CN103849586B - 一种海绵共生蓝藻的分离培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，特点是包括从海洋中筛选颜色带有蓝绿或黄色海绵样品的步骤；将海绵样品经浸泡除杂后切块，将海绵块和含有抗生素的消毒海水加入到培养瓶直至海绵块下部浸没在水中上部露出水面，再置于二氧化碳环境中一定温度和光照下处理的步骤；将海绵块切半取颜色加深的海绵块的步骤；将海绵块搅碎后，将海绵块与消毒海水混合置于细胞培养板中培养直至在细胞培养板中长出蓝藻藻落的步骤；将含有蓝藻藻落的消毒海水稀释，选取只有一个藻丝的微滴直至细胞培养板的每个孔中均有含一个藻丝的微滴的步骤；将细胞培养板进行暂养即得到产品的步骤，优点是能快速、大量分离共生蓝藻，并且培养效果好、操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及蓝藻的分离方法，尤其是涉及一种海绵共生蓝藻的分离培养方法。
背景技术
海绵是底栖生物群落中的重要成员，广泛分布于温带、亚热带、热带和极地地区，其丰度、多样性及分布规律在不同地区呈现多样化。海绵本身具有特定的功能，因而在海洋生态系统中有多种作用，还能提供大量新颖的生物活性物质。海绵所具有的独特而重要的生态作用、丰富的生物多样性、与微生物的共生关系等特征，能够作为新天然产物的资源，从而成为海洋生物的研究热点。例如专利公开号为CN1429203的发明专利“海绵动物抗肿瘤化合物”，就公开了分离自海绵动物的新抗肿瘤化合物。公开号为CN1336928的发明专利“由海绵分离的包括AsmarineA和B的细胞毒性生物碱衍生物”，就公开了从海绵Raspailia物种分离了新型细胞毒性生物碱AsmarineA和B，化合物的结构获得了NMR、X－射线的解析。类似的发明专利还有公开号为CN101519435的发明专利“西沙海绵中一种环九肽类化合物及其用途”、公开号为CN101519436的发明专利“西沙海绵中一种环八肽类化合物及其用途”、公开号为CN101519437的发明专利“西沙海绵中一种环七肽类化合物及其用途”、公开号为CN101519438的发明专利“西沙海绵中一种环肽类化合物及其用途”等。
蓝藻是一类能够进行光能自养的原核生物，有单细胞蓝藻和多细胞丝状蓝藻等类型。不同的蓝藻具有多系起源的特点，在系统发育树上的多种地位，奠定了蓝藻具有独特的生物多样性、生态环境适应性的基础。蓝藻作为海洋和陆地水体中初级生产力最重要的生产者，广泛分布于地球上各类生境中。海洋蓝藻在个体与分子水平上，具有在多个营养级影响海洋食物链动力学的有机物的多重效果。海洋蓝藻能够产生多种活性物质，具有不同的功能。许多甲壳动物对肝毒素(节球藻毒素)有抗性并能够少量食用，表明了蓝藻可能补充了食草类动物的食物；浮游动物食用蓝藻，肝毒素降低，在如此错综复杂的生态链中，蓝藻成为不可或缺的一环。
大量研究显示多种微生物能寄生在海绵体内，在微生物与其寄主海绵之间可能存在互惠等共生关系，这样的共生关系可能和多类生物活性物质的形成相关。中国发明专利名称为海绵共生微生物混合培养及可培养种群监测方法（公开号为CN1766081），公开了海绵共生微生物种群中的细菌种类的体外分离与培养。但是，目前国内外还没有公开任何关于通过快速分离的方法，获取海绵共生蓝藻，进而开展单种培养或纯培养的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、大量分离共生蓝藻，并且培养效果好、操作方便的海绵共生蓝藻的分离培养方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，具体包括以下步骤：
（1）海绵样品的筛选：从海洋中筛选颜色带有蓝绿或黄色的完整海绵样品；
（2）海绵样品的预处理：将筛选的海绵样品，浸泡在煮沸冷却后的消毒海水中，然后清除杂物并进行清洗，再将海绵样品切成0.5-1.5cm3大小的海绵块，将海绵块置于培养瓶中，同时将含有卡那霉素或新霉素的消毒海水加入到培养瓶中直至海绵块下半部分浸没在水中，上半部分露出水面，然后将培养瓶置于二氧化碳体积分数为0.035-0.065%的环境中，于25-32℃的高温胁迫条件下，采用150-250μmol/(m2·s)的光照强度，预处理24-48h；海绵块经预处理使其生长处于抑制状态，一般的微藻，如硅藻甲藻等，一旦脱离水就会迅速脱水而不能存活，而蓝藻具有一定的抗脱水功能，因此通过露出水面，实现微藻的分离；
