CN103131656B

CN103131656B - 一株链霉菌yt027及其应用

Info

Publication number: CN103131656B
Application number: CN201310070871.6A
Authority: CN
Inventors: 赵延存; 李鹏霞; 黄开红; 王毓宁
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2013-03-06
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2033-03-06
Also published as: CN103131656A

Abstract

本发明提供了一种链霉菌（Streptomycessp.）菌株YT027，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏日期：2013年1月23日；保藏编号：CGMCC No.7196。本发明所述链霉菌YT027对芋疫霉（Phytophthora colocasiae Racib.）具有较高拮抗活性，其发酵培养液对贮藏期芋头疫病具有良好生防效果，可以避免或降低化学农药残留，显著延长芋头的贮藏期，保持芋头的品质，具有较好的经济和社会效益。

Description

一株链霉菌YT027及其应用

技术领域

本发明属于农产品贮藏保鲜技术领域，具体地，涉及一种链霉菌菌株YT027及其应用，专用于贮藏期芋头疫病的无公害生物防治。

背景技术

芋头疫病是由芋疫霉（Phytophthora colocasiae Racib.）引起的芋头真菌病害。虽然芋头疫病是芋头栽培期的主要病害之一，但是芋头采收时产生大量伤口，并且贮藏早期的环境湿度较大，呼吸旺盛，温度较高，芋头表面粘附的芋疫霉病原菌及其孢子容易侵染发病，造成贮藏期芋头的变质和腐烂。特别是其与细菌性软腐病混合发作，危害更大。

贮藏期芋头疫病的有效防治是延长芋头贮藏期，保持其品质，提高其商品价值的一个重要方面。目前，主要利用登记于田间的化学农药来防治贮藏期病害，可供选择的贮藏期专用农药还不多见。近年来，随着人们对食品安全和环境质量要求的日益提高，化学农药在采后农产品上的应用被严格限制或禁止，这就促使科研工作者寻求更加安全的采后农产品贮藏保鲜技术。基于微生物的生物防控技术被认为是未来农产品贮藏保鲜技术的发展方向之一，例如链霉菌（Streptomyces species）、芽孢杆菌（Bacillus species）和酵母。

链霉菌（Streptomyces species）属于高等放线菌，广泛分布于各类土壤中，有发育良好的分枝菌丝。目前医药和农业生产上应用的抗生素90%由本属菌产生，例如链霉素、井冈霉素、四环素、新霉素等。大量研究报道表明，链霉菌的次生代谢产物对多种植物病原真菌具有潜在的拮抗活性，能够显著抑制病原菌的生长，甚至杀死病原菌，从而延缓或阻止病害的发生。从芋头生长或贮藏的环境中筛选对芋疫霉等病原真菌具有良好生防效果的生防菌，将该生防菌发酵液或发酵次生代谢产物应用于贮藏期芋头疫病的生物防治，将能够避免或降低化学农药的危害，延长芋头的货架供应期，维持其品质，提高其商品价值，促进芋头种植业的发展和商业化流通。但是目前还未见到关于利用链霉菌防治芋头疫病，包括贮藏期芋头疫病的报告。

发明内容

本发明的目的在于提供一种链霉菌（Streptomyces sp.）YT027及其对贮藏期芋头疫病生物防控的应用。

本发明提供的菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）菌株，是从贮藏期芋头表面分离获得，采用菌体形态观察、菌落形态观察和16S rRNA序列测定相结合的方法，将该菌株鉴定为链霉菌（Streptomyces sp.），并将其命名为YT027。该菌株已于2013年1月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为Streptomyces sp.，菌种保藏编号为CGMCC No. 7196。

链霉菌菌株YT027在2YT固体培养基平板上，30℃条件下培养36 h后的菌落特征是：单菌落为乳黄色或略呈浅淡黄色，圆形，直径1.0 mm ~ 2 mm，表面干燥，边缘完整，连成片的菌落表面皱褶，菌落背面呈米黄色。其菌体细胞形态为：菌丝纤细，分枝。所使用的2YT固体培养基成分为：胰蛋白胨 17 g，酵母浸膏10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20 min。

