를 반복하여 염색한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하며, 인디고(indigo) 생산 능력을 가지는 세균 균주를 제공한다. 상기 세균 균주는 양기아 속(Yangia sp) YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01의 4종이다.

상기 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 및 YSBP01은 여수의 갯벌에서 분리된 PAHs를 각각 분해할 수 있는 세균이다. 또한, 양기아 속(Yangia sp.) TSPY52 및 TSMI03은 태안의 갯벌에서 분리된 PAHs를 분해할 수 있는 세균이다. 상기 양기아 속(Yangia sp.) 균주 YSPY11 및 TSMI03은 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 6월 15일자로 KCCM12037P 및 KCCM12036P로 각각 기탁하였으며, 양기아 속(Yangia sp.) 균주 TSPY52 및 YSBP01는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 5월 23일자로 KCCM12028P와 KCCM12029P 로 각각 기탁하였다. 구체적인 양태에서 상기 YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01 균주는 각각 서열번호 1 내지 4의 16s rRNA 서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 인디고 제조용 미생물 제제를 제공한다. 본 발명의 인디고 생합성 미생물 제제는 유효성분으로서 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11, TSPY52, TSMI03 또는 YSBP01 균주를 단독으로, 또는 서로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 균주를 혼합하여 제조할 경우, 인디고 제조 효과는 증진될 수 있다. 본 발명에 따른 인디고 제조용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 인디고 제조용 미생물 제제는 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 미생물 제제의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 혼합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 인디고 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 호기 배양하는 방법은 당 업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 예를 들면 이들 미생물은 Zobell 배지, NY 배지, NY0.1배지, NY1배지 또는 N3Y배지 등의 배지를 사용하여 배양할 수 있고, 바람직하게, 상기 배지는 NY0.1 배지 또는 N3Y 배지, 더욱 바람직하게는 NY0.1 배지에서 배양할 수 있다. 25℃, 중성의 pH(6.5~7.5)에서 호기적인 조건에서 배양하되, 또한, 상기 생산 방법에서 기질은 인돌을 사용할 수 있고, 예를 들어 1 내지 5mM, 바람직하게는 1.5 mM의 인돌을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 배양시 적절한 호기 조건의 조성을 위해 진탕 플라스크를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

1) 인디고 생산 미생물 선별

인디고 생산 미생물을 선발하기 위하여 2011년 5월 2일 여수의 갯벌과 2011년 5월 4일 태안의 갯벌에서 샘플을 채취하였다. 상기 채취한 갯벌 시료 10mg은 Mineral Salt Medium(MSM) 10ml 에 4종류의 PAHs인 Naphthalene, phenanthrene, pylene, benzopyrene를 각각 50ppm의 농도로 첨가하여 50일간 호기 배양하였다. MSM의 배지 조성은 4.0g NaNO₃(KNO₃), 1.5g KH₂PO₄, 0.005g FeCl₃·6H₂O, 0.2g MgSO₄·7H₂O, 0.01g CaCl₂·2H₂O, 0.5g Na₂HPO₄; pH 7.2 (1L 기준)이다.

상기 배양에 의해 생육이 가능한 균주들을 Marine Broth(MB) agar배지에서 순수분리 하였다. MB 배지의 조성은 5.0 g Peptone, 1.0 g Yeast extract, 0.1 g C₆H₅FeO₇ _,19.45g NaCl, 5.9g MgCl₂, 3.24g MgSO₄, 1.8g CaCl₂, 0.55g KCl, 0.16g NaHCO₃, 0.08g KBr, 34.0mg SrCl₂, 22.0mg H₃BO₃, 4.0mg Na₂(SiO₂)_nO, 2.4mg NaF, 1.6mg NH₄NO₃ _,8.0mg Na₂HPO₄ (1L기준) 이다. 이후, 결정상의 인돌이 증기상으로 제공된 평판 배지에서 파란색 혹은 고동색을 나타내는 균주를 스크리닝 하고, 이후 평판배지에서 보다 진하게 파란색 혹은 고동색을 나타내는 균주를 2차 스크리닝 하였다. 이후 인돌을 2mM 농도로 첨가한 액체배양에서 파란색을 진하게 나타내는 균주들을 최종적으로 선별하였다.

2) 16s rRNA 서열에 따른 미생물 계통 발생 분석

각 균주들의 16s rRNA 서열을 분석하였다. 이 서열을 바탕으로 인디고 생산균주를 계통발생학적으로 분류, 동정하였다.

3) 인디고 생산 균주의 배양조건 최적화

분리된 세균의 콜로니를 Zobell 배지에서 20시간 종 배양하였고, 자외선/가시광선 분광기(Spectrophotometer, V630-Bio UV-Vis Spectrophotometer)를 이용하여 최초 Optical density(OD) 600nm 값이 0.1이 되도록 본 배양에 접종하였다. 본 배양에 사용 된 배지는 Zobell, NY, NY0.1, NY1 및 N3Y 배지로서 총 5종류이며, 1mM의 인돌을 사용하였다. 배지 조성은 다음 표 1 내지 5와 같다.

