CN114437999A - 一种铁还原菌群及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种铁还原菌群及其应用，该铁还原菌群利用污染土壤为菌株筛选的源土壤，采用柠檬酸铁培养基进行富集培养，最终获得铁还原菌群，所述铁还原菌群在属水平上的组成主要包括Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas。所述铁还原菌群应用在除磷中，在柠檬酸铁培养基中还原Fe(III)，在1‑2天内能快速合成蓝铁矿，实现对水体中磷的高效去除。

Description

一种铁还原菌群及其应用
技术领域
本发明属于菌株技术领域，具体涉及一种利用污染土壤为菌株筛选的源土壤富集获得铁还原菌群，及其有效还原Fe(III)快速生物合成蓝铁矿，在水体除磷方面的应用。
背景技术
蓝铁矿因具有磷含量较高、易于获取、释放缓慢等特点，已被应用于环境、农业、化工以及其他领域。蓝铁矿（Vivianite）是一种磷矿石，化学分子式为Fe3(PO4)2·8H2O，属于单斜晶体，P2O5折标含量为28.3%，FeO为45%。蓝铁矿是一种生物次生矿，其形成与微生物的异化铁还原作用密切相关，目前已有多项有关微生物合成蓝铁矿回收磷的专利和文献。专利CN109626570A涉及一种基于AAO/AO工艺的蓝铁矿结晶前置除磷方法，在异化铁还原菌的作用下将Fe(III)还原为Fe(II)，然后与磷结合形成蓝铁矿。专利CN112661266A报道了一种利用生物膜法富集磷及回收蓝铁矿的工艺，通过提高生物膜反应器内的溶解氧获得高蓄磷量，从而在低碳源浓度下获得高浓度的磷回收液，降低了工艺成本，提高了工艺效率。王芙仙等（王芙仙等. "铁还原细菌Shewanella oneidensis MR-4诱导水合氧化铁形成蓝铁矿的过程" 微生物学报 058.004(2018):573-583.）发现铁还原细菌Shewanella oneidensisMR-4可诱导水合氧化铁形成蓝铁矿，结果表明约16 d时，反应体系中开始出现蓝铁矿晶体颗粒。李楠课题组采用Geobacter sulfurreducens PCA作为生成蓝铁矿的主要功能微生物，发现第6 d，逐渐形成了长度为2-10 μm的蓝铁矿。从现有文献来看，目前已报道的合成蓝铁矿的铁还原菌主要为地杆菌属（Geobacter）和希瓦氏菌属（Shewanella）这两类，这两类还原菌制备蓝铁矿时时间周期较长，效率低，成本较高。
为此，本发明提供一种利用污染土壤为生物源富集铁还原菌群的方法，及该菌群在有效还原Fe(III)快速生物合成蓝铁矿，实现水体中磷去除方面的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是，提供一种利用污染土壤为生物源富集获得新型铁还原菌群，及该菌群在有效还原Fe(III)快速生物合成蓝铁矿，同步除磷方面的应用。该方法以污染土壤为菌株筛选的源土壤，采用柠檬酸铁培养基进行富集培养，最终获得一种新型的铁还原菌群，进一步利用富集获得的铁还原菌群对Fe(III)的还原作用，在柠檬酸铁培养基中还原Fe(III)生成Fe(II)，快速（1-2天）合成蓝铁矿（Fe3(PO4)2·8H2O），有效去除水体中的磷。
本发明解决所述技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种铁还原菌群，该铁还原菌群利用污染土壤为菌株筛选的源土壤，采用柠檬酸铁培养基进行富集培养，最终获得铁还原菌群，所述铁还原菌群在属水平上的组成主要包括Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas。
所述铁还原菌群在属水平上的主要组成为：Enterobacter（49%）、Shewanella（13%）、Acinetobacter（12%）、Petrimonas（11%）、Aeromonas（5%）。
