CN111394251A - 一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法 - Google Patents

一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法，涉及聚磷菌驯化富集技术领域；所述方法包括对污泥的预处理、菌种的体外驯化富集和菌种分离。利用本发明所述方法，可减少杂菌对聚磷菌营养竞争的干扰，提高分离聚磷菌的物种丰富度；使用OD600值在0.1～0.5之间的稀释液进行四区划线接种，可显著降低工作量；四区划线与显色筛选同步进行，经过两轮显色筛选，使聚磷菌的筛选更加准确，缩小了筛选的范围，减少工作量，提高筛选的准确度。

Description

一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法
技术领域
本发明属于聚磷菌驯化富集技术领域，具体涉及一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法。
背景技术
生物除磷是污水处理中重要的除磷技术，生物膜法以其污泥产量少、无需排泥、占地面积小等优点，在生物除磷技术中占据重要地位。生物膜法通过污泥中的聚磷菌好氧吸磷降低水中的磷浓度、厌氧释磷富集磷酸盐溶液以达到磷酸盐的同步去除与富集。由此可见，生物膜中微生物的种类和数量直接影响到系统对磷的去除和富集回收效率。从中筛选出高效聚磷菌，明确工艺稳定运行的聚磷菌种类，弄清菌种最适的生长条件，对指导工艺的稳定运行及除磷效率的提高具有重要意义。
目前对聚磷菌的富集筛选方法有了一定的研究，常见的筛选方法多是在模拟除磷反应器中先进行富集，然后梯度稀释活性污泥，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行反复的四区划线，筛选的单菌落再进行BCIP染色培养基涂布(聚磷菌遇BCIP溶液变蓝)，初步获得除磷菌株，再进行除磷能力鉴定，PHA、Poly-P染色、16S rDNA测序等系列实验，最终获得纯培养聚磷菌。该方法耗时长、工作量大、筛出的聚磷菌占总分离菌的比例低、针对性较差。此外，反应器的驯化富集条件与分离培养基的营养状况差异较大，有些聚磷菌的生长受到其它杂菌代谢产物的影响而被淘汰，造成分离的聚磷菌菌种多样性的降低。基于此，为了快速得到高效聚磷菌，对富集分离方法的改造显得尤为必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法，聚磷菌富集检出率在80％以上，大大提高筛选的效率和准确性，降低除磷能力检测的工作量，减少菌种测序的成本投入。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法，包括以下步骤：(1)取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥，涡旋、离心后弃上清，对离心后沉淀再涡旋，得预处理污泥；
(2)在厌氧状态下，将所述预处理污泥接种到厌氧液体培养基中静置24h，离心弃上清；将离心后的沉淀接种于好氧液体培养基中，有氧培养23h后，静置1h；
所述厌氧液体培养基中包括以下浓度的成分：2～5g/L的NaAC、135～145mg/L的(NH4)2SO4、12～16mg/L的CaCl2·2H2O、175～185mg/L的MgSO4·7H2O、0.3～0.5mL/L的微量元素液和0.5～1mL/L的维生素液；
所述好氧液体培养基中包括以下浓度的成分：135～145mg/L的KH2PO4、240～250mg/L的K2HPO4、135～145mg/L的(NH4)2SO4、12～16mg/L的CaCl2·2H2O、175～185mg/L的MgSO4·7H2O、0.3～0.5mL/L的微量元素液和0.5～1mL/L的维生素液；
(3)重复步骤(2)至好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，得体外富集驯化菌液；其中：
厌氧释磷量＝厌氧初期磷含量-厌氧末期磷含量式Ⅰ；
好氧吸磷量＝好氧末期磷含量-好氧初期磷含量式Ⅱ；
(4)将所述体外富集驯化菌液离心后弃上清，利用生理盐水将离心后的菌体沉淀稀释，取OD600值为0.1～0.5之间的稀释液接种于固体分离培养基上培养2～3d，挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的单菌落，重复在所述固体分离培养基上进行四区划线，收集所述固体分离培养基上形态一致的菌体，得高效聚磷菌；
所述固体分离培养基中含有BCIP显色液，还包括以下浓度的成分：2～3g/L的NaAC、180mg/L的KH2PO4、320mg/L的K2HPO4、1.4～1.6g/L的(NH4)2SO4、150mg/L的CaCl2·2H2O、1.7g/L的MgSO4·7H2O、3～5mL/L的微量元素液、10mL/L的维生素液和15g/L的琼脂。
优选的，步骤(1)所述离心的转速为12000rpm，所述离心的时间为30s。
优选的，步骤(2)所述离心的转速为6000rpm，所述离心的时间为20min。
优选的，步骤(2)所述有氧培养在摇床上进行，所述摇床的转速为150rpm，所述有氧培养的温度为30±0.5℃。
优选的，步骤(4)所述离心的转速为10000rpm，所述离心的时间为10min。
优选的，步骤(4)中利用生理盐水将离心后的菌体沉淀稀释成10-1～10-7倍。
优选的，步骤(2)和步骤(4)中所述微量元素液包括以下浓度的成分：1.4～1.6g/L的FeCl3·6H2O、0.14～0.16g/L的H3BO3，0.03～0.05g/L的CuSO4·5H2O、0.17～0.19g/L的KI、0.12～0.14g/L的MnCl2·4H2O、0.05～0.07g/L的Na2MO4·2H2O、0.11～0.13g/L的ZnSO4·7H2O和0.14～0.16g/L的CoCl2·6H2O。
优选的，步骤(2)和步骤(4)中所述维生素液包括以下浓度的成分：50～52mg/L的维生素B1、50～55mg/L的维生素B2、90～100mg/L的维生素B6、2～3g/L的维生素B12、8～10mg/L的叶酸、50～55mg/L的烟酸、50～55mg/L的泛酸钙、50～55mg/L的对氨基苯甲酸和20～21mg/L的生物素。
优选的，在步骤(4)得到高效聚磷菌后，还包括对所述高效聚磷菌进行好氧Poly-P和厌氧PHA染色。
优选的，经过好氧Poly-P和厌氧PHA染色验证后的高效聚磷菌，还包括菌种保存，所述菌种保存为在固体LB培养基上进行。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：反应器驯化富集的活性污泥经涡旋后搅拌均匀，降低了活性污泥的粘性，让菌与泥进行分离，增加了菌与营养液的接触，先进行厌氧培养基和好氧培养基的富集培养，待上清液中好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止驯化富集，进行接种。给活性污泥中的聚磷菌提供了一种在体外培养基中适应的条件环境，淘汰了大部分杂菌，减少了杂菌对聚磷菌营养竞争的干扰，提高了分离聚磷菌的物种丰富度。
将梯度稀释的聚磷菌测试OD600，使OD600值在0.1～0.5之间的稀释液进行四区划线接种，所述浓度范围内的稀释液在第三和第四接种区易出现单菌落，为接种浓度找到了一个依据，降低工作量。
梯度稀释液首次在平板划线时使用涂布BCIP的显色液，四区划线与显色筛选同步进行，挑取蓝色单菌落进行第二轮四区划线，仍然在加有BCIP显色液的平板上划线，两轮显色筛选，使聚磷菌的筛选更加准确，缩小了筛选的范围，减少工作量，提高筛选的准确度。
