CN102943055A - 生物除磷微生物筛选用培养基 - Google Patents
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Abstract
生物除磷微生物筛选用培养基，它涉及一种除磷微生物筛选用培养基。本发明解决了现有的筛选用培养基针对性差，得到微生物的菌株数量少及所用的培养基不适合生物除磷微生物生长的问题。筛选用培养基为厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基；方法：一、配制培养基；二、取污泥；三、厌氧富集培养基；四、好氧富集培养基；六、厌氧富集培养基；七、循环操作四至六2～4次；八、等梯度稀释；九、固体培养基；十、液体培养基；十一、重复八至十3～8次；十二、检测。本发明培养基针对性强，筛选得到的除磷微生物数量多，适合除磷微生物的生长。
Description
技术领域
本发明涉及一种除磷微生物筛选用培养基。
背景技术
目前筛选生物除磷微生物的方法是将从生物除磷系统中取出的污泥置于含有牛肉膏蛋白胨培养基的摇瓶中发酵培养，再将发酵培养后的菌液稀释，然后涂布于固体传统培养基进行筛选得到生物除磷微生物，但该方法还存在以下问题：1、该法针对性差，所以在培养过程中非生物除磷微生物大量繁殖，杂菌滋生，导致生物除磷微生物的比例下降，所分离得到生物除磷微生物的菌株数量少，仅占分离得到的全部菌株数的15%左右；2、该法所采用的营养肉汤培养基中营养成分不合理，使得培养过程中生物除磷微生物的生长受到限制。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的筛选生物除磷微生物的方法针对性差，得到生物除磷微生物的菌株数量少及所用的培养基不适合生物除磷微生物生长的问题。而提供了一种生物除磷微生物筛选用培养基及筛选生物除磷微生物的方法。
本发明生物除磷微生物筛选用培养基为生物除磷微生物所依次进行筛选用的四种培养基，按照用于筛选的顺序四种培养基分别为厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基；生物除磷微生物筛选用的培养基为厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基；其中每升厌氧富集培养基是由0.3~0.5g的NaAc、270~290mg的(NH4)2SO4、27~29mg的CaCl2·2H2O、350~370mg的MgSO4·7H2O、0.5~0.7mL的微量元素液、1.8~2.4mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升好氧富集培养基是由270~290mg的KH2PO4、480~500mg的K2HPO4、260~300mg的(NH4)2SO4、26~30mg的CaCl2·2H2O、340~380mg的MgSO4·7H2O、0.5~1.2mL的微量元素液、1.5~3mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升固体培养基由0.3~0.5g的NaAc、68~76mg的KH2PO4、128~132mg的K2HPO4、2.4~2.8g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.2~4g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液、28~32g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体培养基的pH值为6.9~7.4；每升液体培养基是由0.3~0.5g的NaAc、70~74mg的KH2PO4、125~135mg的K2HPO4、2.2~3g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.4~3.8g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体培养基的pH值为6.9~7.4。
在厌氧富集培养基的培养过程中，生物除磷微生物分解体内的聚磷颗粒或糖原释放能量吸收NaAc形成聚-beta-羟基-链烷酸酯（PHAs）；在好氧富集培养基培养过程中，生物除磷微生物在没有外部碳源的情况下，分解在体内的的PHAs作为能量来源吸收磷酸盐或合成糖原；本发明的培养基中的营养成分合理，与现有的筛选用的牛肉膏蛋白胨培养基相比，本发明的培养基针对性强，适合生物除磷微生物的生长，杂菌数量少，所分离得到的生物除磷微生物数量多，占分离得到的全部菌株数的70%。