JP3321591B2 - 新規微生物、微生物共生体、培養方法及びこれを用いた水処理方法 - Google Patents

新規微生物、微生物共生体、培養方法及びこれを用いた水処理方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【本発明の属する技術分野】本発明は、マンガン酸化能
力を有する新規微生物、セデセア属（Ｃｅｄｅｃｅａ）
ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／１、及びセ
デセア属（Ｃｅｄｅｃｅａ）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ａ／
ＡＳＨＯ−ＲＯ／１、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎ
ａｓ）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｂ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／２、
シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）ＧＳＪ／ＭＩＴ
Ａ２４Ｃ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／３のいずれかの１種若しく
は２種以上と藻類とからなる微生物共生体、この共生体
をKester人工海水の希釈水溶液を用いて培養する方法、
及びこの共生体を用いてマンガン含有水からマンガンを
除去する方法及び該マンガンを利用する方法に関するも
のである。
【０００２】
【従来技術】従来、水中から重金属とくにマンガンを除
去する方法としては、種々の方法が知られているが、化
学的処理ではマンガンイオンを含む水をpH10以上の強ア
ルカリ性にすることで二酸化マンガンの沈澱を作って水
系から分離除去した後にその水を中和してから排出して
おり、また、微生物による除去方法は栄養源となる多量
の有機物を添加する必要があるだけでなく、通常はマン
ガン除去能力を示す微生物だけを分離純化して利用する
ことが多く、それら微生物を継代培養して保存している
間にマンガン除去能力を失うこともあるなど、いずれも
除去性能やコスト的に未だ満足し得るものはなく、安価
で効率の良くマンガンを除去するマンガンを含む水の処
理方法の開発が望まれている。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】本発明は、効率良く
重金属とくにマンガンを除去する能力を有する新規な微
生物とその微生物共生体が存在することを発見し、新規
な微生物、微生物共生体、微生物共生体の培養方法、マ
ンガン含有水からマンガンを除去する方法および回収し
たマンガンを再利用する方法を提供することを課題とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特殊な微
生物共生体が水中において、重金属とくにマンガンを、
固体状のものではそれを捕獲し、溶解しているものでは
それを酸化して沈殿させる作用を有していることを見出
し、本発明を完成した。即ち、本発明は、次の通りであ
る。
【０００５】（１）セデセア属 FERM P-17064菌株およ
び／またはシュワネラ属 FERMP-17220菌株からなるマン
ガン酸化細菌と藻類が共生した微生物共生体。（２）藻
類がオシラトリア（Ocillatoria）などの藍藻、ナビキ
ュラ（Navicula）などの珪藻およびウロトリックス(Ulo
thrix)などの緑藻を含むものである、上記（１）記載の
微生物共生体。
【０００６】（３）上記（１）または（２）記載の微生
物共生体を、マンガンを含有する水と接触させることに
より、マンガンを酸化沈殿させ、水中のマンガンを除去
することを特徴とする、実質的に有機物を添加しない水
処理方法。
【０００７】
【０００８】
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の微生物共生体の入手源
は、自然界においてマンガンイオンが溶解している水中
とその周辺のマンガン沈澱物からであり、好ましくは有
機物が少なく適度な光照射のある場所である。マンガン
酸化能力を有する新規微生物、セデセア属（Ｃｅｄｅｃ
ｅａ）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／１、
アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ＧＳＪ／ＭＩＴ
Ａ２４Ｂ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／２又はシュワネラ属（Ｓｈ
ｅｗａｎｅｌｌａ）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｃ／ＡＳＨＯ
−ＲＯ／３の１種若しくは２種以上を含む微生物と藻類
とからなる微生物共生体は、大量培養することができ
る。上記藻類としては、オシアトリア（Ocillatoria)な