第二方面，本发明提供一种上述的铁还原菌群的应用，所述铁还原菌群应用在除磷中，在柠檬酸铁培养基中还原Fe(III)，在1-2天内能快速合成蓝铁矿，实现对水体中磷的高效去除。
第三方面，本发明提供一种快速生物合成蓝铁矿方法，该方法的具体步骤是：
（1）采自污染场地的污染土壤，将污染土壤冰盒保存，24小时内带回实验室，放入厌氧培养箱内，用于铁还原菌群的富集；
（2）所述的铁还原菌群的富集过程为：富集培养实验在厌氧手套箱中进行，实验采用40 mL培养瓶，称取5-20 g污染土壤样品加入到装有20-80 mL经高温灭菌冷却后的生理盐水的三角瓶中，充分涡旋混匀后，在厌氧箱中静置1-5 h；将涡旋混匀静置后的1-6 mL的土壤上清液和5-30 mL柠檬酸铁培养基加入40 mL透明培养瓶中，25-35℃恒温避光在厌氧培养箱中培养，每隔一天摇匀，待溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色时，取培养瓶中的菌悬液转接至新的柠檬酸铁培养基中富集培养，待溶液颜色再次由棕黄色变成蓝黑色时，连续转接富集培养3-5次后获得铁还原菌群；
所述柠檬酸铁培养基组分为：2.5-3.5 g/L柠檬酸铁、1 g/L NH4Cl、0.07 g/LCaCl2·2H2O、0.6 g/L MgSO4·7H2O、0.722 g/L K2HPO4·3H2O、0.25 g/L KH2PO4、0.5-2 g/L葡萄糖、0.5-1.5 mL微量元素储备液、1-3 mL维生素溶液、0.0771 g/L DL-dithiothreitol。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH = 7.0-7.4，培养基高压灭菌冷却后备用；
微量元素储备液组分：10 mL/L HCl、1.5 g/L FeCl2·4H2O、0.19 g/L CoCl2·6H2O、0.1 g/L MnCl2·4H2O、0.07 g/L ZnCl2、0.006 g/L H3BO3、0.036 g/L Na2MoO4·2H2O、0.024 g/L NiCl2·6H2O、0.002 g/L CuCl2·2H2O；
维生素溶液组分：0.00002 g/L Biotin（生物素）、0.00002 g/L Folic acid（维生素B）、0.0001 g/L Pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇）、0.00005 g/L Riboflavin（核黄素）、0.00005 g/L Thiamine（维生素B1）、0.00005 g/L Nicotinic acid（烟酸）、0.00005 g/L Pantothenic acid（泛酸）、0.00005 g/L p-aminobenzoic acid（对氨基苯甲酸）、0.00005 g/L Thioctic acid（硫辛酸）、0.000001 g/L Vitamin B12（维生素B12）；
（3）铁还原菌群扩大培养合成蓝铁矿：实验在厌氧培养箱中进行，将步骤（2）中富集获得的铁还原菌群在液体LB培养基中培养至对数期，用0.85%的生理盐水进行离心清洗3次，并用生理盐水悬浮；在40 mL培养瓶中，接入10-20 mL柠檬酸铁培养基，然后接入1-4 mL用0.85%的生理盐水悬浮的对数期菌液，将培养瓶置于厌氧培养箱内25-35℃恒温培养，培养1-2 d，观察培养基颜色由棕黄色变为蓝黑色，表明铁还原菌群还原Fe(III)合成了蓝铁矿。
第四方面，本发明提供一种快速生物合成蓝铁矿方法，该方法是：
获得铁还原菌群，所述铁还原菌群在属水平上的组成主要包括Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas；
在厌氧培养箱中进行，将获得的铁还原菌群在液体LB培养基中培养至对数期，用0.85%的生理盐水进行离心清洗3次，并用生理盐水悬浮；在40 mL培养瓶中，接入10-20 mL柠檬酸铁培养基，然后接入1-4 mL用0.85%的生理盐水悬浮的对数期菌液，将培养瓶置于厌氧培养箱内25-35℃恒温培养，培养1-2 d，观察培养基颜色由棕黄色变为蓝黑色，表明铁还原菌群还原Fe(III)合成了蓝铁矿；