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式生物除磷微生物筛选用培养基为生物除磷微生物所依次进行筛选用的四种培养基，按照用于筛选的顺序四种培养基分别为厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基；其中每升厌氧富集培养基是由0.3~0.5g的NaAc、270~290mg的(NH4)2SO4、27~29mg的CaCl2·2H2O、350~370mg的MgSO4·7H2O、0.5~0.7mL的微量元素液、1.8~2.4mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升好氧富集培养基是由270~290mg的KH2PO4、480~500mg的K2HPO4、260~300mg的(NH4)2SO4、26~30mg的CaCl2·2H2O、340~380mg的MgSO4·7H2O、0.5~1.2mL的微量元素液、1.5~3mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升固体培养基由0.3~0.5g的NaAc、68~76mg的KH2PO4、128~132mg的K2HPO4、2.4~2.8g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.2~4g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液、28~32g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体培养基的pH值为6.9~7.4；每升液体培养基是由0.3~0.5g的NaAc、70~74mg的KH2PO4、125~135mg的K2HPO4、2.2~3g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.4~3.8g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体培养基的pH值为6.9~7.4。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基中的微量元素液中FeCl3·6H2O的浓度为2.5~3.5g/L、H3BO3的浓度为0.25~0.35g/L，CuSO4·5H2O的浓度为0.05~0.07g/L、KI的浓度为0.32~0.4g/L、MnCl2·4H2O的浓度为0.2~0.28g/L、Na2MO4·2H2O的浓度为0.1~0.14g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.2~0.28g/L和CoCl2·6H2O的浓度为0.28~0.32g/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基中的维生素液由浓度为80~120mg/L的维生素B1、浓度为80~120mg/L的维生素B2、浓度为180~220mg/L维生素B6、浓度为1.8~2.2g/L的维生素B12、浓度为36~44mg/L的叶酸、浓度为80~120mg/L的烟酸，浓度为80~120mg/L的泛酸钙、浓度为80~120mg/L的对氨基苯甲酸和浓度为36~44mg/L的生物素组成。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式筛选生物除磷微生物的方法按照以下步骤进行：一、配制如具体实施一所述的厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基；二、收集污泥沉淀：取生物除磷反应器中好氧结束的污泥100ml进行离心，弃上清，留沉淀，将沉淀置于100mL的血清瓶中；三、将100ml步骤一配制的厌氧富集培养基倒于步骤二的血清瓶中与血清瓶中的污泥沉淀混合均匀，向血清瓶中充入氮气10分钟，然后在室温条件下静止培养24~28h；四、好氧富集培养基培养：将步骤三培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有100ml的步骤一配制的好氧富集培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养24~28h；五、厌养培养基培养：将步骤四培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有100ml步骤一配制的厌氧富集培养基的100mL血清瓶中，向血清瓶中充入氮气10分钟，在室温条件下静止培养24~28h；六、循环操作步骤四至五3~5次，对活性污泥进行驯化，得到厌氧富集培养基培养后的菌液；七、将步骤六培养后的菌液离心，去上清，将离心后的沉淀放入含有100ml的步骤一配制的好氧富集培养基的150mL三角瓶中，在室温条件下摇床培养24~28h；八、取1mL步骤七摇床培养后的菌液进行等梯度稀释；九、用平板涂布法将稀释的菌液接种到步骤一配制的固体培养基中，在室温条件下培养24~48h；十、挑取步骤九中固体培养基上的单菌落接种到步骤一配制的液体培养基中，在室温条件下培养24~28h；十一、重复操作步骤八至十5~8次获得纯菌株；十二、对步骤九得到的纯菌株进行除磷性能检测和镜检，确定筛选得到的纯菌株为生物除磷微生物。