どの藍藻（シアノバクテリア）、ナビキュラ（Navicul
a) などの珪藻、ウルトリックス(Ulothrix)などの緑藻
が挙げられる。そして、上記培養条件は、酸性から弱ア
ルカリ性、好ましくはpH5〜8で、かつ、有機物を含有し
ない水を用いて、太陽光のみで培養を行うことが望まし
い。したがって、有機物を栄養源として特に人工的に添
加する必要もないので、非常に簡単な方法でかつ安価に
培養物を得ることができる。
【００１０】
〔実施例１〕
（１）微生物の入手場所 自然界から微生物を入手した。
【００１１】（２）微生物の採取方法 オシラトリア（Ocillatoria)などの藍藻（シアノバクテ
リア）、ナビキュラ（Navicula) などの珪藻、ウロトリ
ックス(Ulothrix)などの緑藻をはじめとする微細な藻類
などの微生物から構成される繁茂体，二酸化マンガンな
どの沈澱物、あるいはその両者より構成される集合体、
などの試料から菌を入手するが、標準的には藻類の表面
から３mmまでのものを１ml採取し９mlの水に加えて全体
を１０mlとして用いた。なお、この微生物は、以下に示
す実験より３種類の微生物からなることが判明したが、
この混合微生物をＧＳＪ−ＭＩＴＡ−ＡＳＨＯＲＯ−Ｍ
Ｎ−ＭＡＴ−１と名付けて、工業技術院生命工学工業研
究所技術研究所への寄託を試みたが凍結処理による保存
ができないため、受託を拒否された。
【００１２】（３）マンガン酸化細菌の育成、選別、単
離 温泉組成に近い塩類濃度の人工無機塩類水溶液として、
Kester人工海水（KSW:Kester et. al., 1967）の20%水
溶液を調製した。前述の入手試料を人工無機塩類水溶液
によって段階希釈した懸濁水を、1/2 TZ-Mn 培地（Maru
yama et al., 1993）中のKSW濃度を20%に改良したYF1-M
n培地（Mita et al., 1994）で調製した寒天平板培地に
塗布し、20℃あるいは37℃で培養して育成した。出現し
たコロニーの中からTMBZ・HCl水溶液を青色に呈色させ
る能力を有するコロニーだけを選別し、これらの中から
形状の異なるコロニーをそれぞれ分離し、菌株を単離し
た。ここでは，菌の名称を便宜上、Mn-24(A)をＧＳＪ／
ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／１菌株，Mn-24(B)を
ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｂ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／２菌株、Mn
-24(C)をＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｃ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／３
菌株と称する。
【００１３】（４）マンガン酸化細菌の菌株の同定方法 菌株の同定は、（財）日本食品分析センターに委託し
た。菌株について形態観察、生理的性状試験、キノン系
および菌体内DNAのGC含量の測定を行ない、Kriegand Ho
lt (1984), Holt et al. (1994), MacDonell and Colwe
ll (1985), Leeet al. (1977), Nozue et al. (1992)を
参考にして同定した。 （５）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／１菌
株の菌学的性質と同定 菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。この菌株
は腸内細菌科の Cedecea davisae に近い性状を示した
が、Cedecea 属の特徴であるリパーゼを有さないが、オ
キシダーゼ陰性の通性嫌気性グラム陰性桿菌であること
から、Ｃｅｄｅｃｅａ属 に最も近似していた。そこ
で、この新規な微生物をセデセア属（Cedecea）ＧＳＪ
／ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／１と命名して、平
成１０年１１月２５日に通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ
−ＲＯ／１として寄託した。寄託番号は ＦＥＲＭ Ｐ
−１７０６４である。