具体实施方式
本发明提供了一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法，包括以下步骤：(1)取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥，涡旋、离心后弃上清，对离心后沉淀再涡旋，得预处理污泥；
(2)在厌氧状态下，将所述预处理污泥接种到厌氧液体培养基中静置24h，离心弃上清；将离心后的沉淀接种于好氧液体培养基中，有氧培养23h后，静置1h；
所述厌氧液体培养基中包括以下浓度的成分：2～5g/L的NaAC、135～145mg/L的(NH4)2SO4、12～16mg/L的CaCl2·2H2O、175～185mg/L的MgSO4·7H2O、0.3～0.5mL/L的微量元素液和0.5～1mL/L的维生素液；
所述好氧液体培养基中包括以下浓度的成分：135～145mg/L的KH2PO4、240～250mg/L的K2HPO4、135～145mg/L的(NH4)2SO4、12～16mg/L的CaCl2·2H2O、175～185mg/L的MgSO4·7H2O、0.3～0.5mL/L的微量元素液和0.5～1mL/L的维生素液；
(3)重复步骤(2)至好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，得体外富集驯化菌液；其中：
厌氧释磷量＝厌氧初期磷含量-厌氧末期磷含量式Ⅰ；
好氧吸磷量＝好氧末期磷含量-好氧初期磷含量式Ⅱ；
(4)将所述体外富集驯化菌液离心后弃上清，利用生理盐水将离心后的菌体沉淀稀释，取OD600值为0.1～0.5之间的稀释液接种于固体分离培养基上培养2～3d，挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的单菌落，重复在所述固体分离培养基上进行四区划线，收集所述固体分离培养基上形态一致的菌体，得高效聚磷菌；
所述固体分离培养基中含有BCIP显色液，还包括以下浓度的成分：2～3g/L的NaAC、180mg/L的KH2PO4、320mg/L的K2HPO4、1.4～1.6g/L的(NH4)2SO4、150mg/L的CaCl2·2H2O、1.7g/L的MgSO4·7H2O、3～5mL/L的微量元素液、10mL/L的维生素液和15g/L的琼脂。
本发明取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥，涡旋、离心后弃上清，对离心后沉淀再涡旋，得预处理污泥。本发明在进行所述污泥的预处理时，优选取40～60mL的生物膜反应器活性污泥，涡旋2～3min后离心，所述离心的转速优选为12000rpm，所述离心的时间优选为30s。本发明优选对所述涡旋和离心的步骤重复2～3次，然后对所述离心后的沉淀再涡旋，所述再涡旋的时间优选为2～3min。
本发明在厌氧状态下，将所述预处理污泥接种到厌氧液体培养基中静置24h，离心弃上清；将离心后的沉淀接种于好氧液体培养基中，有氧培养23h后，静置1h。本发明所述厌氧状态优选通过向盛有厌氧液体培养基的锥形瓶中充入氮气，使锥形瓶内达到厌氧状态，室温静置24h。本发明优选将锥形瓶中的混合液离心弃上清，所述离心的转速优选为6000rpm，所述离心的时间优选为20min。本发明优选将离心后的沉淀接种于盛有好氧液体培养基的三角瓶中，用透气滤膜封口，有氧培养23h后，静置1h。本发明所述有氧培养优选在摇床上进行，所述摇床的转速优选为150rpm，所述有氧培养的温度优选为30±0.5℃。本发明所述微量元素液优选包括以下浓度的成分：1.4～1.6g/L的FeCl3·6H2O、0.14～0.16g/L的H3BO3，0.03～0.05g/L的CuSO4·5H2O、0.17～0.19g/L的KI、0.12～0.14g/L的MnCl2·4H2O、0.05～0.07g/L的Na2MO4·2H2O、0.11～0.13g/L的ZnSO4·7H2O和0.14～0.16g/L的CoCl2·6H2O。本发明所述维生素液优选包括以下浓度的成分：50～52mg/L的维生素B1、50～55mg/L的维生素B2、90～100mg/L的维生素B6、2～3g/L的维生素B12、8～10mg/L的叶酸、50～55mg/L的烟酸、50～55mg/L的泛酸钙、50～55mg/L的对氨基苯甲酸和20～21mg/L的生物素。
本发明重复步骤(2)至好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，得体外富集驯化菌液。本发明在进行所述重复循环时，优选监测上清液中的磷浓度。在本发明中，好氧吸磷量/厌氧释磷量比值呈现下降的趋势，当所述比值下降，说明聚磷菌通过驯化已占优势菌，且除磷能力较强，可进行下一步的分离实验。
本发明反应器驯化富集的活性污泥经磁力搅拌子搅拌(涡旋)均匀，降低了活性污泥的粘性，让菌与泥进行分离，增加了菌与营养液的接触，拿出后先进行厌氧培养基和好氧培养基的富集培养，待上清液中好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止驯化富集，进行接种。给活性污泥中的聚磷菌提供了一种在体外培养基中适应的条件环境，淘汰了大部分杂菌，减少了杂菌对聚磷菌营养竞争的干扰，提高了分离聚磷菌的物种丰富度。
本发明将所述体外富集驯化菌液离心后弃上清，利用生理盐水将离心后的菌体沉淀稀释，取OD600值为0.1～0.5之间的稀释液接种于固体分离培养基上培养2～3d，挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的单菌落，重复在所述固体分离培养基上进行四区划线，收集所述固体分离培养基上形态一致的菌体，得高效聚磷菌。
本发明将所述体外富集驯化菌液离心后弃上清，所述离心的转速优选为10000rpm，所述离心的时间优选为10min。本发明利用生理盐水优选将离心后的菌体沉淀稀释成10-1～10-7倍，更优选稀释成10-2～10-3倍，此时稀释液的OD600约为0.1～0.5，细菌一般是在600nm波长下有最大吸收，OD600值可相对反应菌液的浓度，以此给接种液的稀释浓度提供一个适宜的参考范围。本发明优选将OD600值为0.1～0.5之间的稀释液用涂布器涂布于固体分离培养基(加BCIP显色液)平板上，将各涂布完成的培养皿贴好标签、日期，然后在30±0.5℃条件下倒置于培养箱内培养2～3d(如没有长菌可延长至3～7d)。挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的，用接种针挑取蓝色单菌落并进行序号标记，然后在涂布BCIP的分离培养基上进行四区划线实现菌种纯化与再次BCIP显色液复筛，30±0.5℃培养(约3～7d)，待挑取划线的新菌落长成后，取其中变蓝并且菌体形态不一致的在分离培养基上重复四区划线操作，如此重复2～3次，直到镜检时，视野中固体平板上的菌体形态一致为止。至此，菌落的分离纯化工作完成。本发明所述固体分离培养基中的微量元素液与维生素液的成分优选与上述相同，在此不再赘述。
在本发明中，梯度稀释的聚磷菌测试OD600，使OD600值在0.1～0.5之间的稀释液进行四区划线接种，这种浓度的稀释液在第三和第四接种区易出现单菌落，为接种浓度找到了一个依据，降低工作量。本发明在稀释液-涂布的分离培养基表面涂布BCIP溶液，将四区划线和显色筛选同步进行，挑取蓝色的单菌落进行下一轮的四区划线，重复2～3次，即可获得高效聚磷菌单菌落，提高筛选效率、缩短筛选时间、降低工作量。