本实施方式步骤一中每升厌氧富集培养基是由0.3~0.5g的NaAc、270~290mg的(NH4)2SO4、27~29mg的CaCl2·2H2O、350~370mg的MgSO4·7H2O、0.5~0.7mL的微量元素液、1.8~2.4mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升好氧富集培养基是由270~290mg的KH2PO4、480~500mg的K2HPO4、260~300mg的(NH4)2SO4、26~30mg的CaCl2·2H2O、340~380mg的MgSO4·7H2O、0.5~1.2mL的微量元素液、1.5~3mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升固体培养基由0.3~0.5g的NaAc、68~76mg的KH2PO4、128~132mg的K2HPO4、2.4~2.8g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.2~4g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液、28~32g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体培养基的pH值为6.9~7.4；每升液体培养基是由0.3~0.5g的NaAc、70~74mg的KH2PO4、125~135mg的K2HPO4、2.2~3g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.4~3.8g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体培养基的pH值为6.9~7.4。
本实施方式厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基中的微量元素液中FeCl3·6H2O的浓度为2.5~3.5g/L、H3BO3的浓度为0.25~0.35g/L，CuSO4·5H2O的浓度为0.05~0.07g/L、KI的浓度为0.32~0.4g/L、MnCl2·4H2O的浓度为0.2~0.28g/L、Na2MO4·2H2O的浓度为0.1~0.14g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.2~0.28g/L和CoCl2·6H2O的浓度为0.28~0.32g/L。
本实施方式厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基中的维生素液由浓度为80~120mg/L的维生素B1、浓度为80~120mg/L的维生素B2、浓度为180~220mg/L维生素B6、浓度为1.8~2.2g/L的维生素B12、浓度为36~44mg/L的叶酸、浓度为80~120mg/L的烟酸，浓度为80~120mg/L的泛酸钙、浓度为80~120mg/L的对氨基苯甲酸和浓度为36~44mg/L的生物素组成。
本实施方式步骤四中将离心后的沉淀放入含有步骤一配制的好氧富集培养基的瓶中，然后用透气滤膜封口。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤二中的污泥在转速为5000~6000转/分的条件下，离心10~15分钟。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五不同的是步骤四、步骤五和步骤七中离心转速均为5000~6000转/分，离心时间均为10~15分钟。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是步骤九中等梯度稀释的稀释梯度倍数为101~109倍。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。
本实施方式共分离得到了32株菌，将这32株菌分别进行测序，测序结果显示，有8株菌为戴尔福特菌属(Delftiasp)的菌株，有6株菌为病菌/绿脓杆菌属 (Pseudomonas sp)_的菌株，有14株菌为不动杆菌属(Acinetobactersp)的菌株，有1株菌为寡养单胞菌属(Stenotrophomonassp)的菌株，有1株菌为副球菌属(Paracoccussp)的菌株，有1株菌为气单胞菌属(Aeromonassp)的菌株，有1株菌为短芽孢杆菌属(Brevibacillussp)的菌株；本实施方式分离得到了的菌株中有15株菌具有明显的除磷能力为聚磷菌，占总筛菌数的46.9%；通过镜检观察确定分离得到纯菌株中具有四聚体形态的菌株有12株菌，即有12株菌为聚糖菌，占总筛菌数的37.5%，关于聚糖菌在Oehmen A与《Journal of Biotechnology》上发表的一篇名为《聚磷菌和聚糖菌对乙酸和丙酸碳源的竞争》的文章中也有记载。本实施方式分离得到的生物除磷微生物占分离得到的全部菌株的84.4%，生物除磷微生物的数量多；而采用现有的牛肉膏蛋白胨培养基筛选生物除磷微生物方法由于针对性差，所用的牛肉膏蛋白胨培养基培养基不适合生物除磷微生物，杂菌多，该法分离得到的生物除磷微生物的数量极少，仅为15%左右。
将本实施方式获得的32株菌进行性能检测，检测结果如表1所示，其中除磷率低于20%的为非除磷微生物。
表1
| 种属 | 菌株 | 除磷率（%） |
| Acinetobacter sp. | P38 | 8.9 |
| Acinetobacter sp. | P19 | 23 |
| Acinetobacter sp. | P4 | 100 |
| Acinetobacter sp. | P10 | 90.2 |
| Acinetobacter sp. | P43 | 28.5 |
| Acinetobacter sp. | P48 | 33.6 |
| Acinetobacter sp. | P23 | 41 |
| Acinetobacter sp. | P22 | 37.5 |
| Acinetobacter sp. | P13 | 98.4 |