【００１４】 ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ａ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／１ 菌株の菌学的性質 （試験項目） （試験結果） 形 態 桿 菌 グラム染色性 − 胞 子 − 運 動 性 ＋ 鞭 毛 周 毛 酸素に対する態度 通性嫌気性 オキシダーゼ − カタラーゼ ＋ ＯＦ Ｆ 集落の色調 NP（注１） 乳糖からのガスの生成 ＋（slow） インドールの生成 − メチルレッド試験 ＋ Ｖ Ｐ 反応 ＋ クエン酸塩の利用（シモンズ） ＋ 硫化水素の生成 − 尿素の分解 − フェニルアラニンデアミナーゼ − リジンデカルボキシダーゼ ＋（slow） アルギニンジヒドロラーゼ − オルニチンデカルボキシラーゼ ＋ ゼラチンの液化 − マロン酸塩の利用 ＋ グルコースからの酸の生成 ＋ グルコースからのガスの生成 − 酸の生成 セロビオース ＋ グリセリン ＋ マルトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｌ−ラムノース − サリシン ＋ トレハロース ＋ Ｄ−キシロース ＋ エスクリンの加水分解 ＋ 硝酸塩の還元 ＋ ＤＮＡの分解 − リパーゼ − ＯＮＰＧ ＋ 菌体内 ＤＮＡのＧＣ含量（モル％） 54 キノン系 Q-8 （注１）特徴的集落色素を生成せず
【００１５】（６）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｂ／ＡＳＨＯ
−ＲＯ／２菌株の菌学的性質と同定 菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。この菌株
は、オキシダーゼが陰性で鞭毛が極単毛であったが、運
動性を有する通性嫌気性グラム陰性桿菌であることや、
菌体内 DNA の CG 含量やキノン系からみると Aeromona
s 属に最も近似していた。そこで、この新規微生物をア
エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ
２４Ｂ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／２と命名したが、この菌は、
活力が弱いので通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託できなかった。
【００１６】 ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｂ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／２ 菌株の菌学的性質 （試験項目） （試験結果） 形 態 桿 菌 グラム染色性 − 胞 子 − 運 動 性 ＋ 鞭 毛 極単毛 酸素に対する態度 通性嫌気性 オキシダーゼ − カタラーゼ − ＯＦ Ｆ 集落の色調 NP（注１） 菌体内 ＤＮＡのＧＣ含量（モル％） 56 キノン系 Q-8, MK-8, DMK-8 （注１）特徴的集落色素を生成せず
【００１７】ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｃ／ＡＳＨＯ−ＲＯ
／３菌株の菌学的性質と同定 菌株の菌学的性質は以下に示すとおりである。菌株は S
hewanella putrefaciens である。 Shewanella は極鞭
毛で、キノン系にメチルメナキノン（MMK）を有するグ
ラム陰性桿菌であり、主に水生生物や海洋生物から分離
されている。なお、 Shewanella putrefaciens は MacD
onell and Colwell (1985)によってAlteromonas 属から
移行された菌である。
【００１８】この新規微生物をシュワネラ・プトレファ
シエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｐｕｔｒｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｃ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／３と
命名し、平成１１年２月１７日に通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所にＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｃ／Ａ
ＳＨＯ−ＲＯ／３として寄託した。寄託番号は、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７２２０である。
【００１９】 ＧＳＪ／ＭＩＴＡ２４Ｃ／ＡＳＨＯ−ＲＯ／３菌株の菌学的性質 （試験項目） （試験結果） 形 態 桿 菌 グラム染色性 − 胞 子 − 運 動 性 ＋ 鞭 毛 極単毛 酸素に対する態度 好気性 オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ ＯＦ Ｏ 集落の色調 茶色系 Ｎａ＋要求性 ＋ 塩類要求性 ０％ＮａＣｌ培地での生育 ＋ １％ＮａＣｌ培地での生育 ＋ 海水培地での生育 ＋ ＤＮＡの分解 ＋ アルギニンジヒドロラーゼ − オルニチンデカルボキシラーゼ ＋ リジンデカルボキシラーゼ − 硫化水素の生成 ＋ 溶血性（羊血液） ＋ ６％ＮａＣｌ存在下での生育 ＋ ４℃での生育 ＋ ３７℃での生育 ＋ ４２℃での生育 − ＳＡ寒天培地での生育 − 酸の生成 Ｄ−リボース − マルトース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ 資化性 イソロイシン − コハク酸塩 ＋ グリセリン − グルコース ＋ グルコサミン − 菌体内のＤＮＡのＧＣ含量（モル％） 48 キノン系 Ｑ-8，Q-7，MMK-7, MK-7