本发明在得到高效聚磷菌后，优选还包括对所述高效聚磷菌进行好氧Poly-P(奈瑟氏新染色法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)，奈瑟氏新染色法Poly-P颜色墨绿色、细胞颜色黄棕色，尼罗蓝染色法PHA颜色偏红、细胞颜色无荧光，若染色成功可初步判定为为高效聚磷菌。本发明对所述氧Poly-P(奈瑟氏新染色法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)的具体操作方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明优选对经过所述的菌种进行除磷除磷能力鉴定，将磷酸盐去除能力进行由高到低的排序，选取磷酸盐去除能力较强的聚磷菌进行尼罗蓝和奈瑟氏新染色方法进行染色，选取二者染色效果较好的除磷菌进行16S rDNA测序，结合菌种的生理生态研究，确定菌种的种类。基于聚磷菌的除磷性能进行初步鉴定，针对性强，染色方法的选取无毒性、简单易行，基于除磷能力检测和染色的初筛，降低16S rDNA测序的成本和菌种生理功能检测的工作量。本发明对经过好氧Poly-P和厌氧PHA染色验证后的高效聚磷菌，优选还包括菌种保存，所述菌种保存优选在固体LB培养基上进行。本发明对固体LB培养基的成分并没有特殊限定，优选包括：10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母膏、10g/L的NaCl和15g/L的琼脂，调节pH至7。本发明优选挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，30℃恒温培养24h后，0～4℃冷藏留种。本发明优选将纯菌株接种于液体分离培养基(固体分离培养基不加琼脂即为液体分离培养基)中培养24h，取菌液置于5mL离心管中，封口后测序，进行菌种鉴定。
下面结合实施例对本发明提供的从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.污泥的预处理：
取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥50mL，涡旋2min、12000rpm离心30s，弃上清，重复2次，再涡旋2min后用于驯化培养以保证菌与泥的分离，与培养基的充分接触；
2.菌种的体外驯化富集：
将上述污泥沉淀倒入盛有100mL厌氧液体培养基的250mL锥形瓶中摇晃混匀，向其中充入氮气，达到厌氧状态，室温静置24h。将锥形中的混合液离心(6000rpm，20min)，弃上清，将污泥沉淀倒入盛有好氧液体培养基三角瓶中，用透气滤膜封口，室温摇床摇23h(30±0.5℃、150rpm)，静置1h。重复上述驯化富集循环，同时监测上清液中的磷浓度，当好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，进行分离；表1中经过3轮厌氧和好氧循环驯化富集，好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降，即可用于分离，说明接种前污泥的预处理增加菌与培养基的接触对缩短驯化富集周期有显著效果。
表1厌氧释磷量和好氧吸磷量
Figure BDA0002438553760000081
厌氧释磷量＝厌氧初期磷含量-厌氧末期磷含量 式Ⅰ
好氧吸磷量＝好氧末期磷含量-好氧初期磷含量 式Ⅱ
厌氧液体培养基：每升厌氧培养基是由4g的NaAC、140mg的(NH4)2SO4、14mg的CaCl2·2H2O、180mg的MgSO4·7H2O、0.4mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7。
好氧液体培养基：每升好氧培养基是由140mg的KH2PO4、245mg的K2HPO4、140mg的(NH4)2SO4、14mg的CaCl2·2H2O、180mg的MgSO4·7H2O、0.5mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7。
微量元素液：每升微量元素液是由1.5g的FeCl3·6H2O、0.15g的H3BO3，0.04g的CuSO4·5H2O、0.18g的KI、0.13g的MnCl2·4H2O、0.06g的Na2MO4·2H2O、0.12g的ZnSO4·7H2O、0.15g的CoCl2·6H2O和余量的蒸馏水组成。
维生素液：每升维生素液是由50mg的维生素B1、50mg的维生素B2、100mg的维生素B6、2g的维生素B12、10mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸、21mg的生物素和余量的蒸馏水组成。
3.菌种分离
将上述混合液10mL离心(10000rpm，10min)，弃上清，将污泥沉淀打散(磁力搅拌子搅拌2min、冰浴1min、重复2次，再磁力搅拌2min)，用无菌生理盐水90mL(浓度为0.9％氯化钠溶液)稀释成10-2、10-3倍，测OD600在0.1～0.5之间，用移液枪吸100μL 10-2、10-3稀释液于固体分离培养基上，每个稀释度做3个平行，用涂布器涂布于固体分离培养基(加BCIP显色液)平板上，将各涂布完成的培养皿贴好标签、日期，30±0.5℃条件下倒置于培养箱内培养3d(如没有长菌可延长至7d)。挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的30株，用接种针挑取这30株蓝色单菌落并进行序号标记，然后在涂布BCIP的分离培养基上进行四区划线实现菌种纯化与再次BCIP显色液复筛，30±0.5℃培养(约3～7d)，待挑取划线的新菌落长成后，取其中变蓝并且菌体形态不一致的27株在分离培养基上重复四区划线操作，如此重复2次，直到镜检时，视野中固体平板上的菌体形态一致为止，发现有23株生长较好。用接种环取各单菌落接种于保藏斜面培养基上，于30℃培养24h，取出于4℃冰箱保藏，待鉴定。
固体分离培养基(带BCIP显色液)：每升固体分离培养基由2g的NaAC、180mg的KH2PO4、320mg的K2HPO4、1.5g的(NH4)2SO4、150mg的CaCl2·2H2O、1.7g的MgSO4·7H2O、5mL的微量元素液、10mL的维生素液、15g的琼脂和余量的蒸馏水组成，分离培养基的pH值为7。121℃，25min灭菌。固体培养基冷却到50℃倾倒培养皿，冷却后待用，用之前在固体分离培养基上，用移液枪在琼脂表面上加80μL的BCIP溶液，用涂布器涂匀，在30℃培养箱静置1.5h吸收，待用。
BCIP溶液：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。
4.菌种筛选
4.1好氧Poly-P(奈瑟氏新方法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)
将上述筛选的23株高效聚磷菌进行好氧Poly-P(奈瑟氏新染色法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)，奈瑟氏新染色法颗粒颜色墨绿色、细胞颜色黄棕色，尼罗蓝染色法颗粒颜色偏红、细胞颜色无荧光，结果发现23株两种染色结果皆为阳性，说明两轮BCIP染色培养基的四区划线筛选比一般的分离后BCIP染色筛选准确。
