CN102517231B

CN102517231B - 锰氧化微生物的分离、筛选方法

Info

Publication number: CN102517231B
Application number: CN 201110418370
Authority: CN
Inventors: 王万能
Original assignee: Chongqing University of Technology
Current assignee: Chongqing University of Technology
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: CN102517231A

Abstract

本发明公开了一种锰氧化微生物的分离、筛选的方法，有以下步骤：取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均匀涂布在固态PYCM培养基平板上；25～28℃恒温下培养1～2天，挑取单菌落划线纯化，固体PYCM培养基25～28℃培养，得到锰氧化微生物待选菌株，在温度为4℃条件下保藏；所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，光通量为630Lm，摇床转速为150-230r/min，温度为25-30℃，培养2-4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物。该方法可以将土壤中的锰离子如Mn(II)，通过生物氧化降低锰离子的含量，利于降低锰如Mn(II)在土壤中的环境污染。

Description

锰氧化微生物的分离、筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种锰的氧化微生物的筛选方法。

背景技术

金属作为一种重要的材料在现代工业和日常生活中占据了极为重要的地位，但是也正是因为金属的广泛使用造成了现在日趋严重的水体和土壤的重金属污染。重金属污染的治理已经刻不容缓。以锰为例，它不仅在现代工业领域扮演着极其重要的角色，而且也是一种维持机体正常代谢的重要微量元素。在工业上，锰矿石广泛应用于冶金、化工、玻璃、陶瓷等产业中。但锰元素作为一种重金属元素，过多得摄入会严重危害机体的健康，我国生活饮用水卫生标准规定锰含量不超过0.1mg/L，国家最低排放标准为2mg/L。我国很多地区(尤其是锰矿石开采和锰矿石加工周边地区)至今仍无法严格达到这一国家标准，亟待采取合理的方法来治理水土中的锰污染。

本发明以锰金属污染为出发点，就转化可溶性有毒的Mn(II)为不溶性无毒的Mn(III)和Mn(IV)过程中氧化微生物发挥的重要作用为契机，研究了氧化微生物的分离和鉴别的方法。

发明内容

本发明的目的，是提供一种锰的氧化微生物的筛选和分离方法，该方法可以将土壤中的重金属锰离子如Mn(II)，通过生物氧化降低土壤中的重金属锰离子的含量，利于降低重金属锰如Mn(II)在土壤中的环境污染。

本发明的目的是这样实现的：

锰氧化微生物的分离、筛选的方法有以下步骤：

1)取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均匀涂布在固体PYCM培养基平板上；

2)在25～28℃恒温下培养1～2天，挑取单菌落划线纯化，在固体PYCM培养基中25～28℃培养，得到锰氧化微生物待选菌株，在温度为4℃条件下保藏；

3)步骤3)所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，光通量为630Lm，摇床转速为150-230r/min，温度为25-30℃，培养2-4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物。

培养基中将锰离子浓度降低的为锰氧化微生物，其中将锰离子浓度降得最低的为锰氧化微生物优势菌株。

步骤3)所述摇床转速较好的为200r/min.

步骤3)所述温度较好的为30℃。

所述固体PYCM培养基的成分和组成为：蛋白胨0.8g；酵母膏0.2g；MnSO₄·H₂O 0.2g；K₂HPO₄ 0.1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；NaNO₃ 0.2g；CaCl₂ 0.1g；NH₄HCO₃ 0.1g；加水1000mL，调pH值为6.8～7.2，固体培养基则加琼脂1.8％。

所述液体PYCM培养基的成分和组成为：蛋白胨0.8g；酵母膏0.2g；MnSO₄·H₂O 0.2g；K₂HPO₄ 0.1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；NaNO₃ 0.2g；CaCl₂ 0.1g；NH₄HCO₃ 0.1g；加水1000mL，调pH值为6.8～7.2。

本发明方法有以下优点：

(1)分离自锰矿区软锰矿石表面的细菌群体中的细菌，可以将Mn(II)氧化为更高价态的Mn(III)和Mn(IV)。

(2)锰矿区软锰矿石表面的细菌群体中的细菌在正常状态下其锰氧化能力较强。

本发明所述方法可以将土壤中的重金属锰离子如Mn(II)，通过生物氧化降低土壤中的重金属锰离子的含量，使土壤中锰离子浓度降低65％，采用本发明方法可以降低能重金属锰如Mn(II)在土壤中的环境污染。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不仅限于这些例子。

