CN102268373B

CN102268373B - 一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法

Info

Publication number: CN102268373B
Application number: CN 201110199597
Authority: CN
Inventors: 纪树兰; 周明璟; 崔丹红; 秦振平
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2011-07-17
Filing date: 2011-07-17
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2031-07-17
Also published as: CN102268373A

Abstract

一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法属于污水处理除磷技术领域。本发明涉及一种在强化生物除磷系统中快速筛选出高效聚磷菌的方法。强化生物除磷技术是污水处理中重要的除磷技术，聚磷菌在其中起到主要的去除作用。而目前的菌种分离方法效果差、有效菌种数量少。本发明应用影印的方法，配合不同的培养基，使菌落在厌氧、好氧交替的培养条件中传代，在传代过程中应用苏丹黑和甲苯胺蓝染色观察，并对其进行蓝白斑筛选，挑取蓝斑菌株为高效除磷菌株。这样可以解决由于培养基及培养条件造成的工艺繁琐、筛选缓慢、针对性差的问题，能够快速的在活性污泥中筛选出高效聚磷菌。

Description

一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法

技术领域

本发明涉及一种在强化生物除磷系统中快速筛选出高效聚磷菌的方法。

背景技术

强化生物除磷技术是污水处理中重要的除磷技术。如果水体中的磷含量超标，会造成水体中的藻类大量繁殖并形成水华，使水体状况恶化。所以如何减少对环境水体中磷的排放，是防止水体富营养化的一项重要措施。强化生物除磷技术就是应用污泥中的微生物在特定的培养条件下超量吸收水体中的磷元素，然后通过排放剩余污泥来降低水中磷的含量。由此可见，强化生物除磷系统中微生物的种类和数量直接影响到系统对磷的去除效果。序列间歇式活性污泥法(SBR)是污水处理中典型的高效除磷工艺，其活性污泥中有大量的聚磷菌。从中筛选出高效的聚磷菌，并制成微生物菌剂，对提高污水处理系统中磷的去除效率有重要意义。同时，筛选出的聚磷菌可以作为基因工程菌的载体，通过基因改造达到更好的去除污染物的效果。

目前对聚磷菌的分离主要还是常规的分离方法，主要是应用肉汤等培养基，在培养皿中进行涂布或者划线分离，这种分离方法得到的聚磷菌占总分离菌的比例低，实验样品的处理量大，分离过程没有针对性。另一方面，在进行培养皿分离之前，一般还要进行聚磷菌的富集培养过程。富集培养过程一般指：在好氧培养条件下，应用富磷培养基；在厌氧条件下，应用限磷培养基；在两种培养条件交替进行的情况下，使得聚磷菌成为培养液中的优势菌，然后进行涂布或者划线分离。这样的培养过程虽然可以得到聚磷菌，但是在培养过程中，样品中部分聚磷菌的生长会由于其它细菌产生的代谢物而受到抑制，造成部分聚磷菌分离不成功。所以为了快速得到高效聚磷菌，有必要对分离方法进行改造。

发明内容

本发明的目的是针对现有聚磷菌筛选过程缓慢，筛选菌株目的性差的问题，进而提供一种更为有效、快速、针对性强的聚磷菌筛选方法及合适的培养基配方。应用本方法筛选出的聚磷菌，具有生长快速、摄磷能力强等特点，适合用于反投加或者进一步的分子生物学改造。

本发明方法的技术路线是：以SBR好氧曝气结束时的活性污泥为样品，经过稀释后涂布到含有厌氧培养基的培养皿上进行恒温厌氧培养，待菌落长好后，通过影印或者接种针挑取的方法，接种到含有好氧固体培养基培养皿上进行恒温好氧培养，待菌落长好后再次影印或者挑取到含有厌氧固体培养基的培养皿上进行恒温厌氧培养，如此反复接种数次，最后接种到含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)的培养皿培养基上培养，挑取颜色为蓝色的菌落作为高效聚磷菌菌株。

一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法，其具体工艺步骤如下：

(1)配制筛选用培养基。

筛选培养基包括好氧固体培养基和厌氧固体培养基两种，其组成分别为：每升好氧固体培养基包含0.1～0.3g的NaAC，4～6g的牛肉膏，8～12g的胰蛋白胨，4～6g的NaCl，0.15～0.2g的KH₂PO₄，15～18g的琼脂粉，1～2ml微量元素溶液，其余水，调节pH至6.8～7.2；每升厌氧固体培养基包含1～3g的NaAC，4～6g的牛肉膏，8～12g的胰蛋白胨，4～6g的NaCl，15～18g的琼脂粉，1～2ml微量元素溶液，其余水，调节pH至6.8～7.2。菌种保藏培养基为固体LB培养，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏(购自北京奥博星生物技术有限责任公司)，10g的NaCl，15g的琼脂，其余为水，调节pH至7.2。以上培养基均需121℃蒸汽灭菌25分钟。好氧固体培养基和厌氧固体培养基分别在冷却到48～55℃倾倒培养皿，冷却待用。保藏培养基摆放成斜面冷却待用。BCIP溶液含量为：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。