尼罗蓝染色法：挑取一环分离的菌株接种于检测培养基中96h，用移液枪吸取10μL的菌液涂布于载玻片上，用酒精灯火焰固定，置于超净工作台中风干。取0.3mg/mL的尼罗蓝染色液滴在已制备好的厌氧末端污泥涂片上，放入50℃烘箱中，待烘干后用8％冰醋酸脱色2min，然后用蒸馏水清洗3遍，加盖玻片后置于荧光显微镜使用460nm和546nm激发光观察，每种浓度梯度做3次重复。
奈瑟氏新方法染色：上述菌液在超净工作台中酒精灯固冷却后，用5g/L美兰染色液染色2min，用蒸馏水清洗3遍，通风橱中干燥；用奈瑟氏乙液(6g/L黄叱精)复染2min，用蒸馏水清洗3遍清去染色液，自来水冲洗，通风橱中干燥；显微镜观察。
4.2除磷能力检测：
将上述好氧Poly-P和厌氧PHA染色阳性的菌种进行除磷能力检测。
制备种子液及除磷能力检测：在250mL锥形瓶中加入100mL检测培养基，用透气封口膜包好后灭菌，121℃，灭菌25min。取纯化后的平板菌种，在超净工作台中，于无菌的条件下用灭菌后的接种环挑取一环纯菌接入到锥形瓶中，30±0.5℃、160rpm振荡培养15h，停止震荡，室温静止2h。再次好氧振荡培养4～7h，分别在4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h取样，6000转，20min离心后测上清液磷浓度并计算除磷率。最后再将得到的菌液一部分测量OD600值，测量菌液的OD600值应用可见光分光光度计，以稀释4倍的空白培养基为参比，在600nm波长下，测量菌液的吸光度。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。
检测培养基：每升检测培养基包含5gNaAC，0.4gNH4Cl，0.2g牛肉膏，0.4g胰蛋白胨，0.1gKH2PO4，2mL微量元素溶液，其余为水，调节pH至7。
筛选过程中，涂布的稀释液浓度为10-2、10-3两个浓度梯度，这两个浓度梯度OD600值在0.1～0.5之间，涂布后菌落数在30～50之间，针对性的选择稀释梯度进行涂布，减少了工作量。
第一轮筛选的蓝色单菌落30株，第二轮筛选的蓝色单菌落27株，将27株进行第三次平板划线分离，有23株单菌落长出，其余4株说明不适应筛选条件被淘汰。对23株进行PHA和Poly-P染色，皆为阳性，除磷能力鉴定23株都具有除磷能力，结果如表2，其中除磷率在65％以上的编号为：P2、P4、P6、P7、P11，最高的除磷率为编号P6的91.19％，分离出的聚磷菌占76.67％；除磷率在50％以上(有明显除磷效果)占52.17％，比例明显提高。聚磷菌检出率85.18％，大大提高筛选的效率和准确性，降低除磷能力检测的工作量，减少菌种测序的成本投入。
表2菌株除磷率
Figure BDA0002438553760000111
5.聚磷菌的16S r DNA序列鉴定：
将纯菌株接种于液体分离培养基(固体分离培养基不加琼脂即为液体分离培养基)中培养24h，取菌液置于5mL离心管中，封口后送生工生物工程股份有限公司进行菌种鉴定。
6.菌种保藏：
菌种保藏培养基为固体LB培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余为水，调节pH至7。LB液体培养基和固体LB培养基一样，不加琼脂，用于菌种扩大培养的-80℃菌种加甘油保藏。保藏培养基分装到试管加塞子，摆放成斜面冷却待用。挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，30℃恒温培养，24h后，0～4℃冷藏留种。
实施例2
1.污泥的预处理：
取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥50mL；
2.菌种的体外驯化富集：
将上述污泥沉淀倒入盛有100mL厌氧液体培养基的250mL锥形瓶中摇晃混匀，向其中充入氮气，达到厌氧状态，室温静置24h。将锥形中的混合液离心(6000rpm，20min)，弃上清，将污泥沉淀倒入盛有好氧液体培养基三角瓶中，用透气滤膜封口，室温摇床摇23h(30±0.5℃、150rpm)，静置1h。重复上述驯化富集循环，同时监测上清液中的磷浓度，当好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，进行分离；表3中经过6轮厌氧和好氧循环驯化富集，好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降，即可用于分离，说明接种前污泥的未经均一化的预处理会影响污泥的驯化富集周期。
表3厌氧释磷量和好氧吸磷量
Figure BDA0002438553760000121
厌氧液体培养基：每升厌氧培养基是由4g的NaAC、140mg的(NH4)2SO4、14mg的CaCl2·2H2O、180mg的MgSO4·7H2O、0.4mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7。
好氧液体培养基：每升好氧培养基是由140mg的KH2PO4、245mg的K2HPO4、140mg的(NH4)2SO4、14mg的CaCl2·2H2O、180mg的MgSO4·7H2O、0.5mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7。
微量元素液：每升微量元素液是由1.5g的FeCl3·6H2O、0.15g的H3BO3，0.04g的CuSO4·5H2O、0.18g的KI、0.13g的MnCl2·4H2O、0.06g的Na2MO4·2H2O、0.12g的ZnSO4·7H2O、0.15g的CoCl2·6H2O和余量的蒸馏水组成。
维生素液：每升维生素液是由50mg的维生素B1、50mg的维生素B2、100mg的维生素B6、2g的维生素B12、10mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸、21mg的生物素和余量的蒸馏水组成。
3.菌种分离
将上述混合液10mL离心(10000rpm，10min)，弃上清，将污泥沉淀打散(磁力搅拌子搅拌2min、冰浴1min、重复2次，再磁力搅拌2min)，用无菌生理盐水90mL(浓度为0.9％氯化钠溶液)稀释成10-2、10-3倍，测OD600在0.1～0.5之间，用移液枪吸100μL 10-2、10-3稀释液于固体分离培养基上，每个稀释度做3个平行，用涂布器涂布于固体分离培养基(加BCIP显色液)平板上，将各涂布完成的培养皿贴好标签、日期，30±0.5℃条件下倒置于培养箱内培养3d(如没有长菌可延长至7d)。挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的25株，用接种针挑取这25株蓝色单菌落并进行序号标记，然后在涂布BCIP的分离培养基上进行四区划线实现菌种纯化与再次BCIP显色液复筛，30±0.5℃培养(约3～7d)，待挑取划线的新菌落长成后，取其中变蓝并且菌体形态不一致的23株在分离培养基上重复四区划线操作，如此重复2次，直到镜检时，视野中固体平板上的菌体形态一致为止，发现有20株生长较好。用接种环取各单菌落接种于保藏斜面培养基上，于30℃培养24h，取出于4℃冰箱保藏，待鉴定。
固体分离培养基(带BCIP显色液)：每升固体分离培养基由2g的NaAC、180mg的KH2PO4、320mg的K2HPO4、1.5g的(NH4)2SO4、150mg的CaCl2·2H2O、1.7g的MgSO4·7H2O、5mL的微量元素液、10mL的维生素液、15g的琼脂和余量的蒸馏水组成，分离培养基的pH值为7。121℃，25min灭菌。固体培养基冷却到50℃倾倒培养皿，冷却后待用，用之前在固体分离培养基上，用移液枪在琼脂表面上加80μL的BCIP溶液，用涂布器涂匀，在30℃培养箱静置1.5h吸收，待用。