【００２０】〔実施例２〕 イ．微生物共生体の採取とスクリーニング （１）Kester人工海水を５倍希釈した溶液に硫酸マンガ
ンを添加して、マンガン（ＩＩ）濃度を２〜３ｐｐｍ程
度にした溶液を孔径０. ２μｍの滅菌済みフィルター
で無菌濾過した濾液（А液）を調製する。
【００２１】（２）緑色ないし深緑色、または褐色ない
し黒色の微生物マットを滅菌済みの袋や瓶などに採取
し、А液が入っている滅菌済み試験管（キャップ付）に
全液量の約１０％となる微生物マットを入れ、試験管ミ
キサーなどで良く混合する。すばやくこの液を２分し、
滅菌済み試験管（キャップ付１０ｍｌ）に分液する。こ
の微生物マットに蛍光試薬のＤＡＰＩを添加して蛍光顕
微鏡で観察し、シアノバクテリヤと細菌の存在を確認す
る。
【００２２】（３）２分した試験管の一方はオートクレ
ーブにより、１２１℃、２気圧で１５分間の滅菌処理を
行い、それを滅菌済み試料懸濁液と称する。他方のなに
も処理しない試験管を、未処理（生）の試料懸濁液と称
する。 （４）それぞれ２５ｍｌのА液を入れた３本の滅菌済み
試験管（キャップ付、５０ｍｌ）を用意し、なにも加え
ていない試験管１、滅菌済みの試料懸濁液２ｍｌを添加
した試験管２、未処理（生）の試料懸濁液２ｍｌを添加
した試験管３を作成する。
【００２３】（５）これら３本の試験管は、それぞれ良
く攪拌した後、自然光照射下、３７℃で４日間、静置培
養する。 （６）各液を孔径０. ２μｍのフィルター（滅菌の必
要はない）で濾過して、試験管に約０. ５ｍｌを分取
する。 （７）これらにそれぞれ、フォルムアルドキシム溶液
０. ５ｍｌ、ｐＨ１０緩衝液０. ５ｍｌを加え、混合
した後に約１０分間放置する。 （８）試験管１からの反応液は暗赤色に呈色する。試験
管２からの反応液の呈色より試験管３からの反応液の呈
色の方が顕著に弱ければ、目的の活性を有する（陽性）
と判断されるので採用する。しかし、前記２と３の呈色
にほとんど差がなければ活性がほとんどない（陰性）と
判断して採用しない。 （９）この選別で採用された培養物は、マンガン除去に
有効である。
【００２４】ロ．微生物共生体の培養 本発明の微生物共生体の培養では、特に人工的に有機物
の添加をしなくてもよく、Kester人工海水の20%水溶液
にマンガン60ppmを含んだ溶液１００mlに、あるいは採
取地で共生体と接している試料水を滅菌した液１００ml
に、上記の選別方法で選別したものを１ml採取し９mlの
水に加えて全体を１０mlとした微生物共生体サンプルか
ら０．２mlを加えて、自然光下あるいは人工照明下に
て、37℃で静置して培養した。
【００２５】ハ．微生物共生体によるマンガンを含む水
の処理 ２. ４ｐｐｍの濃度でマンガンを含んでいる温泉水を
滅菌フィルターで濾過して、滅菌処理した。滅菌処理し
た水を以下のように調整して、Ａ、Ｂ、Ｃの３つに分け
てそれぞれ３７℃の温度に保ち、自然光のなかで３日間
放置した。
【００２６】Ａは、滅菌処理した水になにも添加しなか
ったものである。Ｂは、（１）で育成した微生物共生
体：温泉水を容積比で１：９にし、これをオートクレー
ブ中で１２１℃、２気圧で滅菌処理したものを、滅菌処
理した水に対して０. ２％（容量比）添加したもので
ある。Ｃは、１）で育成した微生物共生体：温泉水を容
積比で１：９にしたものをそのまま生で、滅菌処理した
水に対して０. ２％（容量比）添加したものである。
なお、各Ａ、Ｂ、Ｃの資料は均一に攪拌されたのち、静
止放置された。
【００２７】放置した結果を図２に示す。Ａは、３日の
間、全く変化しなかった。Ｂは、２日の間に変化し、マ
ンガンイオンは、１.８ｐｐｍにまで低下した。Ｃは、
２日の間に大きく変化し、３日目には、 ほぼゼロにち
かいところまでマンガンイオンが低下していた。
【００２８】〔実施例３〕 微細藻類の分類観察 生成中の二酸化マンガンの沈殿物を伴う未染色の微生物
繁茂体をスライドガラスにとり、位相差顕微鏡或いは明
視野顕微鏡で内部構造を観察し、細胞内に核を有しない
原核生物である細菌及び藍藻と、核を有する真核生物で
ある他の生物を区別する。また、同じ未染色の試料に紫
外線照射してオレンジ色の蛍光を発する葉緑素の自家蛍
光を落射蛍光顕微鏡下で観察することにより、藍藻、緑
藻、珪藻等の藻類と別の微生物を区別する。さらに、蛍
光試薬ＤＡＰＩを添加した細胞に紫外線照射して、オレ
ンジ色の蛍光を発する藍藻の核酸の分布形と、青から白
の蛍光を発する細菌の核酸の分布形とを合わせて観察す
る。これらの結果を組み合わせて一般の微生物図鑑から
藍藻、緑藻、珪藻等の藻類の分類を観察する。本発明に
おける微生物共生体中の藻類には、顕微鏡下での観察に
よってオシラトリア(Ocillatoria) などの藍藻、ナビキ
ュラ（Navicula) などの珪藻、ウロトリックス(Ulothri
x)などの緑藻などの生存が認められている。
【００２９】〔実施例４〕 マンガン酸化細菌の菌株に
よるマンガンを含む水の処理 ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養を添加した人工海