（3）海绵样品选择：将预处理后的海绵块切成0.25-0.75cm3大小的海绵块，选取颜色较预处理前进一步加深的海绵块；
（4）海绵捣碎：将步骤（3）选取的海绵块置于食品粉碎机中，按1200-1500转/分的转速，捣碎2-4次，每次10-20秒；
（5）蓝藻培养：将步骤（4）捣碎后的海绵块与消毒海水按体积比1：3的比例混合后置于细胞培养板中，将细胞培养板置于培养箱中，于光照强度20-50μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，环境温度20-25℃的条件下培养10～15天，直至在细胞培养板中长出蓝藻藻落，挑取蓝藻藻落置于消毒海水中；显微镜镜检如图1所示，说明已成功挑出了蓝藻藻落，蓝藻生长情况良好；
（6）单藻落选取：将步骤（5）得到的含有蓝藻藻落的消毒海水稀释10－20倍后，采用微孔滴管滴在消毒的载玻片上，通过显微镜镜检选取只有一个藻丝的微滴，将只有一个藻丝的微滴冲洗到细胞培养板的一个孔中，重复通过显微镜镜检选取只有一个藻丝的微滴直至细胞培养板的每个孔中均有含一个藻丝的微滴；
（7）单种培养
将步骤（6）得到的细胞培养板置于光照强度20-50μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，水温20-25℃的条件下培养10～15天后，即得到海绵共生蓝藻单藻落。显微镜镜检如图2所示，说明分离得到纯的蓝藻藻丝。
所述的含有卡那霉素的消毒海水中卡那霉素的浓度为100-200mg／L，或者所述的含有新霉素的消毒海水中新霉素的浓度为100-200mg／L。
所述的消毒海水的pH值为8.5。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，该方法共生体的分离纯化操作简单、方便，不需其他辅助培养，得到单种共生蓝藻纯度高，并能够快速进入液体培养，得到藻液体，以便进行深入的培养和研究，效果理想。
附图说明
图1为本发明蓝藻藻落的显微镜镜检图；
图2为本发明海绵共生蓝藻单藻落的显微镜镜检图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，具体包括以下步骤：
（1）海绵样品的筛选：从海洋中筛选颜色带有蓝绿或黄色的完整海绵样品；
（2）海绵样品的预处理：将筛选的海绵样品，浸泡在煮沸冷却后的消毒海水中，然后清除杂物并进行清洗，再将海绵样品切成1cm3大小的海绵块，将海绵块置于培养瓶中，同时将含有卡那霉素或新霉素的消毒海水加入到培养瓶中直至海绵块下半部分浸没在水中，上半部分露出水面，然后将培养瓶置于二氧化碳体积分数为0.05%的环境中，于28℃的高温胁迫条件下，采用200μmol/(m2·s)的光照强度，预处理36h；
（3）海绵样品选择：将预处理后的海绵块切成0.5cm3大小的海绵块，选取颜色较预处理前进一步加深的海绵块；
（4）海绵捣碎：将步骤（3）选取的海绵块置于食品粉碎机中，按1350转/分的转速，捣碎3次，每次15秒；
（5）蓝藻培养：将步骤（4）捣碎后的海绵块与消毒海水按体积比1：3的比例混合后置于细胞培养板中，将细胞培养板置于培养箱中，于光照强度35μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，环境温度22.5℃的条件下培养12天，直至在细胞培养板中长出蓝藻藻落，挑取蓝藻藻落置于消毒海水中；
（6）单藻落选取：将步骤（5）得到的含有蓝藻藻落的消毒海水稀释15倍后，采用微孔滴管滴在消毒的载玻片上，通过显微镜镜检选取只有一个藻丝的微滴，将只有一个藻丝的微滴冲洗到细胞培养板的一个孔中，重复通过显微镜镜检选取只有一个藻丝的微滴直至细胞培养板的每个孔中均有含一个藻丝的微滴；
（7）单种培养
将步骤（6）得到的细胞培养板置于光照强度35μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，水温22.5℃的条件下培养12天后，即得到海绵共生蓝藻单藻落。
上述含有卡那霉素的消毒海水中卡那霉素的浓度为150mg／L，或者含有新霉素的消毒海水中新霉素的浓度为150mg／L，消毒海水的pH值为8.5。
实施例2
同上述实施例1，其区别在于：
步骤（2）中将海绵样品切成0.5cm3大小的海绵块；将培养瓶置于二氧化碳体积分数为0.035%的环境中，于25℃的高温胁迫条件下，采用150μmol/(m2·s)的光照强度，预处理48h；