所述柠檬酸铁培养基组分为：2.5-3.5 g/L柠檬酸铁、1 g/L NH4Cl、0.07 g/LCaCl2·2H2O、0.6 g/L MgSO4·7H2O、0.722 g/L K2HPO4·3H2O、0.25 g/L KH2PO4、0.5-2 g/L葡萄糖、0.5-1.5 mL微量元素储备液、1-3 mL维生素溶液、0.0771 g/L DL-dithiothreitol；用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH = 7.0-7.4，培养基高压灭菌冷却后备用；
微量元素储备液组分：10 mL/L HCl、1.5 g/L FeCl2·4H2O、0.19 g/L CoCl2·6H2O、0.1 g/L MnCl2·4H2O、0.07 g/L ZnCl2、0.006 g/L H3BO3、0.036 g/L Na2MoO4·2H2O、0.024 g/L NiCl2·6H2O、0.002 g/L CuCl2·2H2O；
维生素溶液组分：0.00002 g/L Biotin（生物素）、0.00002 g/L Folic acid（维生素B）、0.0001 g/L Pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇）、0.00005 g/L Riboflavin（核黄素）、0.00005 g/L Thiamine（维生素B1）、0.00005 g/L Nicotinic acid（烟酸）、0.00005 g/L Pantothenic acid（泛酸）、0.00005 g/L p-aminobenzoic acid（对氨基苯甲酸）、0.00005 g/L Thioctic acid（硫辛酸）、0.000001 g/L Vitamin B12（维生素B12）。
本发明中所述污染土壤中至少要存在4-氯苯胺、苯并（a）芘和邻（对）硝基氯苯三种有机污染物，其中优选地，三者在土壤中的浓度分别为：10-30 mg/kg、1.5-5.5 mg/kg、32-95 mg/kg。所述污染土壤中还可以含有砷、铅、三氯甲烷等。
铁还原菌可以利用不同有机物作为电子供体还原Fe(III)并在细胞外诱导形成蓝铁矿等含Fe(II)矿物。在还原条件下，磷（主要是HPO4 2-和PO4 3-）吸附在Fe(III)氧化物表面或与Fe3+在液相中共沉淀形成FePO4。在铁还原菌的作用下，Fe(III)氧化物与吸附在表面的磷酸盐进一步被还原溶解，释放出Fe2+、HPO4 2-和PO4 3-。FePO4也可被铁还原菌还原，并在酸性条件下进一步溶解，释放出Fe2+和PO4 3-。当这些离子的浓度达到其溶度积常数（Ksp = 10-36）时，便会产生蓝铁矿沉淀。蓝铁矿生成的反应方程式如下：
Figure 578945DEST_PATH_IMAGE001
。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明方法以污染土壤为微生物来源，在柠檬酸铁培养基中还原Fe(III)，在1-2天内能快速合成蓝铁矿，实现对水体中磷的高效去除；
（2）本发明提供了一种绿色环保、成本低廉、工艺简单的利用铁还原菌群在柠檬酸铁培养基中快速合成蓝铁矿并同步除磷的方法。
附图说明
图1 铁还原菌群的组成（属水平）示意图。
图2 利用铁还原菌群合成的蓝铁矿的SEM分析图。
图3 利用铁还原菌群合成的蓝铁矿的XRD分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
实施例1
本实施例快速生物合成蓝铁矿方法的具体步骤是：
（1）采自江苏省南京市某污染场地的污染土壤，土壤中的主要污染物为4-氯苯胺、苯并（a）芘、邻（对）硝基氯苯，将污染土壤冰盒保存，24小时内带回实验室，放入厌氧培养箱内，用于铁还原菌群的富集。