BCIP溶液：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。
4.菌种筛选
4.1好氧Poly-P(奈瑟氏新方法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)
将上述筛选的20株高效聚磷菌进行好氧Poly-P(奈瑟氏新染色法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)，奈瑟氏新染色法颗粒颜色墨绿色、细胞颜色黄棕色，尼罗蓝染色法颗粒颜色偏红、细胞颜色无荧光，结果发现20株两种染色结果皆为阳性，说明两轮BCIP染色培养基的四区划线筛选比一般的分离后BCIP染色筛选准确。
尼罗蓝染色法：挑取一环分离的菌株接种于检测培养基中96h，用移液枪吸取10μL的菌液涂布于载玻片上，用酒精灯火焰固定，置于超净工作台中风干。取0.3mg/mL的尼罗蓝染色液滴在已制备好的厌氧末端污泥涂片上，放入50℃烘箱中，待烘干后用8％冰醋酸脱色2min，然后用蒸馏水清洗3遍，加盖玻片后置于荧光显微镜使用460nm和546nm激发光观察，每种浓度梯度做3次重复。
奈瑟氏新方法染色：上述菌液在超净工作台中酒精灯固冷却后，用5g/L美兰染色液染色2min，用蒸馏水清洗3遍，通风橱中干燥；用奈瑟氏乙液(6g/L黄叱精)复染2min，用蒸馏水清洗3遍清去染色液，自来水冲洗，通风橱中干燥；显微镜观察。
4.2除磷能力检测：
将上述好氧Poly-P和厌氧PHA染色阳性的菌种进行除磷能力检测。
制备种子液及除磷能力检测：在250mL锥形瓶中加入100mL检测培养基，用透气封口膜包好后灭菌，121℃，灭菌25min。取纯化后的平板菌种，在超净工作台中，于无菌的条件下用灭菌后的接种环挑取一环纯菌接入到锥形瓶中，30±0.5℃、160rpm振荡培养15h，停止震荡，室温静止2h。再次好氧振荡培养4～7h，分别在4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h取样，6000转，20min离心后测上清液磷浓度并计算除磷率。最后再将得到的菌液一部分测量OD600值，测量菌液的OD600值应用可见光分光光度计，以稀释4倍的空白培养基为参比，在600nm波长下，测量菌液的吸光度。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。
检测培养基：每升检测培养基包含5gNaAC，0.4gNH4Cl，0.2g牛肉膏，0.4g胰蛋白胨，0.1gKH2PO4，2mL微量元素溶液，其余为水，调节pH至7。
第一轮筛选的蓝色单菌落25株，第二轮筛选的蓝色单菌落23株，将23株进行第三次平板划线分离，有20株单菌落长出，其余3株说明不适应筛选条件被淘汰。对20株进行PHA和Poly-P染色，皆为阳性，除磷能力鉴定20株都具有除磷能力，结果如表4，其中除磷率在65％以上的编号为：P3、P4、P5、P9、P10、P14，最高的除磷率为编号P10的90.25％，分离出的聚磷菌占总菌80.00％；除磷率在50％以上(有明显除磷效果)占55％，比例明显提高。将分离的菌种在BCIP显色液上涂布筛选，聚磷菌检出率86.96％，大大提高筛选的效率和准确性，降低除磷能力检测的工作量，减少菌种测序的成本投入。
表4菌株除磷率
菌株 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10
除磷率 45.63 36.17 77.85 83.26 88.61 42.55 57.98 22.13 77.68 90.25
菌株 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20
除磷率 61.35 55.64 43.25 84.13 49.37 48.25 33.78 64.36 49.25 56.86
5.聚磷菌的16S r DNA序列鉴定：
将纯菌株接种于液体分离培养基(固体分离培养基不加琼脂即为液体分离培养基)中培养24h，取菌液置于5mL离心管中，封口后送生工生物工程股份有限公司进行菌种鉴定。
6.菌种保藏：
菌种保藏培养基为固体LB培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余为水，调节pH至7。LB液体培养基和固体LB培养基一样，不加琼脂，用于菌种扩大培养的-80℃菌种加甘油保藏。保藏培养基分装到试管加塞子，摆放成斜面冷却待用。挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，30℃恒温培养，24h后，0～4℃冷藏留种。
实施例3
1.污泥的预处理：
取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥50mL，涡旋3min、12000rpm离心30s，弃上清，重复3次，再涡旋3min后用于驯化培养以保证菌与泥的分离，与培养基的充分接触；
2.菌种的体外驯化富集：
将上述污泥沉淀倒入盛有100mL厌氧液体培养基的250mL锥形瓶中摇晃混匀，向其中充入氮气，达到厌氧状态，室温静置24h。将锥形中的混合液离心(6000rpm，20min)，弃上清，将污泥沉淀倒入盛有好氧液体培养基三角瓶中，用透气滤膜封口，室温摇床摇23h(30±0.5℃、150rpm)，静置1h。重复上述驯化富集循环，同时监测上清液中的磷浓度，当好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，进行分离；表5中经过3轮厌氧和好氧循环驯化富集，好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降，即可用于分离，说明本接种前污泥的预处理增加菌与培养基的接触对缩短驯化富集周期有显著效果，驯化的培养基配比在适宜范围内的改变不会影响驯化富集周期。
表5厌氧释磷量和好氧吸磷量
Figure BDA0002438553760000161
厌氧液体培养基：每升厌氧培养基是由2g的NaAC、135mg的(NH4)2SO4、12mg的CaCl2·2H2O、175mg的MgSO4·7H2O、0.3mL的微量元素液、0.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7.2。
好氧液体培养基：每升好氧培养基是由135mg的KH2PO4、240mg的K2HPO4、135mg的(NH4)2SO4、12mg的CaCl2·2H2O、175mg的MgSO4·7H2O、0.3mL的微量元素液、0.5mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7.2。
微量元素液：每升微量元素液是由1.5g的FeCl3·6H2O、0.15g的H3BO3，0.04g的CuSO4·5H2O、0.18g的KI、0.13g的MnCl2·4H2O、0.06g的Na2MO4·2H2O、0.12g的ZnSO4·7H2O、0.15g的CoCl2·6H2O和余量的蒸馏水组成。
维生素液：每升维生素液是由50mg的维生素B1、50mg的维生素B2、100mg的维生素B6、2g的维生素B12、10mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸、21mg的生物素和余量的蒸馏水组成。
3.菌种分离