附图说明

图1为I型和II型锰氧化微生物菌种，其中，a为I型锰氧化微生物菌种，b为II型锰氧化微生物菌种；

图2为锰标准曲线图。

具体实施方式

一.试剂和仪器

1.菌种来源

本实验使用的锰氧化菌种来自于重庆市秀山县(孝溪乡细沙村，是否需要具体地址)锰矿地区软锰矿石的表面。

2.实验用培养基

PYCM培养基^[12]：蛋白胨0.8g；酵母膏0.2g；MnSO₄·H₂O 0.2g；K₂HPO₄ 0.1g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；NaNO₃ 0.2g；CaCl₂ 0.1g；NH₄HCO₃ 0.1g；加水1000mL，调pH值为6.8～7.2，固体培养基则加琼脂1.8％，湿热灭菌后使用。

该培养基既可用于培养细菌菌株也用于菌种保藏。

本发明所用试剂均采用市售的化学纯产品。

3.分析测试方法

(1)菌体形态观察：简单染色法和革兰氏染色法、光学显微镜

(2)Mn²⁺离子浓度的测定方法：甲醛肟分光光度法

(3)细菌生长测定方法：分光光度法

4实验仪器及设备

(1)DHZ-O32R型摇床

(2)TCYQ DDHZ-300型摇床

(3)TG16-W微量高速离心机

(4)WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计

(5)普通电冰箱

(6)LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器

(7)DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱

(8)数字生物显微镜(最大放大倍数1000倍)

(9)DNP-9162型电热恒温培养箱

(10)AL204型电子天平

(11)SHZ-D(III)循环水式真空泵

(12)SW-CJ-1F型洁净工作台

二.锰氧化微生物待选菌株的分离纯化和保藏

1.刮取软锰矿石表面物质(取自重庆市秀山县孝溪乡细沙村锰矿地区的软锰矿石)，加入去离子水后搅拌即成原菌液。再在洁净工作台上用涂布法将菌液均匀涂布在平板培养基表面，取用3个平板，每个平板涂布不同的菌液量，以此代替梯度稀释。之后便可将其放置于恒温培养箱内保持28℃培养1～2天。

2.纯化。

经过2-3天的培养，分离用培养皿中会长出多种形态的菌落，用接种针挑出其中的一种特定的菌株并将其划线培养在另一空白PYCM培养皿上，严格操作，选取明显无污染菌落，为防止失败每种菌要有重复，以要保证每一个培养皿中都只含有一种菌株。操作完成后将这些培养皿放置于恒温培养箱内保持28℃培养。

3.菌种保藏。

将纯化培养基中已经长出的菌株用接种针挑出，划线培养于PYCM斜面试管中(恒温培养箱，28℃)。待斜面试管中长出菌落后便将这批试管转入4℃冰箱中保藏。

4染色。

(1)涂片

取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴无菌水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体(无菌操作)与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。

(2)干燥

涂布后，待其自然干燥。

(3)固定

将已干燥的涂片标本向上，在微火上通过3至4次进行固定。固定的作用为：杀死细菌；使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。

(4)染色

在涂片处滴加草酸铵结晶紫溶液1至2滴，使其布满涂菌部分，染色1min。

(5)冲洗

斜置载片，倾去染液。用水轻轻冲去染液，至流水变清。

(6)吸干

用吸水纸轻轻吸去载片上的水分，干燥后镜检。

(7)镜检

将染色的标本，先用低倍镜找到目的物，将低倍镜转开，滴加一小滴液体石蜡于涂片处，用油镜进行观察。

5革兰氏染色

(1)制片

取活跃生长期菌种按常规方法涂片(不宜过厚)、干燥和固定。

(2)初染

滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1至2min后倾去染液，水洗至流出水无色。

(3)媒染

先用革氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。

(4)脱色

将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95％乙醇脱色(一般20至30s)，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。

(5)复染

将玻片上残留水用吸水纸吸去，用蕃红复染液染色2min，水洗，吸去残水晾干。

(6)镜检

油镜观察。

通过上述方法分离出I型和II型两种不同的锰氧化微生物菌种(参见图1)，这两种菌种的特征如下表：

表1初筛菌落形态特征

	I型菌落	II型菌落
			外形	圆形	圆形
大小	较小	较大
			厚度	较厚	较厚
颜色	乳白	乳白
			数量	较多	较少
质地	均匀	均匀
			边缘	圆整	波状
湿润程度	湿润	较干燥
			透明程度	不透明	不透明
革兰氏染色	G-	G+