（2）所述的铁还原菌群的富集过程为：富集培养实验在厌氧手套箱中进行，实验采用40 mL培养瓶，称取5 g污染土壤样品加入到20 mL经高温灭菌冷却后的生理盐水溶液中,充分涡旋混匀后，在厌氧箱中静置2 h；将涡旋混匀静置后的1 mL的土壤上清液和15 mL柠檬酸铁培养基加入40 mL透明培养瓶中，30℃恒温避光在厌氧培养箱中培养，每隔一天摇匀，待溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色时，取培养瓶中的菌悬液转接至新的柠檬酸铁培养基中富集培养，待溶液颜色再次由棕黄色变成蓝黑色时，连续转接富集培养3-5次后获得铁还原菌群；
所述柠檬酸铁培养基组分为：2.5-3.5 g/L柠檬酸铁、1 g/L NH4Cl、0.07 g/LCaCl2·2H2O、0.6 g/L MgSO4·7H2O、0.722 g/L K2HPO4·3H2O、0.25 g/L KH2PO4、0.5-2 g/L葡萄糖、0.5-1.5 mL微量元素储备液、1-3 mL维生素溶液、0.0771 g/L DL-dithiothreitol。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH = 7.0-7.4，培养基高压灭菌冷却后备用；
微量元素储备液组分：10 mL/L HCl、1.5 g/L FeCl2·4H2O、0.19 g/L CoCl2·6H2O、0.1 g/L MnCl2·4H2O、0.07 g/L ZnCl2、0.006 g/L H3BO3、0.036 g/L Na2MoO4·2H2O、0.024 g/L NiCl2·6H2O、0.002 g/L CuCl2·2H2O；
维生素溶液组分：0.00002 g/L Biotin（生物素）、0.00002 g/L Folic acid（维生素B）、0.0001 g/L Pyridoxine hydrochloride（盐酸吡哆醇）、0.00005 g/L Riboflavin（核黄素）、0.00005 g/L Thiamine（维生素B1）、0.00005 g/L Nicotinic acid（烟酸）、0.00005 g/L Pantothenic acid（泛酸）、0.00005 g/L p-aminobenzoic acid（对氨基苯甲酸）、0.00005 g/L Thioctic acid（硫辛酸）、0.000001 g/L Vitamin B12（维生素B12）。
（3）将获得的铁还原菌群转接到液体LB培养基中扩大培养，在液体LB培养基中培养至对数期，离心收集后，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行16S rDNA扩增子测序，鉴定该铁还原菌群的组成，图1为铁还原菌群的组成（属水平）。从图1中可以看出，本实施例从污染土壤中富集获得一种新的、可有效还原Fe(III)的铁还原菌群，通过16S rDNA扩增子测序鉴定该菌群在属水平上的组成主要为Enterobacter（49%）、Shewanella（13%）、Acinetobacter（12%）、Petrimonas（11%）、Aeromonas（5%）。
铁还原菌群对不同浓度Fe(III)的还原性能进行测试：在上述柠檬酸铁培养基中接入不同浓度的Fe(III)，采用邻菲罗啉分光光度计法测定溶液中生成的溶解态的Fe(II)浓度及总Fe(II)浓度。考察菌群对Fe(III)的还原性能，表1为该铁还原菌群对不同浓度Fe(III)的还原效果。同等条件下，分离获得的一株单菌Enterobacter sp.对500 mg/L-2000mg/L的Fe(III)浓度进行Fe(III)还原率测试，其Fe(III)还原率在6%-30%之间，在相同Fe(III)浓度条件下单菌的Fe(III)还原率远低于该铁还原菌群的还原效果；
Figure 683036DEST_PATH_IMAGE002