所述步骤(1)中的微量元素溶液组成为：每升水中包含0.4～0.5g的EDTA，0.05～0.06g的CaCl₂，0.049～0.051g的FeSO₄·7H₂O，0.015～0.016g的CuSO₄·5H₂O，0.016～0.0163g的CoCl₂·6H₂O，0.021～0.023g的ZnSO₄·7H₂O，0.05～0.053g的MnCl₂·4H₂O，0.01～0.012g的(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O。

(2)取样稀释。

应用灭菌的锥形瓶取SBR系统中好氧状态培养的活性污泥50ml，加入无菌玻璃珠，摇动打碎污泥。然后用带有无菌纱布的漏斗过滤处理好的污泥，收集滤液。用无菌生理盐水稀释滤液，分别制成稀释度为10^-2、10^-3、10^-4的稀释液。

(3)涂布。

用移液枪分别移取150～200μl的10^-3和10^-4稀释液到厌氧固体培养皿中，用涂布器进行涂布。然后置于无氧环境中恒温28～38℃培养10～15小时。

(4)筛选。

待厌氧固体培养皿培养结束后，选择菌落个数在30～50个的培养皿作为母板，通过影印板或者接种针挑取到好氧固体培养皿上。恒温28～38℃培养10～15小时。待好氧固体培养皿培养结束后，应用影印板或者接种针挑取到厌氧固体培养皿上厌氧培养。如此操作循环4～6次。在筛选操作中可以对传代后剩余在培养皿上的菌落进行染色观察：挑取在好养培养状态下的菌落进行甲苯胺蓝染色，观察菌体内聚磷酸盐形成的异染色粒；挑取在厌氧培养状态下的菌落进行苏丹黑染色，观察菌体内的PHAs颗粒。

(5)显色观察。

在厌氧或好氧固体培养皿上，用移液枪在琼脂表面加上40～60μl的BCIP溶液，用涂布器涂匀，静置0.5～1小时吸收。通过影印或者接种针挑取的方法把(4)中的菌落接种到含BCIP的培养皿上。28～38℃恒温培养10～15小时后，培养皿上会出现蓝白菌落，其中蓝色菌落为聚磷能力强的菌种。

(6)菌种保藏。

挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，28～38℃恒温培养。10～15小时后0～4℃冷藏留种。

(7)除磷能力考查。

考察培养基组成为：每升考察培养基包含4.5～5.0g NaAC，0.3～0.5gNH₄Cl，0.15～0.25g牛肉膏，0.3～0.5g胰蛋白胨，0.07～0.1g磷酸二氢钾，1～2ml微量元素溶液，其余为水，调节pH至6.8～7.2。在250ml锥形瓶中加入100ml考察培养基，用透气封口膜包好后灭菌。将得到的菌种分别接入到锥形瓶中，恒温振荡培养12～14小时，使得培养基内达到一定的菌量。然后停止震荡，静瓶培养1.5～2小时，细菌在这一阶段吸收小分子酸，释放磷。再次开启振荡好氧培养4～6小时，细菌吸收磷。最后将得到的菌液一部分测量OD₆₀₀值，一部分离心，收集上清液，检测其中的磷含量并计算除磷率。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。

所述步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)中的操作均在无菌超净工作台中进行。

所述步骤(2)中的生理盐水为浓度0.85％的氯化钠溶液，121℃灭菌25分钟。

所述步骤(3)中的无氧环境包括：a、厌氧培养箱；b、通入氮气的真空干燥器；c、加入焦性没食子酸和氢氧化钠溶液的密闭容器。

所述步骤(7)中测量菌液的OD₆₀₀指：应用可见光分光光度计，以稀释3～5倍的空白培养基为参比，在波长600nm下，测量菌液的吸光度。

所述步骤(7)中的离心指：在转速4000～6000转/分的条件下，离心15～20分钟。

通过以上筛选方法，充分利用聚磷菌在好氧吸磷、厌氧释磷的生理特性，使得筛分更有效率；并且在分离之前把菌落隔离开，可以有效避免菌种之间的竞争干扰；同时可以实时对要分离的菌株进行观察，确定其生理状态，从而挑选出高效聚磷菌菌株。