| Acinetobacter sp. | P42 | 32 |
| Acinetobacter sp. | P47 | 42.8 |
| Acinetobacter sp. | P21 | 34.5 |
| Acinetobacter sp. | P33 | 65 |
| Acinetobacter sp. | P46 | 21.1 |
| Delftia sp. | P1 | 66 |
| Delftia sp. | P3 | 100 |
| Delftia sp. | P45 | 33 |
| Delftia sp. | P24 | 36.2 |
| Delftia sp. | P40 | 6.5 |
| Delftia sp. | P11 | 52.5 |
| Delftia sp. | P39 | 27.7 |
| Delftia sp. | P30 | 11.5 |
| Pseudomonas sp. | P2 | 97.3 |
| Pseudomonas sp. | P34 | 13.5 |
| Pseudomonas sp. | P12 | 72 |
| Pseudomonas sp. | P22 | 95.8 |
| Pseudomonas sp. | P7 | 92.5 |
| Pseudomonas sp. | P16 | 96 |
| Aeromonas sp. | P35 | 14.6 |
| Brevibacillus sp. | P26 | 84 |
| Stenotrophomonas sp. | P8 | 96.4 |
| Paracoccus sp. | P20 | 82.5 |
从表1中可以看出，本实施方式筛选得到的生物除磷微生物的除磷率可达到100%，除磷效果好。
Claims (3)
1.生物除磷微生物筛选用培养基，其特征在于所述的筛选用培养基为生物除磷微生物所依次进行筛选用的四种培养基，按照用于筛选的顺序四种培养基分别为厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基；其中每升厌氧富集培养基是由0.3~0.5g的NaAc、270~290mg的(NH4)2SO4、27~29mg的CaCl2·2H2O、350~370mg的MgSO4·7H2O、0.5~0.7mL的微量元素液、1.8~2.4mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，厌氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升好氧富集培养基是由270~290mg的KH2PO4、480~500mg的K2HPO4、260~300mg的(NH4)2SO4、26~30mg的CaCl2·2H2O、340~380mg的MgSO4·7H2O、0.5~1.2mL的微量元素液、1.5~3mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，好氧富集培养基的pH值为6.9~7.4；每升固体培养基由0.3~0.5g的NaAc、68~76mg的KH2PO4、128~132mg的K2HPO4、2.4~2.8g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.2~4g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液、28~32g的琼脂和余量的蒸馏水组成，固体培养基的pH值为6.9~7.4；每升液体培养基是由0.3~0.5g的NaAc、70~74mg的KH2PO4、125~135mg的K2HPO4、2.2~3g的(NH4)2SO4、260~300mg的CaCl2·2H2O、3.4~3.8g的MgSO4·7H2O、5~9mL的微量元素液、15~25mL的维生素液和余量的蒸馏水组成，液体培养基的pH值为6.9~7.4。
2.根据权利要求1所述的生物除磷微生物筛选用培养基，其特征在于厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基中的微量元素液中FeCl3·6H2O的浓度为2.5~3.5g/L、H3BO3的浓度为0.25~0.35g/L，CuSO4·5H2O的浓度为0.05~0.07g/L、KI的浓度为0.32~0.4g/L、MnCl2·4H2O的浓度为0.2~0.28g/L、Na2MO4·2H2O的浓度为0.1~0.14g/L、ZnSO4·7H2O的浓度为0.2~0.28g/L和CoCl2·6H2O的浓度为0.28~0.32g/L。
3.根据权利要求1或2所述的生物除磷微生物筛选用培养基，其特征在于厌氧富集培养基、好氧富集培养基、固体培养基和液体培养基中的维生素液中维生素B1的浓度为80~120mg/L、维生素B2浓度为80~120mg/L、维生素B6的浓度为180~220mg/L、维生素B12的浓度为1.8~2.2g/L、叶酸的浓度为36~44mg/L、烟酸的浓度为80~120mg/L，泛酸钙的浓度为80~120mg/L、对氨基苯甲酸的浓度为80~120mg/L和生物素的浓度为36~44mg/L。
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Legal Events
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130227 |