本发明提供了所述链霉菌YT027的发酵产物。

本发明提供了一种链霉菌YT027或其发酵产物在防治贮藏期芋头疫病中的应用。

本发明提供了一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤:

1) 活化培养：取本发明链霉菌菌株YT027的菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在25-32℃条件下活化培养24-36 h;

2) 种子液制备：利用灭菌牙签挑取一个单菌落接种到一个含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，25-32℃下振荡培养36-48 h，振荡频率为100-200 r/min；

3) 生防菌液的制备：将步骤2）所得的种子液以1-10%（v/v）的比列接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25-32℃，培养基的初始pH为6.3-7.5，以通气比0.2:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75-180 r/min，发酵时间为24-48 h。其中通气比：指每分钟通过发酵液的空气体积与发酵液体积之比。

该链霉菌YT027对碳源和氮源无特殊要求，可选用培养微生物的常用碳源和氮源，其中步骤3）中所述的发酵培养基中，碳源为可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖或废糖浆等，氮源为豆粕粉、酵母膏或蛋白胨等；所述发酵培养基还需添加NaCl 0.5-2 g/L、KH₂PO₄ 0.5-1.0 g /L、MgSO₄·7H₂O 0.25-1.0 g/L和痕量元素。

所述痕量元素为FeSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg/L，MnSO₄ 5 mg/L。

本发明提供了上述方法制备的生防菌剂。

本发明提供了上述生防菌剂在防治贮藏期芋头疫病中的应用。

本发明还提供了所述生防菌剂在防治贮藏期芋头疫病中的应用方法：将生防菌液稀释1-5倍，利用喷洒或浸泡方式处理采后芋头，晾干后按照常规方法进行贮藏。

本发明提供的链霉菌菌株YT027是一种新发现的链霉菌生防资源，对芋疫霉病原菌具有较高的拮抗活性。利用本发明菌株制备的发酵液对贮藏期芋头进行处理，贮藏四十天后的芋头疫病发病率从清水对照的53.7%降低到6.7%，对芋头疫病的生防效果显著，显著延长了芋头的贮藏期，保持了芋头的品质，增加了芋头的商品价值。

附图说明

图1 为链霉菌YT027对芋疫霉的平板拮抗活性;

图2 为链霉菌YT027在2YT培养基上的菌落形态；

图3 为链霉菌YT027在显微镜下的菌体形态（1000×）；

图4 为基于链霉菌YT027的16S rRNA序列进化树；

图5 为链霉菌YT027发酵液对贮藏期芋头疫病的生防效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

本发明所涉及的链霉菌（Streptomyces sp.）YT027，已于2013年1月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为Streptomyces sp.，保藏编号为CGMCC No. 7196。本发明所用的芋疫霉病原菌（Phytophthora colocasiae Racib.）是本研究室从贮藏期发病芋头上分离、鉴定获得，其他单位或个人可以向本研究室索取。

以下实施例用于说明本发明，但并不限定于本发明。若无特别说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法；若无特别说明，下述实施例中所用实验材料，均为常规化学试剂和生化试剂。

以下所述的2YT培养基为：胰蛋白胨 17 g，酵母浸膏10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20 min。

PDA固体培养基为：去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水定容至1000 mL，琼脂 17 g，121℃条件下灭菌20 min。

实施例1 链霉菌YT027的分离与鉴定

1）待筛选菌种资源的分离：刮取健康芋头表面的粘附土壤100 g，混合均匀，取10 g土壤倒入含有20粒细玻璃珠和100 mL灭菌去离子水的250 mL锥形瓶中，置于摇床上150 r/min、30℃条件下震荡培养6 h。静置10 min，取上清1 mL，利用灭菌去离子水10倍梯度稀释，吸取100 μL每个浓度梯度稀释液凃2YT固体平板，30℃条件下静置培养36 h。利用接种环挑取单菌落在2YT固体培养基上划线纯化2次，将纯化的不同形态单菌落编号转接到2YT固体平板上，30℃条件下静置培养36 h，保存于4℃。