Zobell 배지	함량	단위(/L)
Peptone	5	g
Yeast extract	1	g
FeSO₄4H₂O	10	mg
해양심층수	750	ml
증류수	250	ml

NY 배지	함량	단위(/L)
NaCl	10	g
Yeast extract	5	g

NY0. 1 배지	함량	단위(/L)
NaCl	10	g
Yeast extract	1	g

NY1 배지	함량	단위(/L)
NaCl	10	g
Yeast extract	10	g

N3Y 배지	함량	단위(/L)
NaCl	30	g
Yeast extract	5	g

본 배양은 배지의 종류 및 인돌의 농도, 플라스크(baffled flask)를 사용한 산소 공급 증가 조건에 따라 최적의 배양 조건을 수립하였다. 최종적으로 1.5mM 농도의 인돌을 첨가한 NY0.1 배지에서 25℃, 180rpm의 조건에서 삼각 플라스크를 사용하여 배양하였다.

4) 인디고 생산 능력의 확인

인디고 생산 능력은 배양액을 3~10ml 채취하여 10,000rpm 10분간 원심분리한 후, 파란색의 침전물을 얻은 뒤, 멸균된 3차 증류수를 동일한 볼륨으로 washing 하여 10,000rpm 10분간 다시 원심분리하였다. 파란색의 침전물을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 녹지 않는 균체-인디고 덩어리들은 sonication 하였다. 이후 균체를 제거하기 위해 10,000rpm 10분간 원심분리한 후 순수하게 인디고만 녹은 상등액을 자외선/가시광선 분광기를 사용하여 620nm 값을 측정하였다. DMSO에 녹인 합성 인디고(Synthetic indigo, sigma-aldrich, 229296, 95%)를 표준농도 그래프로 이용하여 인디고량을 정량하였다.

5) 바이오 인디고를 이용한 섬유 염색

양기아 속(Yangia sp.) YSBP01 균주를 20시간 Zobell 배지에서 종배양하였다. 이후 1L 삼각 플라스크에 NY0.1 배지 300ml을 분주하고 1.5Mm의 인돌을 첨가하여 최초 OD600nm값이 0.1이 되도록 종배양액을 접종하였다. 1L의 본 배양은 3반복 하였다. 인디고가 충분히 형성된 3일 차에 배양을 종료하고, 7000rpm, 10℃, 10분 원심분리하여 상등액을 버리고 증류수에 분산하여 washing 한 후, 다시 한 번 원심분리하여 균체-인디고 침전물 상태의 바이오 인디고를 수득하였다. 이를 증류수에 잘 현탁하여, 냉동시킨 뒤 동결 건조하여 분말상태의 인디고를 얻었다. 인디고를 정량하여 약 20mg의 인디고를 얻었다. 상기에 따라 제조된 바이오 인디고를 이용하여 섬유 염색을 하기 위한 염액을 제조하기 위하여, 증류수 200ml을 60~70℃로 데운 후, sodium hydrosulfite(환원제) 10mg과 NaOH(알칼리화)를 5mg 넣어 녹였다. 여기에 분말상의 인디고 20mg을 첨가하여 섞은 결과, 청색의 용액이 환원되면서 녹색→노란색으로 바뀌는 것을 확인하였다. 상기와 같이 제조된 30~40℃의 염액에 5 cm X 5 cm 크기로 자른 린넨 섬유를 담근 후, 1분간 침지한 후, 공기 중에서 3분간 건조 산화하였다. 이 과정을 반복하고, 염색이 완료된 린넨 섬유는 증류수에 충분히 세척하였다.

실시예 2: 결과

1) 인디고 생산 미생물 선별

갯벌에서 분리한 PAHs를 분해하는 세균들 중 인돌을 공기중으로 공급한 고체배지에서 파란색 혹은 고동색을 진하게 나타내는 균주들을 선별하고, 이후 인돌이 첨가된 액체배양에서 파란색을 나타내는 균주들 중에서 YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01이 진한 청색을 나타내었다.

2) 16S rRNA 유전자를 근거로 한 분리된 세균의 동정

4종의 분리된 YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01에 대한 16S rRNA 서열을 분석하였고, 그 결과 YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01의 16s rRNA는 각각 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 서열을 갖는 것을 확인하였다. 그리고 이 16S rRNA 서열을 토대로 계통발생학적 관계를 분석하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01은 양기아 속(Yangia sp.)과 높은 유전적 유사도를 나타내었다.

3) 분리된 세균 양기아 속( Yangia sp .) YSPY11 , TSPY52 , TSMI03 및 YSBP01에 의한 배양 조건 최적화

분리된 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01 균주들의 인디고 생산 능력을 확인하기 위해 배지는 Zobell, NY, NY0.1, NY1 및 N3Y의 5종류에서 배양하였을 때, NY0.1 및 N3Y에서 상대적으로 인디고 형성이 우수하였다(도 3). Zobell 배지 및 NY0.1 배지에서는 최대 OD600nm값이 1.0 수준으로 균체량이 적었고, Zobell 배지에서는 인디고가 거의 생성되지 않은 반면, NY0.1 배지의 배양액에서는 푸른 인디고 색깔을 관찰할 수 있었다. 배지 성분 대비 효율적으로 인디고를 생산할 수 있는 배지는 NY0.1 배지로 판단하였다.