步骤（3）中将预处理后的海绵块切成0.25cm3大小的海绵块；
步骤（4）中将海绵块置于食品粉碎机中，按1200转/分的转速，捣碎2次，每次20秒；
步骤（5）中将细胞培养板置于培养箱中，于光照强度20μmol/(m2·s)，环境温度20℃的条件下培养15天；
步骤（6）中将含有蓝藻藻落的消毒海水稀释10倍；
步骤（7）中将细胞培养板置于光照强度20μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，水温20℃的条件下培养15天。
上述含有卡那霉素的消毒海水中卡那霉素的浓度为100mg／L，或者含有新霉素的消毒海水中新霉素的浓度为100mg／L。
实施例3
同上述实施例1，其区别在于：
步骤（2）中将海绵样品切成1.5cm3大小的海绵块；将培养瓶置于二氧化碳体积分数为0.065%的环境中，于32℃的高温胁迫条件下，采用250μmol/(m2·s)的光照强度，预处理24h；
步骤（3）中将预处理后的海绵块切成0.75cm3大小的海绵块；
步骤（4）中将海绵块置于食品粉碎机中，按1500转/分的转速，捣碎4次，每次10秒；
步骤（5）中将细胞培养板置于培养箱中，于光照强度50μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，环境温度25℃的条件下培养10天；
步骤（6）中将含有蓝藻藻落的消毒海水稀释20倍；
步骤（7）中将细胞培养板置于光照强度50μmol/(m2·s)，水温25℃的条件下培养10天。
上述含有卡那霉素的消毒海水中卡那霉素的浓度为200mg／L，或者含有新霉素的消毒海水中新霉素的浓度为200mg／L。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (3)
1.一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）海绵样品的筛选：从海洋中筛选颜色带有蓝绿或黄色的完整海绵样品；
（2）海绵样品的预处理：将筛选的海绵样品，浸泡在煮沸冷却后的消毒海水中，然后清除杂物并进行清洗，再将海绵样品切成0.5-1.5cm3大小的海绵块，将海绵块置于培养瓶中，同时将含有卡那霉素或新霉素的消毒海水加入到培养瓶中直至海绵块下半部分浸没在水中，上半部分露出水面，然后将培养瓶置于二氧化碳体积分数为0.035-0.065%的环境中，于25-32℃的高温胁迫条件下，采用150-250μmol/(m2·s)的光照强度，预处理24-48h；
（3）海绵样品选择：将预处理后的海绵块切成0.25-0.75cm3大小的海绵块，选取颜色较预处理前进一步加深的海绵块；
（4）海绵捣碎：将步骤（3）选取的海绵块置于食品粉碎机中，按1200-1500转/分的转速，捣碎2-4次，每次10-20秒；
（5）蓝藻培养：将步骤（4）捣碎后的海绵块与消毒海水按体积比1：3的比例混合后置于细胞培养板中，将细胞培养板置于培养箱中，于光照强度20-50μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，环境温度20-25℃的条件下培养10～15天，直至在细胞培养板中长出蓝藻藻落，挑取蓝藻藻落置于消毒海水中；
（6）单藻落选取：将步骤（5）得到的含有蓝藻藻落的消毒海水稀释10－20倍后，采用微孔滴管滴在消毒的载玻片上，通过显微镜镜检选取只有一个藻丝的微滴，将只有一个藻丝的微滴冲洗到细胞培养板的一个孔中，重复通过显微镜镜检选取只有一个藻丝的微滴直至细胞培养板的每个孔中均有含一个藻丝的微滴；
（7）单种培养
将步骤（6）得到的细胞培养板置于光照强度20-50μmol/(m2·s)，光照周期12/12小时，水温20-25℃的条件下培养10～15天后，即得到海绵共生蓝藻单藻落。
2.根据权利要求1所述的一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，其特征在于：所述的含有卡那霉素的消毒海水中卡那霉素的浓度为100-200mg／L，或者所述的含有新霉素的消毒海水中新霉素的浓度为100-200mg／L。
3.根据权利要求2所述的一种海绵共生蓝藻的分离培养方法，其特征在于：所述的消毒海水的pH值为8.5。
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