2）YT027的平板拮抗筛选：将保存于2YT固体平板上纯化的各菌株在2YT液体培养基中培养，培养条件为150 r/min、30℃、36 h。另外，将芋疫霉菌丝块接种到PDA固体培养基平板的中央，28℃条件下培养60 h，在距离菌丝块中心约3 cm的位置利用灭菌打孔器打孔，孔直径为4 mm，每个平板均匀打6个孔。将40 μL培养好的待测定分离纯化菌液滴加到孔内，在28℃条件下对峙培养48 h，通过抑菌带宽度评估待测定菌株对芋疫霉的拮抗活性。结果发现YT027菌株对芋疫霉具有显著的拮抗活性，如图1所示。

3）YT027的形态观察：将YT027在2YT固体平板上划线培养，培养条件为30℃、36 h，单菌落为乳黄色或略呈浅淡黄色，圆形，直径1.0 mm ~ 2 mm，表面干燥，边缘完整，连成片的菌落表面皱褶，如图2A所示；菌落背面呈米黄色，如图2B所示。挑取菌落，利用结晶紫染色，在油镜下观测菌体形态（1000×），发现菌体呈分枝状细丝，如图3所示。根据菌落形态和菌体形态，初步判定该菌株属于放线菌。

4）YT027的分子鉴定：利用灭菌牙签挑取YT027单菌落于含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，150 r/min、30℃条件下培养36 h，利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取YT027的基因组DNA。利用细菌16S rRNA通用引物fd2 (5'-AGAGTTTGATCAT GGCTCAG-3')和rp1 (5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3') PCR扩增DNA片段，将PCR产物送上海英俊公司测序。基于获得的16S rRNA序列和GenBank数据库，利用ClustalX 1.83 软件和MEGA 5.05软件对YT027进行进化树分析，确定该菌株属于链霉菌（Streptomyces sp.）如图4所示。

实施例2 利用链霉菌YT027制备生防菌剂的方法

取本发明链霉菌菌株YT027的菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在25℃条件下活化培养36 h；利用灭菌牙签挑取YT027单菌落于含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，在振荡频率为150 r/min、30℃条件下培养36 h，作为种子液；将种子液以1%（v/v）的比例接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为30℃，以通气比0.2:1进行发酵通气，搅拌速度为120 r/min，培养36 h。

所述的发酵培养基为：可溶性淀粉10 g，豆粕粉15 g，NaCl 0.5 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，ZnSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，CuSO₄ ·5H₂O 0.16 mg，MnSO₄ 5 mg，蒸馏水定容至1000 mL，pH 6.3，121℃条件下灭菌20 min。

实施例3 利用链霉菌YT027制备生防菌剂的方法

取本发明链霉菌菌株YT027的菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在32℃条件下活化培养24 h；利用灭菌牙签挑取YT027单菌落于含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，在振荡频率为100 r/min、25℃条件下培养48 h，作为种子液；将种子液以10%（v/v）的比例接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25℃，以通气比2.5:1进行发酵通气，搅拌速度为75r/min，培养48 h。

所述的发酵培养基为：葡萄糖 5 g，酵母膏10 g，NaCl 2 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄ ·7H₂O 1 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，ZnSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，CuSO₄ ·5H₂O 0.16 mg，MnSO₄ 5 mg，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.5，121℃条件下灭菌20 min。

实施例4 利用链霉菌YT027制备生防菌剂的方法

取本发明链霉菌菌株YT027的菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在30℃条件下活化培养30 h；利用灭菌牙签挑取YT027单菌落于含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，在振荡频率为200 r/min、32℃条件下培养42 h，作为种子液；将种子液以5%（v/v）的比例接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为32℃，以通气比1.0:1进行发酵通气，搅拌速度为180r/min，培养36 h。