具体实施方式

下面结合实例进一步说明本发明的具体实施方式，但本发明保护不限于下述实施方式及其组合。

实施实例1

(1)配制筛选培养基。筛选培养基包括好氧固体培养基和厌氧固体培养基两种，其组成分别为：每升好氧固体培养基包含0.3g的NaAC，6g的牛肉膏，12g的胰蛋白胨，6g的NaCl，0.2g的KH₂PO₄，18g的琼脂粉，2ml微量元素溶液，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0；每升厌氧固体培养基包含3g的NaAC，6g的牛肉膏，12g的胰蛋白胨，6g的NaCl，18g的琼脂粉，2ml微量元素溶液，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0。微量元素溶液组成为：每升蒸馏水中包含0.5g的EDTA，0.06g的CaCl₂，0.051g的FeSO₄·7H₂O，0.016g的CuSO₄·5H₂O，0.016g的CoCl₂·6H₂O，0.023g的ZnSO₄·7H₂O，0.053g的MnCl₂·4H₂O，0.012g的(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O。菌种保藏培养基为固体LB培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0。以上培养基均需121℃蒸汽灭菌25分钟。好氧固体培养基和厌氧固体培养基分别在冷却到50℃左右倒培养皿，冷却待用。保藏培养基摆放成斜面冷却待用。BCIP溶液含量为：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。

(2)取样稀释。应用灭菌的锥形瓶取SBR系统中好氧状态培养的活性污泥50ml，污泥的SVI₃₀为38mL/g，MLSS为4.2g/L。加入无菌玻璃珠，摇动打碎污泥。用带有无菌纱布的漏斗过滤破碎的污泥，收集滤液。用无菌生理盐水稀释滤液，分别制成稀释度为10^-2、10^-3、10^-4的稀释液。

(3)涂布。用移液枪分别移取200μl的10^-3和10^-4稀释液到厌氧固体培养皿中，用涂布器进行涂布。然后置于厌氧培养箱中恒温30℃培养14小时。

(4)筛选。待厌氧固体培养皿培养结束后，选择菌落个数在30～50个的培养皿作为母板，通过影印板接种到好氧固体培养皿上。30℃恒温培养14小时。待好氧固体培养皿培养结束后，通过影印板接种到厌氧固体培养皿上厌氧培养。如此操作循环6次。在筛选操作中可以对传代后剩余在培养皿上的菌落进行染色观察：挑取在好养培养状态下的菌落进行甲苯胺蓝染色，观察菌体内聚磷酸盐形成的异染色粒；挑取在厌氧培养状态下的菌落进行苏丹黑染色，观察菌体内的PHAs颗粒。

(5)显色观察。用移液枪在厌氧固体培养皿表面加上40μl的BCIP溶液，用涂布器涂匀，静置1小时吸收。通过影印把好氧的菌落接种到厌氧培养皿上。30℃恒温培养12小时，培养皿上会出现蓝白菌落，其中蓝色菌落为聚磷能力强的菌种。

(6)菌种保藏。挑取蓝色菌落到LB试管斜面上划线，30℃恒温培养12小时。长好后4℃冷藏留种。

(7)除磷能力考察。考察培养基组成为：每升考察培养基包含5.0gNaAC，0.5g NH₄Cl，0.25g牛肉膏，0.5g胰蛋白胨，0.1g磷酸二氢钾，2ml微量元素溶液，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0。在250ml锥形瓶中加入100ml考察培养基，用透气封口膜包好后灭菌。将得到的菌种分别接入到锥形瓶中，恒温振荡培养12小时，使得培养基内达到一定的菌量。然后停止震荡，静瓶培养2小时，细菌在这一阶段吸收小分子酸，释放磷。再次开启振荡好氧培养6小时，细菌吸收磷。最后将得到的菌液一部分测量OD₆₀₀值，一部分4400转/分离心15分钟，收集上清液，检测其中的磷含量并计算除磷率。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。

通过筛选，在培养皿上共接种菌株34株，其中有4株菌随着筛选消失，说明不适应筛选条件。剩余的30株中，有7株显示出蓝色菌落，编号分别为T1，T5，T16，T23，T37，T38，P21，除磷率都在65％以上，最高的达到83％。具体除磷率见表1。而一般的分离方法得到的聚磷菌只占分离总菌的15％左右，即使应用强化的分离方法，分离得到的聚磷菌占分离总菌的比例也只有43％左右。本方法中，除磷效率在50％以上，即有明显除磷效果的菌种占到总数的60％，比例大大提高。尤其以蓝色菌落作为筛选条件，虽然并不能把其中的所有高效菌都显示出来，但是可以显示除磷率在65％以上的比例占到70％，这样就可以单独挑取蓝色菌株，大大提高菌株的筛选效率，省略除磷效率低的菌株的考察实验。