将上述混合液10mL离心(10000rpm，10min)，弃上清，将污泥沉淀打散(磁力搅拌子搅拌2min、冰浴1min、重复2次，再磁力搅拌2min)，用无菌生理盐水90mL(浓度为0.9％氯化钠溶液)稀释成10-2、10-3倍，测OD600在0.1～0.5之间，用移液枪吸100μL 10-2、10-3稀释液于固体分离培养基上，每个稀释度做3个平行，用涂布器涂布于固体分离培养基(加BCIP显色液)平板上，将各涂布完成的培养皿贴好标签、日期，30±0.5℃条件下倒置于培养箱内培养3d(如没有长菌可延长至7d)。挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的30株，用接种针挑取这30株蓝色单菌落并进行序号标记，然后在涂布BCIP的分离培养基上进行四区划线实现菌种纯化与再次BCIP显色液复筛，30±0.5℃培养(约3～7d)，待挑取划线的新菌落长成后，取其中变蓝并且菌体形态不一致的26株在分离培养基上重复四区划线操作，如此重复2次，直到镜检时，视野中固体平板上的菌体形态一致为止，发现有24株生长较好。用接种环取各单菌落接种于保藏斜面培养基上，于30℃培养24h，取出于4℃冰箱保藏，待鉴定。
固体分离培养基(带BCIP显色液)：每升固体分离培养基由2g的NaAC、180mg的KH2PO4、320mg的K2HPO4、1.5g的(NH4)2SO4、150mg的CaCl2·2H2O、1.7g的MgSO4·7H2O、5mL的微量元素液、10mL的维生素液、15g的琼脂和余量的蒸馏水组成，分离培养基的pH值为7。121℃，25min灭菌。固体培养基冷却到50℃倾倒培养皿，冷却后待用，用之前在固体分离培养基上，用移液枪在琼脂表面上加80μL的BCIP溶液，用涂布器涂匀，在30℃培养箱静置1.5h吸收，待用。
BCIP溶液：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。
4.菌种筛选
4.1好氧Poly-P(奈瑟氏新方法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)
将上述筛选的24株高效聚磷菌进行好氧Poly-P(奈瑟氏新染色法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)，奈瑟氏新染色法颗粒颜色墨绿色、细胞颜色黄棕色，尼罗蓝染色法颗粒颜色偏红、细胞颜色无荧光，结果发现24株两种染色结果皆为阳性，说明两轮BCIP染色培养基的四区划线筛选比一般的分离后BCIP染色筛选准确。
尼罗蓝染色法：挑取一环分离的菌株接种于检测培养基中96h，用移液枪吸取10μL的菌液涂布于载玻片上，用酒精灯火焰固定，置于超净工作台中风干。取0.3mg/mL的尼罗蓝染色液滴在已制备好的厌氧末端污泥涂片上，放入50℃烘箱中，待烘干后用8％冰醋酸脱色2min，然后用蒸馏水清洗3遍，加盖玻片后置于荧光显微镜使用460nm和546nm激发光观察，每种浓度梯度做3次重复。
奈瑟氏新方法染色：上述菌液在超净工作台中酒精灯固冷却后，用5g/L美兰染色液染色2min，用蒸馏水清洗3遍，通风橱中干燥；用奈瑟氏乙液(6g/L黄叱精)复染2min，用蒸馏水清洗3遍清去染色液，自来水冲洗，通风橱中干燥；显微镜观察。
4.2除磷能力检测：
将上述好氧Poly-P和厌氧PHA染色阳性的菌种进行除磷能力检测。
制备种子液及除磷能力检测：在250mL锥形瓶中加入100mL检测培养基，用透气封口膜包好后灭菌，121℃，灭菌25min。取纯化后的平板菌种，在超净工作台中，于无菌的条件下用灭菌后的接种环挑取一环纯菌接入到锥形瓶中，30±0.5℃、160rpm振荡培养15h，停止震荡，室温静止2h。再次好氧振荡培养4～7h，分别在4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h取样，6000转，20min离心后测上清液磷浓度并计算除磷率。最后再将得到的菌液一部分测量OD600值，测量菌液的OD600值应用可见光分光光度计，以稀释4倍的空白培养基为参比，在600nm波长下，测量菌液的吸光度。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。
检测培养基：每升检测培养基包含5g NaAC，0.4g NH4Cl，0.2g牛肉膏，0.4g胰蛋白胨，0.1g KH2PO4，2mL微量元素溶液，其余为水，调节pH至7。
第一轮筛选的蓝色单菌落30株，第二轮筛选的蓝色单菌落26株，将26株进行第三次平板划线分离，有24株单菌落长出，其余2株说明不适应筛选条件被淘汰。对24株进行PHA和Poly-P染色，皆为阳性，除磷能力鉴定24株都具有除磷能力，结果如表6，其中除磷率在65％以上的编号为：P3、P5、P7、P10、P13、P15、P18，最高的除磷率为编号P7的92.35％，分离出的聚磷菌占总菌的80.00％；除磷率在50％以上(有明显除磷效果)占54.17％，比例明显提高。将分离的菌种在BCIP显色液上涂布筛选，聚磷菌检出率92.30％，大大提高筛选的效率和准确性，降低除磷能力检测的工作量，减少菌种测序的成本投入。
表6菌株除磷率
菌株 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12
除磷率 34.15 26.99 79.36 48.25 79.33 59.13 92.35 56.03 40.13 74.26 33.48 59.26
菌株 P13 P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24
除磷率 74.36 42.56 84.69 26.33 52.46 86.25 29.46 46.35 53.22 61.54 42.96 48.31
5.聚磷菌的16S r DNA序列鉴定：
将纯菌株接种于液体分离培养基(固体分离培养基不加琼脂即为液体分离培养基)中培养24h，取菌液置于5mL离心管中，封口后送生工生物工程股份有限公司进行菌种鉴定。
6.菌种保藏：
菌种保藏培养基为固体LB培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余为水，调节pH至7。LB液体培养基和固体LB培养基一样，不加琼脂，用于菌种扩大培养的-80℃菌种加甘油保藏。保藏培养基分装到试管加塞子，摆放成斜面冷却待用。挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，30℃恒温培养，24h后，0～4℃冷藏留种。
实施例4
1.污泥的预处理：
取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥50mL，涡旋2min、12000rpm离心30s，弃上清，重复2次，再涡旋2min后用于驯化培养以保证菌与泥的分离，与培养基的充分接触；
2.菌种的体外驯化富集：
将上述污泥沉淀倒入盛有100mL厌氧液体培养基的250mL锥形瓶中摇晃混匀，向其中充入氮气，达到厌氧状态，室温静置24h。将锥形中的混合液离心(6000rpm，20min)，弃上清，将污泥沉淀倒入盛有好氧液体培养基三角瓶中，用透气滤膜封口，室温摇床摇23h(30±0.5℃、150rpm)，静置1h。重复上述驯化富集循环，同时监测上清液中的磷浓度，当好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，进行分离；表7中经过3轮厌氧和好氧循环驯化富集，好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降，即可用于分离，说明接种前污泥的预处理增加菌与培养基的接触对缩短驯化富集周期有显著效果。
表7厌氧释磷量和好氧吸磷量