所述的发酵培养基为：蔗糖10 g，蛋白胨15 g，NaCl 1 g，KH₂PO₄ 0.8g，MgSO₄ ·7H₂O 0.8 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，ZnSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，CuSO₄ ·5H₂O 0.16 mg，MnSO₄ 5 mg，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0，121℃条件下灭菌20 min。

实施例5 利用链霉菌YT027制备生防菌剂的方法

取本发明链霉菌菌株YT027的菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在30℃条件下活化培养30 h；利用灭菌牙签挑取YT027单菌落于含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，在振荡频率为200 r/min、32℃条件下培养42 h，作为种子液；将种子液以2%（v/v）的比例接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为30℃，以通气比1.0:1进行发酵通气，搅拌速度为150 r/min，培养42 h。

所述的发酵培养基为：废糖浆10 g，豆粕粉12 g，NaCl 1 g，KH₂PO₄ 0.5 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，ZnSO₄ ·7H₂O 0.16 mg，CuSO₄ ·5H₂O 0.16 mg，MnSO₄ 5 mg，蒸馏水定容至1000 mL，pH为7.2，121℃条件下灭菌20 min。

实施例6 链霉菌YT027的应用

利用实施例2-5所得到的YT027发酵培养液，取适量发酵液用灭菌水稀释5倍，将采收的芋头分别在100%浓度发酵液和20%浓度发酵液中侵泡1-3 min，捞出晾干。晾干后喷雾接种芋头疫霉孢子悬浮液，然后按照常规方法进行贮藏。分别于处理后30 d、40 d调查芋头疫病的发病率。结果发现贮藏40 d后的芋头疫病发病率分别从清水对照的53.7%降低到100%浓度发酵液处理的6.7%和20%浓度发酵液处理的12.0%，对芋头疫病的生防效果显著，如图5所示。

根据实施例1和实施例6的结果，本发明所述的链霉菌（Streptomyces sp.）YT027 （CGMCC No. 7196）经过发酵培养，其发酵液对芋疫霉（Phytophthora colocasiae Racib.）的生长具有显著抑制作用，对贮藏期芋头疫病有较好的生物防治效果，可以作为一种针对贮藏期芋头疫病的新型生物防治资源或生防菌剂。

Claims

1.一株链霉菌（Streptomyces sp.）菌株YT027，其保藏编号为CGMCC No. 7196。

2.一种利用权利要求1所述链霉菌YT027制备生防菌剂的方法，包括以下步骤:

1）活化培养：取本发明链霉菌菌株YT027的菌种，划线接种至新鲜2YT固体平板上，在25-32℃条件下活化培养24-36 h;

2）种子液制备：利用灭菌牙签挑取一个单菌落接种到一个含有50 mL 2YT液体培养基的250 mL锥形瓶中，25-32℃下振荡培养36-48 h，振荡频率100-200 r/min；

3）生防菌液的制备：将步骤2）所得的种子液以1-10%（v/v）的比列接种于发酵培养基中进行发酵，发酵温度为25-32℃，培养基的初始pH为6.3-7.5，以通气比0.2:1到2.5:1之间进行发酵通气，搅拌速度为75-180 r/min，发酵时间为24-48 h；

其中：步骤3）中所述的发酵培养基中，碳源为可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖或废糖浆；氮源为豆粕粉、酵母膏或蛋白胨；所述发酵培养基还需添加NaCl 0.5-2 g/L、KH₂PO₄ 0.5-1.0 g /L、MgSO₄·7H₂O 0.25-1.0 g/L和痕量元素。

3.根据权利要求2所述链霉菌YT027制备生防菌剂的方法，其特征在于，所述痕量元素为FeSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.16 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg/L，MnSO₄ 5 mg/L。

4.权利要求2或3所述的方法制备得到的生防菌剂。

5.权利要求4所述的生防菌剂在防治贮藏期芋头疫病中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于，将生防菌液稀释1-5倍，利用喷洒或浸泡方式处理采后芋头，晾干后进行贮藏。