表1筛选出的菌株对磷的去除率

菌株	T1	T5	T10	T16	T19	T23	T25	T29	T36	T41
											磷去除率％	69	66	65	68	53	67	54	58	57	68
菌株	T6	T24	T32	T33	T35	T37	T38	T39	T42	P21
											磷去除率％	52	42	49	52	47	66	69	47	33	83
菌株	P22	P23	P24	P25	P26	P27	P28	P29	P210	P211
											磷去除率％	42	43	56	21	59	67	35	43	28	44

实施实例2

(1)配制筛选培养基。筛选培养基包括好氧固体培养基和厌氧固体培养基两种，其组成分别为：每升好氧固体培养基包含0.1g的NaAC，4g的牛肉膏，8g的胰蛋白胨，4g的NaCl，0.15g的KH₂PO₄，15g的琼脂粉，1ml微量元素溶液，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0；每升厌氧固体培养基包含1g的NaAC，4g的牛肉膏，8g的胰蛋白胨，4g的NaCl，15g的琼脂粉，1ml微量元素溶液，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0。微量元素溶液组成为：每升蒸馏水中包含0.4g的EDTA，0.05g的CaCl₂，0.049g的FeSO₄·7H₂O，0.015g的CuSO₄·5H₂O，0.0163g的CoCl₂·6H₂O，0.021g的ZnSO₄·7H₂O，0.05g的MnCl₂·4H₂O，0.01g的(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O。菌种保藏培养基为固体LB培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0。以上培养基均需121℃蒸汽灭菌25分钟。好氧固体培养基和厌氧固体培养基分别在冷却到50℃左右倒培养皿，冷却待用。保藏培养基摆放成斜面冷却待用。BCIP溶液含量为：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。

(2)取样稀释。应用灭菌的锥形瓶取SBR系统中厌氧状态培养的活性污泥50ml，污泥的SVI₃₀为38mL/g，MLSS为4.2g/L。加入无菌玻璃珠，摇动打碎污泥。用带有无菌纱布的漏斗过滤破碎的污泥，收集滤液。用无菌生理盐水稀释滤液，分别制成稀释度为10^-2、10^-3、10^-4的稀释液。

(3)涂布。用移液枪分别移取200μl的10^-3和10^-4稀释液到好氧固体培养皿中，用涂布器进行涂布。然后置于恒温培养箱中30℃培养14小时。

(4)筛选。待好氧固体培养皿培养结束后，选择菌落个数在30～50个的培养皿作为母板，通过接种针挑取菌落到厌氧固体培养基上，剩余在好氧固体培养皿上的菌落应用甲苯胺蓝染色法进行显微镜观察，标记菌体内含有聚磷酸盐颗粒的菌落位置。厌氧固体培养皿30℃恒温厌氧培养10小时。待厌氧固体培养皿上的菌落长好后，通过接种针依次挑取菌落到好氧固体培养皿上好氧培养，剩余在厌氧固体培养皿上的菌落应用苏丹黑染色法进行显微镜观察，菌体内有PHAs染色粒的菌种为聚磷能力强的菌种，标记位置。如此循环4～6次。

(5)显色观察。用移液枪在好氧固体培养皿表面加上40μl的BCIP溶液，用涂布器涂匀，静置1小时吸收。通过接种针挑取厌氧的菌落接种到好氧固体培养皿上。30℃恒温培养12小时，培养皿上会出现蓝白菌落，其中蓝色菌落为聚磷能力强的菌种。

(6)菌种保藏。挑取蓝色菌落到LB试管斜面上划线，30℃恒温培养12小时，4℃冷藏留种。

(7)除磷能力考察。考察培养基组成为：每升考察培养基包含5.0gNaAC，0.5g NH₄Cl，0.25g牛肉膏，0.5g胰蛋白胨，0.1g磷酸二氢钾，2ml微量元素溶液，其余蒸馏水补足，调节pH至7.0。在250ml锥形瓶中加入100ml考察培养基，用透气封口膜包好后灭菌。将得到的菌种分别接入到锥形瓶中，恒温振荡培养12小时，使得培养基内达到一定的菌量。然后停止震荡，静瓶培养2小时，细菌在这一阶段吸收小分子酸，释放磷。再次开启振荡好氧培养6小时，细菌吸收磷。最后将得到的菌液一部分测量OD₆₀₀值，一部分菌液通过针头式滤膜过滤，得到的过滤液进行磷含量的检测，与初始的磷含量比较计算除磷率。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。