。
：实施例2：铁还原菌群还原Fe(III)合成蓝铁矿
实验在厌氧培养箱中进行，在40 mL培养瓶中，接入15 mL铁还原培养基，处理组接入用1 mL生理盐水悬浮的对数期菌液（该对数期菌液由实施例1的条件获得），对照组接入1mL生理盐水（对照组是加入同等体积不含菌株的液体，确保处理组实验体系的体积一致）。每组实验均设置3个平行，置于厌氧培养箱内30℃避光培养，培养1天后，观察溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色，表明蓝铁矿的生成，3000 rpm离心5 min收集蓝铁矿，真空冷冻干燥后，通过SEM（图2）和XRD（图3）证实铁还原菌群合成的蓝铁矿，表明富集所得铁还原菌群可还原Fe(III)快速合成蓝铁矿。
实施例3
本实施例各步骤同实施例1，不同之处在于，本实施例铁还原菌群的富集过程为：富集培养实验在厌氧手套箱中进行，实验采用40 mL培养瓶，称取15 g污染土壤样品加入到40 mL经高温灭菌冷却后的生理盐水溶液中, 充分涡旋混匀后，在厌氧箱中静置1-5 h；将涡旋混匀静置后的4 mL的土壤上清液和25 mL柠檬酸铁培养基加入40 mL透明培养瓶中，30℃恒温避光在厌氧培养箱中培养，每隔一天摇匀，待溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色时，取培养瓶中的菌悬液转接至新的柠檬酸铁培养基中富集培养，待溶液颜色再次由棕黄色变成蓝黑色时，连续转接富集培养3-5次后获得铁还原菌群，经测试该铁还原菌群中也以Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas为主。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (6)

1.一种铁还原菌群，其特征在于，该铁还原菌群利用污染土壤为菌株筛选的源土壤，采用柠檬酸铁培养基进行富集培养，最终获得铁还原菌群，所述铁还原菌群在属水平上的组成主要包括Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas。
2.根据权利要求1所述的铁还原菌群，其特征在于，所述污染土壤中至少要存在4-氯苯胺、苯并（a）芘和邻（对）硝基氯苯三种有机污染物。
3.根据权利要求1所述的铁还原菌群，其特征在于，所述铁还原菌群在属水平上的主要组成为：Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas，五者的相对丰度依次为49%、13%、12%、11%、5%。
4.一种权利要求1-3任一所述的铁还原菌群的应用，其特征在于，所述铁还原菌群应用在除磷中，在柠檬酸铁培养基中还原Fe(III)，在1-2天内能快速合成蓝铁矿，实现对水体中磷的高效去除。
5.一种快速生物合成蓝铁矿方法，其特征在于，该方法的具体步骤是：
步骤1：采自污染场地的污染土壤，将污染土壤冰盒保存，24小时内带回实验室，放入厌氧培养箱内，用于铁还原菌群的富集；
步骤2：所述的铁还原菌群的富集过程为：富集培养实验在厌氧手套箱中进行，实验采用40 mL培养瓶，称取5-20 g污染土壤样品加入到装有20-80 mL经高温灭菌冷却后的生理盐水的容器中，充分涡旋混匀后，在厌氧箱中静置1-5 h；将涡旋混匀静置后的1-6 mL的土壤上清液和5-30 mL柠檬酸铁培养基加入40 mL透明培养瓶中，25-35℃恒温避光在厌氧培养箱中培养，每隔一天摇匀，待溶液颜色由棕黄色变成蓝黑色时，取培养瓶中的菌悬液转接至新的柠檬酸铁培养基中富集培养，待溶液颜色再次由棕黄色变成蓝黑色时，连续转接富集培养3-5次后获得铁还原菌群；