또한, 기질인 인돌의 농도는 1.5 mM에서 생육의 저해 없이 최대의 인디고를 생산하였다(도 4).

마지막으로 진탕 플라스크를 사용하여 보다 산소 공급이 원활한 조건에서 인디고 생성능을 확인한 결과, 진탕 플라스크를 사용하지 않았을 때, 인디고 생성능이 보다 우수한 것으로 나타났다(도 5). 인디고 생성에 있어 충분한 산소공급은 주요한 요인으로 알려져 있지만, 본 실험의 경우 진탕 플라스크를 사용했을 때 과잉의 거품이 발생하여 오히려 공기중의 산소가 배양액으로 혼입되는 것을 방해한 것으로 생각된다.

4) 상기 균주에 의한 인디고 생산 능력의 확인

250ml 삼각 플라스크에 75ml의 NY0.1 배지를 분주하고, 1.5mM의 인돌이 포함된 배양에서 호기적 조건으로 배양한 결과 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11은 5.0mg/L, TSPY52는 15.1mg/L TSMI03는 29.6mg/L, YSBP01는 23.3 mg/L의 인디고를 생산함을 확인하였다(도 5).

5) 바이오 인디고를 이용한 섬유 염색

양기아 속(Yangia sp.) YSBP01 균주에서 생산된 바이오 인디고를 이용하여 린넨 섬유를 염색하였다. 반복 염색할수록 염색의 진하기가 더욱 진해지는 것을 확인 할 수 있었다(도 6).

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12037P

20170615

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12028P

20170523

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12036P

20170615

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12029P

20170523

<110> Gyeongbuk Institute for Marine Bioindustry <120> Yangia sp. strain from marine source and method for producing indigo dye by using the same <130> DPP20172403KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1337 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yangia sp. strain YSPY11 16S rRNA <400> 1 caagagggga cgactaccat gcaagtcgag cgagaccttc gggtctagcg gcggacgggt 60 gagtaacgcg tgggaacgtg cccttctcta cggaatagtc ccgggaaact gggtttaata 120 ccgtatacgc ccttcggggg aaagatttat cggagaagga tcggcccgcg ttagattagg 180 tagttggtgg ggtaatggcc taccaagcct acgatctata gctggtttga gaggatgatc 240 agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt 300 agacaatggg ggcaaccctg atctagccat gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggtcg 360 taaagctctt tcgctgggga agataatgac tgtacccagt aaagaaaccc cggctaactc 420 cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg gttagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa 480 agcgcgcgta ggcggattgg aaagttgggg gtgaaatccc ggggctcaac ctcggaactg 540 cctccaaaac tcccagtctt gagttcgaga gaggtgagtg gaactccgag tgtagaggtg 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Claims

인디고를 생산하는 능력을 가지는 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11(기탁번호:KCCM12037P) 균주.
제1항에 있어서, 상기 YSPY11 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖는 것인, 균주.
인디고를 생산하는 능력을 가지는 양기아 속(Yangia sp.) TSPY52(기탁번호:KCCM12028P) 균주.
제3항에 있어서, 상기 TSPY52 균주는 서열번호 2의 16s rRNA 서열을 갖는 것인, 균주.
인디고를 생산하는 능력을 가지는 양기아 속(Yangia sp.) TSMI03(기탁번호:KCCM12036P) 균주.
제5항에 있어서, 상기 TSMI03 균주는 서열번호 3의 16s rRNA 서열을 갖는 것인, 균주.
인디고를 생산하는 능력을 가지는 양기아 속(Yangia sp.) YSBP01(기탁번호: KCCM12029P) 균주
제7항에 있어서, 상기 YSBP01 균주는 서열번호 4의 16s rRNA 서열을 갖는 것인, 균주.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인디고를 생산하는 능력을 가지는 양기아 속(Yangia sp.) 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 인디고 제조용 미생물 제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인디고를 생산하는 능력을 가지는 양기아 속(Yangia sp.) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 인디고 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 배양단계에서 사용되는 배지는 NY0.1 배지 및 N3Y 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 인디고 생산 방법으로서,
상기 NY0.1 배지는, 10g/L 농도의 염화나트륨(NaCl), 및 5g/L 농도의 효모추출물(yeast extract)을 포함하는 것이고,
상기 N3Y 배지는, 30g/L 농도의 염화나트륨(NaCl), 및 5g/L 농도의 효모추출물(yeast extract)을 포함하는 것인, 인디고 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 배양단계에서 인돌을 기질로 공급하는 것인, 인디고 생산 방법.
제12항에 있어서, 상기 인돌은 1mM 내지 5mM인 것인, 인디고 생산 방법.
제10항에 있어서, 상기 배양은 호기 배양인 것인, 인디고 생산 방법.