Figure BDA0002438553760000201
厌氧液体培养基：每升厌氧培养基是由4g的NaAC、140mg的(NH4)2SO4、14mg的CaCl2·2H2O、180mg的MgSO4·7H2O、0.4mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧培养基的pH值为7。
好氧液体培养基：每升好氧培养基是由140mg的KH2PO4、245mg的K2HPO4、140mg的(NH4)2SO4、14mg的CaCl2·2H2O、180mg的MgSO4·7H2O、0.5mL的微量元素液、1mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧培养基的pH值为7。
微量元素液：每升微量元素液是由1.5g的FeCl3·6H2O、0.15g的H3BO3，0.04g的CuSO4·5H2O、0.18g的KI、0.13g的MnCl2·4H2O、0.06g的Na2MO4·2H2O、0.12g的ZnSO4·7H2O、0.15g的CoCl2·6H2O和余量的蒸馏水组成。
维生素液：每升维生素液是由50mg的维生素B1、50mg的维生素B2、100mg的维生素B6、2g的维生素B12、10mg的叶酸、50mg的烟酸、50mg的泛酸钙、50mg的对氨基苯甲酸、21mg的生物素和余量的蒸馏水组成。
3.菌种分离
将上述混合液10mL离心(10000rpm，10min)，弃上清，将污泥沉淀打散(磁力搅拌子搅拌2min、冰浴1min、重复2次，再磁力搅拌2min)，用无菌生理盐水90mL(浓度为0.9％氯化钠溶液)稀释成10-1～10-7倍，用移液枪吸100μL 10-2～10-5稀释液于固体分离培养基上，每个稀释度做3个平行，用涂布器涂布于固体分离培养基平板上，将各涂布完成的培养皿贴好标签、日期，30±0.5℃条件下倒置于培养箱内培养3d(如没有长菌可延长至7d)。挑取菌落形态特征有明显差异的70株，用接种针挑取这70株单菌落并进行序号标记，然后在分离培养基上进行四区划线实现菌种纯化，30±0.5℃培养(约3～7d)，如此重复3次，直到镜检时，视野中固体平板上的菌体形态一致为止，发现有51株生长较好。说明不以OD600在0.1～0.5为参考的梯度稀释涂布工作量大，操作针对性差。用接种环挑取51株单菌落分别在涂布BCIP显色液的分离培养基上进行显色筛选，发现有34株变蓝。此34株单菌落初步定为聚磷菌，用接种环取各变蓝单菌落接种于保藏斜面培养基上，于30℃培养24h，取出于4℃冰箱保藏，待鉴定。
固体分离培养基(带BCIP显色液)：每升固体分离培养基由2g的NaAC、180mg的KH2PO4、320mg的K2HPO4、1.5g的(NH4)2SO4、150mg的CaCl2·2H2O、1.7g的MgSO4·7H2O、5mL的微量元素液、10mL的维生素液、15g的琼脂和余量的蒸馏水组成，分离培养基的pH值为7。121℃，25min灭菌。固体培养基冷却到50℃倾倒培养皿，冷却后待用，用之前在固体分离培养基上，用移液枪在琼脂表面上加80μL的BCIP溶液，用涂布器涂匀，在30℃培养箱静置1.5h吸收，待用。
BCIP溶液：每毫升二甲基甲酰胺包含20mg BCIP，-20℃保存。
4.菌种筛选
4.1好氧Poly-P(奈瑟氏新方法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)
将上述筛选的34株高效聚磷菌进行好氧Poly-P(奈瑟氏新染色法)和厌氧PHA染色(尼罗蓝染色法)，奈瑟氏新染色法颗粒颜色墨绿色、细胞颜色黄棕色，尼罗蓝染色法颗粒颜色偏红、细胞颜色无荧光，结果发现25株两种染色结果皆为阳性，说明与两轮BCIP显色分离同步的方法相比，先分离单菌落再进行BCIP显色液染色鉴定的方法工作量大，筛出率低。
尼罗蓝染色法：挑取一环分离的菌株接种于检测培养基中96h，用移液枪吸取10μL的菌液涂布于载玻片上，用酒精灯火焰固定，置于超净工作台中风干。取0.3mg/mL的尼罗蓝染色液滴在已制备好的厌氧末端污泥涂片上，放入50℃烘箱中，待烘干后用8％冰醋酸脱色2min，然后用蒸馏水清洗3遍，加盖玻片后置于荧光显微镜使用460nm和546nm激发光观察，每种浓度梯度做3次重复。
奈瑟氏新方法染色：上述菌液在超净工作台中酒精灯固冷却后，用5g/L美兰染色液染色2min，用蒸馏水清洗3遍，通风橱中干燥；用奈瑟氏乙液(6g/L黄叱精)复染2min，用蒸馏水清洗3遍清去染色液，自来水冲洗，通风橱中干燥；显微镜观察。
4.2除磷能力检测：
将上述好氧Poly-P和厌氧PHA染色阳性的菌种进行除磷能力检测。
制备种子液及除磷能力检测：在250mL锥形瓶中加入100mL检测培养基，用透气封口膜包好后灭菌，121℃，灭菌25min。取纯化后的平板菌种，在超净工作台中，于无菌的条件下用灭菌后的接种环挑取一环纯菌接入到锥形瓶中，30±0.5℃、160rpm振荡培养15h，停止震荡，室温静止2h。再次好氧振荡培养4～7h，分别在4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h取样，6000转，20min离心后测上清液磷浓度并计算除磷率。最后再将得到的菌液一部分测量OD600值，测量菌液的OD600值应用可见光分光光度计，以稀释4倍的空白培养基为参比，在600nm波长下，测量菌液的吸光度。除磷率高的菌种为高效聚磷菌种。
检测培养基：每升检测培养基包含5gNaAC，0.4gNH4Cl，0.2g牛肉膏，0.4g胰蛋白胨，0.1gKH2PO4，2mL微量元素溶液，其余为水，调节pH至7。
梯度稀释挑取进行四区划线的单菌落70株，四区划线分离的单菌落51株，将51株进行BCIP显色液染色观察，变蓝的单菌落34株，对34株蓝色单菌落进行进行PHA和Poly-P染色，皆为阳性的有25株，除磷能力鉴定结果如表8，其中除磷率在65％以上的编号为：P5、P8、P9、P11、P13、P16，最高的除磷率为编号P5的91.03％，分离出的聚磷菌占35.71％；除磷率在50％以上(有明显除磷效果)占44.00％，比例明显下降。将分离的菌种在BCIP显色液上涂布筛选，聚磷菌检出率66.67％，说明先分离再进行BCIP显色液筛选不仅工作量大，而且聚磷菌检出率低。
表8菌株除磷率
Figure BDA0002438553760000231
5.聚磷菌的16S r DNA序列鉴定：
将纯菌株接种于液体分离培养基(固体分离培养基不加琼脂即为液体分离培养基)中培养24h，取菌液置于5mL离心管中，封口后送生工生物工程股份有限公司进行菌种鉴定。
6.菌种保藏：
菌种保藏培养基为固体LB培养基，每升包含10g的胰蛋白胨，5g的酵母膏，10g的NaCl，15g的琼脂，其余为水，调节pH至7。LB液体培养基和固体LB培养基一样，不加琼脂，用于菌种扩大培养的-80℃菌种加甘油保藏。保藏培养基分装到试管加塞子，摆放成斜面冷却待用。挑取蓝色菌落到LB试管斜面培养基上划线，30℃恒温培养，24h后，0～4℃冷藏留种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从生物膜反应器活性污泥中富集分离高效聚磷菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取运行状态良好的生物膜反应器活性污泥，涡旋、离心后弃上清，对离心后沉淀再涡旋，得预处理污泥；
(2)在厌氧状态下，将所述预处理污泥接种到厌氧液体培养基中静置24h，离心弃上清；将离心后的沉淀接种于好氧液体培养基中，有氧培养23h后，静置1h；
