CN103013886B - 一种藻毒素降解菌的原生质体制备与再生 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水处理微生物技术领域，具体涉及一种藻毒素降解菌的原生质体制备与再生。该菌分离自蓝藻脱水压滤液，经鉴定为锤形赖氨酸芽孢杆菌，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6107，保藏名称为MC-LR降解菌R3。本发明主要包括该菌种子培养液的制备、菌丝悬液的制备、细胞壁的酶解、原生质体悬液的制备和原生质体的再生。本发明所采用的原生质体制备与再生，对降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率最高可达85.10%，再生率可达38.40%，且制备与再生过程中设备要求低，操作简单，酶解时间与再生周期短，有利于R3后续融合子的制备及工程菌的构建。
Description
技术领域
本发明涉及水处理微生物技术领域，具体涉及一种藻毒素降解菌的原生质体制备与再生。
背景技术
近年来，随着社会经济的发展，大量含氮磷等营养元素的污水进入自然水体，导致水体富营养化问题日渐严重，我国一些地区如太湖、巢湖及滇池等流域蓝藻水华年年爆发。湖泊或水库中发生蓝藻水华，不仅削减其生态调节和水体自净的能力，同时藻体堆积死亡、藻细胞破裂分解过程中，向水体释放大量藻毒素。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是目前我国出现频率最高、毒性最强、急性危害最大的一类藻毒素，它对人类和其他生物的脾脏、肝脏、肾脏、大肠、心脏等都具有明显“三致”毒害作用，危及环境生态并对人们饮用水安全构成威胁。
MC-LR分子形态呈七肽环状，结构稳定，加热、煮沸等一般方法不易将毒性去除，这也加大了控制和消除MC-LR污染的难度。传统的净水工艺，如国内水厂广泛采用的混凝、沉淀和过滤工艺不能有效去除MC-LR，其中混凝、沉淀通过去除藻类而去除细胞内的MC-LR，但不能去除细胞外溶解性MC-LR，而过滤可去除部分细胞内的MC-LR，但对细胞外MC-LR的去除作用较弱，不能保证出水MC-LR达标。因此，迫切需要寻求能有效去除饮用水中MC-LR的方法。国内外学者对环境水体中MC-LR的降解与去除进行了多方面研究，对饮用水中MC-LR比较有效的处理技术有活性炭吸附、光降解与光催化氧化、臭氧氧化、化学药剂氧化、膜滤及生物降解等，但这些技术均存在一些不足——易产生二次污染（生成较多有机副产物）、能耗大、运行成本高等，难以应用于实际工程中。微生物法是处理MC-LR较有效的一种方法，它既可以减少物理法人力、物力及财力的大量投入，又可以避免化学法二次污染的风险。《生物学杂志》（2010）第27卷第6期57-64页报道了钟升等从巢湖底泥中分离出5株菌，并利用其对微囊藻毒素进行降解，其中M9菌48h对MC-LR降解率达到62.2％。专利授权发文号为2012061900548110的专利，张文艺等(即本发明人)从太湖蓝藻重污染河浜底泥中筛选到的一株MC-LR降解菌，对MC-LR的降解率可达到66.95%。虽然目前已有不少关于MC-LR降解菌的研究报道，但从自然界中筛选得到能够降解MC-LR的菌株种类不多，种群结构较单一，降解效率不高且降解菌的环境适应性不强，难以用于实际的工程中。本发明以筛得的自然菌株为基础，采用原生质体融合技术制备该藻毒素降解菌的原生质体。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是将两个遗传性状不同的亲株通过基因重组得到兼具两者优良性状的融合菌，是一种构建高效工程菌的技术方法。《高校化学工程学报》（2009）第23卷第6期1064-1068页报道了何光裕等采用原生质体融合技术制备2株脱色菌的原生质体，并由此构建了一种高效脱色工程菌H-1，对染料废水有比较好的脱色效果。
原生质体制备与再生是进行原生质体融合的首要和前提条件，它直接影响着后续融合实验及融合子再生的顺利进行。目前国内外研究显示，菌株原生质体制备与再生率大多处于较低水平，且波动性很大。探索适合特定菌株的最佳制备与再生条件，提高其制备与再生率，对于该菌株后续转基因研究具有重要意义。
针对MC-LR的生物降解菌种类不多，种群结构较单一，降解效率不高等问题，研究MC-LR降解菌的原生质体制备与再生对后续构建高效MC-LR降解工程菌具有重要的理论和实用价值。
本发明制备了本实验室分离保存的1株MC-LR降解菌R3（Lysinibacillus fusiformis）的原生质体，该菌是本实验室从蓝藻脱水压滤液中分离出来的一株降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，当添加葡萄糖为外加碳源时其对MC-LR的去除率可达到59.26%。该降解菌的国家发明专利申请号为201210275635.3，并在美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank进行了注册（注册序列号为JQ991002），同时送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（保藏号为CGMCC NO.6107）。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备与再生。
本发明所采用的具体技术方案如下：
本发明的原生质体制备与再生按照下述的具体步骤进行操作：
A、种子培养液的制备
从纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CGMCC NO.6107的斜面培养基中挑取一环菌接入新鲜细菌液体培养基，28℃下活化培养5-60h至不同的生长期，得到种子培养液；
B、菌丝悬液的制备
将4mL上述种子培养液离心，使得菌体与培养液分离；弃去上清液，向沉淀的菌体中加入SMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.6-1.96mL的SMM缓冲液重悬，得到菌丝悬液；
C、细胞壁的酶解
在上述的菌丝悬液中加入0.04-0.4mL的溶菌酶和2mL的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，其中溶菌酶浓度为10mg/mL，EDTA溶液浓度为0.8mg/mL且加热至酶解温度32℃；在温度为32℃的水浴锅中酶解1h，得到酶解溶液；
D、原生质体悬液的制备
将上述酶解得到的溶液离心，使得原生质体与酶解液分离；弃去上清液，向沉淀的原生质体中加入浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤原生质体3次；用浓度为0.55mol/L NaCl溶液悬浮，得到原生质体悬浮液；
E、原生质体的再生