水溶液、あるいはその人工海水濃度を５倍程度まで希釈
した溶液に、マンガン酸化細菌の菌株の１種または２種
以上を接種した系を調整し、無接種の系とともに３７℃
或いは２０℃において振とう培養する。この液の一部を
分取して、660nm における吸光度( 光学密度、OD 660)
微生物量及び溶存マンガン濃度(Mn2+) を測定する。
【００３０】マンガンの初期濃度を60ppm として有機栄
養を添加した20mlの100％人工海水溶液のｐＨを7.5 と
し、マンガン酸化細菌の１白金耳を接種した系と、未接
種（無菌）系の液を２０℃で培養した結果を図１に示
す。この図から、高塩濃度の液体中でも二酸化マンガン
の沈殿が生じ、化学的には沈殿しない水溶液から高濃度
のマンガンイオンを除去することができることが判る。
そして、この回収されたマンガンは、乾電池、釉薬等の
製造原料として利用することができる。
【００３１】
【発明の効果】本発明の微生物、微生物共生体は、これ
までに人工的に単離されたり、培養されたことはないも
のであり、そして、この微生物共生体を用いた重金属と
くにマンガンの除去法は、マンガンを含む種々の水をpH
10以上の強アルカリ性にする必要がないことから、廃水
処理に適用してマンガンの除去を低コストで行うことが
できる。
【００３２】また、この処理法によりマンガンを含む廃
棄物、例えば使用済み乾電池、古鉄材などから、元の資
源である二酸化マンガンを再生することができる。更
に、この処理法で得られる沈着した二酸化マンガンは、
高品位であるため、乾電池、鉄、釉薬、ガラスなどの製
造原料として有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物の生育状態及びマンガンイオンの除去効
果を示す図である。
【図２】本発明による水中のマンガンの除去効果を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ２２Ｂ 47/00 Ｃ２２Ｂ 47/00 //(Ｃ１２Ｎ 1/12 (Ｃ１２Ｎ 1/12 Ｃ１２Ｒ 1:89） Ｃ１２Ｒ 1:89） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 加藤 義重 茨城県つくば市小野川16番３ 工業技術 院 資源環境技術総合研究所内 (72)発明者 丸山 明彦 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 東原 孝規 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 金井 豊 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 地質調査所内 (72)発明者 臼井 朗 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院 地質調査所内 (72)発明者 三浦 裕行 北海道札幌市北区あいの里３条７丁目５ −32 (72)発明者 伊藤 孝 茨城県水戸市文京１−１ 愛宕住宅１− 303 (72)発明者 田代 英俊 東京都武蔵野市境南町１−22−２ シエ ロビスタ203号 審査官 坂崎 恵美子 (56)参考文献 特開 昭59−177198（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔ ｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ．16（５），ｐ．267−273 （1996) Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｓｅ ｒ．３，Ｖｏｌ．310（７），ｐ．273− 278（1990) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/12 C12N 1/20 C22B 47/00 C02F 3/34 ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴ Ｎ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 セデセア属 FERM P-17064菌株および／
    またはシュワネラ属FERM P-17220菌株からなるマンガン
    酸化細菌と藻類が共生した微生物共生体。
  2. 【請求項２】 藻類がオシラトリア（Ocillatoria）な
    どの藍藻、ナビキュラ（Navicula）などの珪藻およびウ
    ロトリックス（Ulothrix）などの緑藻を含むものであ
    る、請求項１記載の微生物共生体。
  3. 【請求項３】 請求項１または２記載の微生物共生体
    を、マンガンを含有する水と接触させることにより、マ
    ンガンを酸化沈殿させ、水中のマンガンを除去すること
    を特徴とする、実質的に有機物を添加しない水処理方
    法。
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