所述厌氧液体培养基中包括以下浓度的成分：2～5g/L的NaAC、135～145mg/L的(NH4)2SO4、12～16mg/L的CaCl2·2H2O、175～185mg/L的MgSO4·7H2O、0.3～0.5mL/L的微量元素液和0.5～1mL/L的维生素液；
所述好氧液体培养基中包括以下浓度的成分：135～145mg/L的KH2PO4、240～250mg/L的K2HPO4、135～145mg/L的(NH4)2SO4、12～16mg/L的CaCl2·2H2O、175～185mg/L的MgSO4·7H2O、0.3～0.5mL/L的微量元素液和0.5～1mL/L的维生素液；
(3)重复步骤(2)至好氧吸磷量/厌氧释磷量比值下降时，停止循环，得体外富集驯化菌液；其中：
厌氧释磷量＝厌氧初期磷含量-厌氧末期磷含量式Ⅰ；
好氧吸磷量＝好氧末期磷含量-好氧初期磷含量式Ⅱ；
(4)将所述体外富集驯化菌液离心后弃上清，利用生理盐水将离心后的菌体沉淀稀释，取OD600值为0.1～0.5之间的稀释液接种于固体分离培养基上培养2～3d，挑取菌落形态特征有明显差异并且变蓝的单菌落，重复在所述固体分离培养基上进行四区划线，收集所述固体分离培养基上形态一致的菌体，得高效聚磷菌；
所述固体分离培养基中含有BCIP显色液，还包括以下浓度的成分：2～3g/L的NaAC、180mg/L的KH2PO4、320mg/L的K2HPO4、1.4～1.6g/L的(NH4)2SO4、150mg/L的CaCl2·2H2O、1.7g/L的MgSO4·7H2O、3～5mL/L的微量元素液、10mL/L的维生素液和15g/L的琼脂。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的转速为12000rpm，所述离心的时间为30s。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的转速为6000rpm，所述离心的时间为20min。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述有氧培养在摇床上进行，所述摇床的转速为150rpm，所述有氧培养的温度为30±0.5℃。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述离心的转速为10000rpm，所述离心的时间为10min。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)中利用生理盐水将离心后的菌体沉淀稀释成10-1～10-7倍。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)中所述微量元素液包括以下浓度的成分：1.4～1.6g/L的FeCl3·6H2O、0.14～0.16g/L的H3BO3，0.03～0.05g/L的CuSO4·5H2O、0.17～0.19g/L的KI、0.12～0.14g/L的MnCl2·4H2O、0.05～0.07g/L的Na2MO4·2H2O、0.11～0.13g/L的ZnSO4·7H2O和0.14～0.16g/L的CoCl2·6H2O。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)中所述维生素液包括以下浓度的成分：50～52mg/L的维生素B1、50～55mg/L的维生素B2、90～100mg/L的维生素B6、2～3g/L的维生素B12、8～10mg/L的叶酸、50～55mg/L的烟酸、50～55mg/L的泛酸钙、50～55mg/L的对氨基苯甲酸和20～21mg/L的生物素。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(4)得到高效聚磷菌后，还包括对所述高效聚磷菌进行好氧Poly-P和厌氧PHA染色。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，经过好氧Poly-P和厌氧PHA染色验证后的高效聚磷菌，还包括菌种保存，所述菌种保存为在固体LB培养基上进行。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112645448A (zh) * 2020-11-30 2021-04-13 苏州科技大学 一种应用于生物膜法回收磷工艺的变容积式运行方法
CN113637625A (zh) * 2021-08-18 2021-11-12 佛山市南海区苏科大环境研究院 高效聚磷菌的获取方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560470A (zh) * 2009-05-22 2009-10-21 哈尔滨工业大学 强化生物除磷功能菌筛选用培养基及筛选强化生物除磷功能菌的方法
CN102268373A (zh) * 2011-07-17 2011-12-07 北京工业大学 一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法
CN102943055A (zh) * 2012-11-06 2013-02-27 沈阳建筑大学 生物除磷微生物筛选用培养基
CN107312715A (zh) * 2017-06-15 2017-11-03 武汉理工大学 一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101560470A (zh) * 2009-05-22 2009-10-21 哈尔滨工业大学 强化生物除磷功能菌筛选用培养基及筛选强化生物除磷功能菌的方法
CN102268373A (zh) * 2011-07-17 2011-12-07 北京工业大学 一种在活性污泥中快速筛选聚磷菌的方法
CN102943055A (zh) * 2012-11-06 2013-02-27 沈阳建筑大学 生物除磷微生物筛选用培养基
CN107312715A (zh) * 2017-06-15 2017-11-03 武汉理工大学 一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIO KURODA 等: "A Simple Method to Release Polyphosphate from Activated Sludge for Phosphorus Reuse and Recycling", 《BIOTECHNOL BIOENG》 *
亢涵等: "两相法筛选高效除磷菌的研究", 《环境科学与管理》 *
伍思宇 等: "海南东寨港红树林聚磷菌的筛选及其特性", 《应用与环境生物学报》 *
周明璟 等: "厌氧/好氧交替快速筛选聚磷菌及其生理特性的研究", 《中国环境科学》 *
张华: "生物除磷工艺中高效聚磷菌的快速筛选和鉴定", 《安徽建筑大学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112645448A (zh) * 2020-11-30 2021-04-13 苏州科技大学 一种应用于生物膜法回收磷工艺的变容积式运行方法
CN112645448B (zh) * 2020-11-30 2022-08-02 苏州科技大学 一种应用于生物膜法回收磷工艺的变容积式运行方法
CN113637625A (zh) * 2021-08-18 2021-11-12 佛山市南海区苏科大环境研究院 高效聚磷菌的获取方法

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