将上述步骤的原生质体悬浮液，振荡混匀，用浓度为0.55mol/L的NaCl溶液稀释后，涂布于高渗固体培养基上，置于32℃恒温培养箱中培养24-48h，得到原生质体再生菌落。
制备率与再生率的计算：将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释至10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别吸取100μl、100μl和200μl涂布在细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基上，其中用NaCl溶液稀释的酶解后悬浮液放置15min，使原生质体充分吸水胀破后涂布，每个稀释度做三个平行，于32℃恒温培养箱中倒置培养24-48h，待菌落大小、形态生长较为良好时计其菌落数为A、B和C。根据下述公式计算原生质体的制备率和再生率。
其中A为总菌落数，即种子培养液经无菌蒸馏水稀释后涂布于细菌固体培养基上生长的菌落数；B为未被原生质体化的菌落数，即原生质体悬浮液经无菌蒸馏水稀释后涂布于细菌固体培养基上生长的菌落数；C为再生菌落数，即原生质体悬浮液经高渗NaCl溶液稀释后在高渗固体培养基上生长的菌落数。
本发明所述的培养基及相关溶液的组成如下：
（1）细菌液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4；
（2）细菌固体培养基：在上述细菌液体培养基（1）中加入琼脂粉20-24g；
（3）高渗固体培养基：蛋白胨10g，酵母浸出汁5g，牛肉膏5g，蔗糖170g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.2，琼脂粉20-24g；
（4）高渗NaCl溶液(0.55mol/L)：NaCl32.14g，超纯水1000mL；
（5）SMM缓冲液：蔗糖188.26g，顺丁希二酸2.3214g，MgCl2·6H2O4.066g，超纯水1000mL，pH6.8；
（6）EDTA溶液（0.8m/L）：EDTA0.8g，SMM缓冲液1000mL；
（7）溶菌酶(10g/L)：10g，SMM缓冲液1000mL。
上述培养基和溶液均于高压灭菌锅中121℃、100KPa的条件下灭菌25min后使用。
作为本发明上述原生质体制备与再生的一种优选方案：选取培养15h的种子培养液，用1.8mL的SMM缓冲液重悬菌丝，加入浓度为10mg/mL溶菌酶0.2mL和2mL的EDTA溶液使得体系中酶浓度为0.5mg/mL，在温度32℃条件下酶解1h，涂布后培养24h，该纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3原生质体制备率与再生率最佳。
本发明的有益效果：
本发明所采用的原生质体制备与再生，对降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率最高可达85.10%，再生率可达38.40%，且制备与再生过程中设备要求低，操作简单，酶解时间与再生周期短，有利于R3后续融合子的制备及工程菌的构建。
具体实施方式
一种降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3原生质体制备与再生。
从保藏菌株R3（Lysinibacillus fusiformis）的斜面培养基中挑取一环菌接入装有30mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130r/min的振荡培养箱中活化培养5-60h，得到R3的种子培养液。取4mL在4300r/min转速下离心12min；向沉淀的菌体中加入4mLSMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.6-1.96mL的SMM缓冲液重悬，得到R3的菌丝悬液。加入0.04-0.4mL浓度为10mg/mL的溶菌酶和2mL加热至32℃浓度为0.8mg/mL的EDTA溶液，在水浴锅中32℃条件下酶解1h，得到R3的酶解溶液。在转速3200r/min条件下离心8min，向沉淀的原生质体中加入4mL浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤3次，用4mL该溶液悬浮R3的原生质体。将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释到10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布于细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基，置于32℃恒温培养箱中培养24-48h。
下面通过5个实施例具体说明上述内容：
实施例1
从保藏菌株R3（Lysinibacillus fusiformis）的斜面培养基中挑取一环菌接入装有30mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130r/min的振荡培养箱中活化培养15h，得到R3的种子培养液。取4mL在4300r/min转速下离心12min；向沉淀的菌体中加入4mLSMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.8mL的SMM缓冲液重悬，得到R3的菌丝悬液。加入0.2mL浓度为10mg/mL的溶菌酶和2mL加热至32℃浓度为0.8mg/mL的EDTA溶液，在水浴锅中32℃条件下酶解1h，得到R3的酶解溶液。在转速3200r/min条件下离心8min，向沉淀的原生质体中加入4mL浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤3次，用4mL该溶液悬浮R3的原生质体。将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释到10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布于细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基，置于32℃恒温培养箱中培养24h。得到纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率为85.10%，再生率为38.40%。
实施例2