两种锰氧化微生物菌种，分别编号为Mn-O-1至Mn-O-16，其中1，2，4，5，6，11，12保藏I型菌落里的菌株，3，7，8，9，10，13，14，15，16保藏II型菌落里的菌株。

三.锰离子浓度的检测

1.锰标准溶液的制备

制备锰浓度为1g/L的锰标准溶液：准确称取0.7684g MnSO₄·H₂O，用去离子水溶解后转移至250mL容量瓶中定容摇匀备用。

2.建立锰的标准曲线

利用已知浓度的锰标准溶液和锰测定方法，即可建立锰离子浓度与利用甲醛肟测定方法测得的OD值之间的关系曲线(如表3和图2所示)。

表3锰离子浓度与OD值之间的关系

四.锰氧化微生物优势菌株筛选

将培养所得的菌种，在原培养基的基础之上再添加MnSO₄·H₂O使得培养基锰离子浓度约为0.4～0.6g/L，使用50mL小锥形瓶盛装25mL液体培养基，60W白炽灯光照(光通量为630Lm)，摇床转速为200r/min，温度为30℃，培养大约2-4天。

培养后在不同时间内对培养基中锰的含量进行测定。其的方法是，首先将这些培养基转移至洁净工作台中，充分混匀后利用量程为100至1000微升的移液枪吸取一定量菌液用作检测菌液使用(通常取1至2毫升即可)。将培养基放回摇床内，取出的微量菌液可先在600nm波长下测定OD值(如有需要)，再用移液枪均匀取样1.4mL至微量离心管(容量1.5mL)中，使用微量高速离心机以8000r/min的转速离心5min，离心完毕取上清液1mL通过甲醛肟分光光度法检测锰离子含量(即浓度稀释1倍)。具体结果如表2所示。并由此分离出对锰离子氧化比较强的优势菌种。

表2

结果：Mn-O-2和Mn-O-7菌株作为除锰优势菌种。原因为：①这两个菌株在整个实验过程中一直在氧化锰离子，培养基中的锰离子含量只降不升。②这两个菌株在锰氧化过程锰离子浓度最低，分别为0.079g/L和0.084g/L。

Mn-O-2和Mn-O-7的混合体系具有更好的锰氧化效果，最大锰氧化率为71.7％。

经过筛选实验数据，我们选择了Mn-O-2和Mn-O-7菌株作为锰氧化优势菌种。

五.菌株氧化锰离子的测定

筛选菌株对锰离子的氧化作用

取菌株Mn-O-2，在原培养基的基础之上再添加了一定量的MnSO₄·H₂O使得培养基锰离子浓度约为0.4～0.6g/L，按照微生物培养与锰检测方案进行实验所得的结果如表4所示。

表4

时间	培养基锰离子OD值	锰离子浓度(g/L)
			4.22 10:10	0.313	0.508
4.22 13:00	0.232	0.315
			4.22 20:20	0.247	0.351
4.23 08:45	0.213	0.270
			4.23 13:30	0.242	0.339
4.23 14:50	0.153	0.127
			4.23 16:20	0.209	0.260
4.23 18:45	0.258	0.377
			4.23 20:00	0.257	0.374
4.23 21:15	0.279	0.427
			4.24 12:20	0.246	0.348

由此所的锰氧化微生物的优势菌种，以上述锰离子标准曲线方程计算，菌种Mn-O-2的锰离子浓度降幅分别达到65％，说明筛选到的锰氧化微生物的氧化能力很强。

Claims

1.一种锰氧化微生物的分离、筛选的方法，其特征在于有以下步骤：

1）取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均匀涂布在固体PYCM培养基平板上；

2）在25～28℃恒温下培养1～2天，挑取单菌落划线纯化，在固体PYCM培养基中25～28℃培养，得到锰氧化微生物待选菌株，在温度为4℃条件下保藏；

3）步骤2）所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基添加MnSO₄·H₂O使锰离子的浓度为0.4～0.6g/L，光通量为630Lm，摇床转速为150-230r/min，温度为30℃条件下，培养2-4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物。

2.根据权利要求1所述的锰氧化微生物的分离、筛选的方法，其特征在于：培养液中将锰离子浓度降低的为锰氧化微生物，其中锰离子浓度降得最低的为锰氧化微生物优势菌株。

3.根据权利要求1所述的锰氧化微生物的分离、筛选的方法，其特征在于：步骤3）所述摇床转速为200r/min。