通过筛选，在培养皿上共接种菌株36株，其中有7株菌随着筛选消失，说明不适应筛选条件。剩余的29株中，有8株显示出蓝色菌落，编号分别为B4，B8，B9，B16，B17，B18，T8，T9，除磷率都在60％以上，最高的达到87％。具体除磷率见表2。本方法中，除磷效率在50％以上，即有明显除磷效果的菌种占到总数的45％。尤其以蓝色菌落作为筛选条件，虽然并不能把其中的所有高效菌都显示出来，但是可以显示除磷率在65％以上的比例占到89％，这样就可以单独挑取蓝色菌株，大大提高菌株的筛选效率，省略除磷效率低的菌株的考察实验。

表2筛选出的菌株对磷的去除率

菌株	B1	B2	B3	B4	B5	B6	B7	B8	B9	B10
											磷去除率％	22	44	17	78	42	44	46	87	79	66
菌株	B11	B12	B13	B15	B16	B17	B18	B19	B20	B21
											磷去除率％	54	46	53	41	82	70	72	40	44	45
菌株	P212	P213	P214	P215	T3	T7	T8	T9	T12
											磷去除率％	44	52	43	46	20	46	63	69	65

Claims

1.一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法，其特征在于该方法步骤如下：

a.配制筛选培养基：

筛选培养基包括好氧固体培养基和厌氧固体培养基两种，其组成分别为：每升好氧固体培养基包含0.1～0.3g的NaAC，4～6g的牛肉膏，8～12g的胰蛋白胨，4～6g的NaCl，0.15～0.2g的KH₂PO₄，15～18g的琼脂粉，1～2ml微量元素溶液，其余为水，调节pH至6.8～7.2；每升厌氧固体培养基包含1～3g的NaAC，4～6g的牛肉膏，8～12g的胰蛋白胨，4～6g的NaCl，15～18g的琼脂粉，1～2ml微量元素溶液，其余为水，调节pH至6.8～7.2；

所述微量元素溶液组成为：每升包含0.4～0.5g的EDTA，0.05～0.06g的CaCl₂，0.049～0.051g的FeSO₄·7H₂O，0.015～0.016g的CuSO₄·5H₂O，0.016～0.0163g的CoCl₂·6H₂O，0.021～0.023g的ZnSO₄·7H₂O，0.05～0.053g的MnCl₂·4H₂O，0.01～0.012g的(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，其余为水；

好氧固体培养基和厌氧固体培养基121℃蒸汽灭菌25分钟；分别冷却到47～55℃倒培养皿，冷却待用；

5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP溶液含量为：每毫升二甲基甲酰胺包含15～20mg BCIP，-20℃保存；

b.取样稀释：

应用灭菌的锥形瓶取SBR系统中的活性污泥50～100ml，加入无菌玻璃珠，晃动打碎；用带有无菌纱布的漏斗过滤破碎好的污泥，收集滤液；用无菌生理盐水稀释滤液，分别制成稀释度为10^-2、10^-3、10^-4的稀释液；

c.涂布：

用移液枪分别移取150～200μl稀释度为10^-3和10^-4的稀释液到厌氧固体培养皿中，用涂布器进行涂布；然后置于无氧环境中恒温28～38℃培养10～15小时；

d.筛选：

待厌氧固体培养皿培养结束后，选择菌落个数在30～50个的培养皿作为母板，通过影印板或者接种针挑取到好氧固体培养皿上；恒温28～38℃培养10～15小时；待好氧固体培养皿培养结束后，应用影印板或者接种针挑取到厌氧固体培养皿上厌氧培养；如此操作循环4～6次；

e.显色观察：

在厌氧或好氧固体培养皿上，用移液枪在琼脂表面加上40～60μl的BCIP溶液，用涂布器涂匀，静置0.5～1小时吸收；通过影印或者接种针挑取的方法把d中的菌落接种到含BCIP的培养皿上；28～38℃恒温培养10～15小时后，培养皿上会出现蓝白菌落，其中蓝色菌落为聚磷能力强的菌种；

f.菌种保藏：

菌种保藏培养基为固体肉汤培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余为水，调节pH至7.2，分装到试管加塞子，121℃蒸汽灭菌25分钟；摆放斜面冷却，挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，28～38℃恒温培养10～15小时，0～4℃冷藏留种。