从保藏菌株R3（Lysinibacillus fusiformis）的斜面培养基中挑取一环菌接入装有30mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130r/min的振荡培养箱中活化培养12h，得到R3的种子培养液。取4mL在4300r/min转速下离心12min；向沉淀的菌体中加入4mLSMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.6mL的SMM缓冲液重悬，得到R3的菌丝悬液。加入0.4mL浓度为10mg/mL的溶菌酶和2mL加热至32℃浓度为0.8mg/mL的EDTA溶液，在水浴锅中32℃条件下酶解1h，得到R3的酶解溶液。在转速3200r/min条件下离心8min，向沉淀的原生质体中加入4mL浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤3次，用4mL该溶液悬浮R3的原生质体。将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释到10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布于细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基，置于32℃恒温培养箱中培养40h。得到纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率为77.65%，再生率为20.50%。
实施例3
从保藏菌株R3（Lysinibacillus fusiformis）的斜面培养基中挑取一环菌接入装有30mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130r/min的振荡培养箱中活化培养12h，得到R3的种子培养液。取4mL在4300r/min转速下离心12min；向沉淀的菌体中加入4mLSMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.8mL的SMM缓冲液重悬，得到R3的菌丝悬液。加入0.2mL浓度为10mg/mL的溶菌酶和2mL加热至32℃浓度为0.8mg/mL的EDTA溶液，在水浴锅中32℃条件下酶解1h，得到R3的酶解溶液。在转速3200r/min条件下离心8min，向沉淀的原生质体中加入4mL浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤3次，用4mL该溶液悬浮R3的原生质体。将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释到10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布于细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基，置于32℃恒温培养箱中培养36h。得到纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率为81.03%，再生率为26.59%。
实施例4
从保藏菌株R3（Lysinibacillus fusiformis）的斜面培养基中挑取一环菌接入装有30mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130r/min的振荡培养箱中活化培养40h，得到R3的种子培养液。取4mL在4300r/min转速下离心12min；向沉淀的菌体中加入4mLSMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.68mL的SMM缓冲液重悬，得到R3的菌丝悬液。加入0.32mL浓度为10mg/mL的溶菌酶和2mL加热至32℃浓度为0.8mg/mL的EDTA溶液，在水浴锅中32℃条件下酶解1h，得到R3的酶解溶液。在转速3200r/min条件下离心8min，向沉淀的原生质体中加入4mL浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤3次，用4mL该溶液悬浮R3的原生质体。将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释到10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布于细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基，置于32℃恒温培养箱中培养48h。得到纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率为22.58%，再生率为14.28%。
实施例5
从保藏菌株R3（Lysinibacillus fusiformis）的斜面培养基中挑取一环菌接入装有30mL新鲜细菌液体培养基的锥形瓶中，在温度为28℃，转速为130r/min的振荡培养箱中活化培养17h，得到R3的种子培养液。取4mL在4300r/min转速下离心12min；向沉淀的菌体中加入4mLSMM缓冲液，离心洗涤菌丝3次；用1.88mL的SMM缓冲液重悬，得到R3的菌丝悬液。加入0.12mL浓度为10mg/mL的溶菌酶和2mL加热至32℃浓度为0.8mg/mL的EDTA溶液，在水浴锅中32℃条件下酶解1h，得到R3的酶解溶液。在转速3200r/min条件下离心8min，向沉淀的原生质体中加入4mL浓度为0.55mol/L的NaCl溶液，离心洗涤3次，用4mL该溶液悬浮R3的原生质体。将溶菌酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释到10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布于细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基，置于32℃恒温培养箱中培养28h。得到纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备率为77.65%，再生率为28.78%。
Claims (1)
1.一种藻毒素降解菌的原生质体制备与再生方法，其特征如下：
从纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3CGMCC NO.6107的斜面培养基中挑取一环菌接入新鲜细菌液体培养基，130r/min、28℃条件下活化培养5-60h至不同的生长期，得到R3种子培养液；继而制备菌丝悬液，32℃、1h条件下酶解细胞壁，进行原生质体悬液的制备;将上述酶处理前的种子培养液用无菌蒸馏水，酶解后的原生质体悬浮液同时用无菌蒸馏水和浓度为0.55mol/L的NaCl溶液均稀释至10-6、10-7和10-8三个浓度梯度，分别涂布在细菌固体培养基、细菌固体培养基和高渗固体培养基上，置于32℃恒温培养箱中培养24-48h，得到原生质体再生菌落。
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