所述柠檬酸铁培养基组分为：2.5-3.5 g/L柠檬酸铁、1 g/L NH4Cl、0.07 g/L CaCl2·2H2O、0.6 g/L MgSO4·7H2O、0.722 g/L K2HPO4·3H2O、0.25 g/L KH2PO4、0.5-2 g/L葡萄糖、0.5-1.5 mL微量元素储备液、1-3 mL维生素溶液、0.0771 g/L DL-dithiothreitol；用1mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH = 7.0-7.4，培养基高压灭菌冷却后备用；
微量元素储备液组分：10 mL/L HCl、1.5 g/L FeCl2·4H2O、0.19 g/L CoCl2·6H2O、0.1g/L MnCl2·4H2O、0.07 g/L ZnCl2、0.006 g/L H3BO3、0.036 g/L Na2MoO4·2H2O、0.024 g/LNiCl2·6H2O、0.002 g/L CuCl2·2H2O；
维生素溶液组分：0.00002 g/L 生物素、0.00002 g/L 维生素B、0.0001 g/L 盐酸吡哆醇、0.00005 g/L 核黄素、0.00005 g/L 维生素B1、0.00005 g/L 烟酸、0.00005 g/L 泛酸、0.00005 g/L对氨基苯甲酸、0.00005 g/L 硫辛酸、0.000001 g/L 维生素B12；
步骤3：铁还原菌群扩大培养合成蓝铁矿：实验在厌氧培养箱中进行，将步骤2中富集获得的铁还原菌群在液体LB培养基中培养至对数期，用0.85%的生理盐水进行离心清洗3次，并用生理盐水悬浮；在40 mL培养瓶中，接入10-20 mL柠檬酸铁培养基，然后接入1-4 mL用0.85%的生理盐水悬浮的对数期菌液，将培养瓶置于厌氧培养箱内25-35℃恒温培养，培养1-2 d，观察培养基颜色由棕黄色变为蓝黑色，表明铁还原菌群还原Fe(III)合成了蓝铁矿。
6.一种快速生物合成蓝铁矿方法，其特征在于，该方法是：
获得铁还原菌群，所述铁还原菌群在属水平上的组成主要包括Enterobacter、Shewanella、Acinetobacter、Petrimonas、Aeromonas；
在厌氧培养箱中进行，将获得的铁还原菌群在液体LB培养基中培养至对数期，用0.85%的生理盐水进行离心清洗3次，并用生理盐水悬浮；在40 mL培养瓶中，接入10-20 mL柠檬酸铁培养基，然后接入1-4 mL用0.85%的生理盐水悬浮的对数期菌液，将培养瓶置于厌氧培养箱内25-35℃恒温培养，培养1-2 d，观察培养基颜色由棕黄色变为蓝黑色，表明铁还原菌群还原Fe(III)合成了蓝铁矿；
所述柠檬酸铁培养基组分为：2.5-3.5 g/L柠檬酸铁、1 g/L NH4Cl、0.07 g/L CaCl2·2H2O、0.6 g/L MgSO4·7H2O、0.722 g/L K2HPO4·3H2O、0.25 g/L KH2PO4、0.5-2 g/L葡萄糖、0.5-1.5 mL微量元素储备液、1-3 mL维生素溶液、0.0771 g/L DL-dithiothreitol；用1mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH = 7.0-7.4，培养基高压灭菌冷却后备用；
微量元素储备液组分：10 mL/L HCl、1.5 g/L FeCl2·4H2O、0.19 g/L CoCl2·6H2O、0.1g/L MnCl2·4H2O、0.07 g/L ZnCl2、0.006 g/L H3BO3、0.036 g/L Na2MoO4·2H2O、0.024 g/LNiCl2·6H2O、0.002 g/L CuCl2·2H2O；
维生素溶液组分：0.00002 g/L 生物素、0.00002 g/L 维生素B、0.0001 g/L 盐酸吡哆醇、0.00005 g/L 核黄素、0.00005 g/L 维生素B1、0.00005 g/L 烟酸、0.00005 g/L 泛酸、0.00005 g/L对氨基苯甲酸、0.00005 g/L 硫辛酸、0.000001 g/L 维生素B12。
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