CN101070528A - 铁还原丛毛单胞菌及其应用 - Google Patents

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周顺桂
武春媛
王弋博
李芳柏
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Abstract

本发明公开了一种铁还原丛毛单胞菌及其应用。发明人经过大量的实验研究，筛选出了铁还原丛毛单胞菌，其具有腐殖质还原和铁还原活性。此菌能还原柠檬酸铁、氢氧化铁、水铁矿、针铁矿等三价铁；也能还原腐殖质与腐殖质模型物AQDS(蒽醌－2，6－二磺酸)。铁还原丛毛单胞菌兼性厌氧，电子供体利用谱较广，此菌在厌氧条件下能氧化的电子供体有：丙三醇、葡萄糖、蔗糖。

Description

铁还原丛毛单胞菌及其应用
技术领域
本发明涉及新菌种筛选技术领域，具体的说，涉及一种铁还原丛毛单胞菌及其应用。
背景技术
Fe(III)和腐殖质是土壤中大量存在的两种组分。Fe(III)主要以难溶性氧化铁形式存在，在地壳中平均含量约为5.6％，是厌氧土壤中自然丰度最高的电子受体。腐殖质是富含醌基的、非均相的天然有机混合物，是土壤有机质的主体，约占有机碳总量的60～80％，在土壤肥力、农业可持续发展、环境保护等方面都具有重要作用。
腐殖质还原又称为腐殖质呼吸，是指微生物通过呼吸作用，将电子转移至土壤中的腐殖质，将氧化态的腐殖质还原成还原态腐殖质，菌体在代谢过程中获得能量的过程；近年的研究表明，腐殖质可在厌氧环境中充当有机物矿化的电子受体，加速有机污染物的降解。Fe(III)还原又称Fe(III)呼吸，是指微生物通过呼吸作用将电子转移至细胞外的铁氧化物表面，将Fe(III)还原成Fe(II)，并从这一过程中获得能量的过程。腐殖质和Fe(III)呼吸的直接后果是将氧化态腐殖质转化为还原态，将Fe(III)转化为Fe(II)，为有机物矿化与污染物还原修复提供基本驱动力。据估计，在某些淹水土壤与淡水沉积物中，Fe(III)/腐殖质呼吸直接导致了80％以上的有机碳矿化，其贡献超过硝酸盐呼吸、硫酸盐呼吸、产甲烷作用等其它厌氧代谢方式的总和。腐殖质与Fe(III)还原条件下的污染物原位生物修复技术已成为国际热点领域。
腐殖质与Fe(III)还原是由特定微生物介导的酶促反应，具有腐殖质与Fe(III)还原活性的细菌是反应得以进行的关键。目前，已经发现腐殖质与Fe(III)还原细菌100多株，主要分布于地杆菌属(Geobactersp.)、希瓦氏菌属(Shewanella sp.)、脱硫杆菌属(Desulfitobacteriumsp.)、脱硫弧菌属(Desulfomicrobium sp.)等几个属。这些菌株尚存在以下缺陷：1)大多数菌株只能在严格厌氧环境中生存，不利于大规模生产与实际应用；2)菌株的电子供体利用谱较窄，只能利用乙酸、乳酸等小分子量有机物作为电子供体，不能利用葡萄糖、蔗糖等分子量较大的有机物，对实际应用的环境要求相对较高。至今尚未发现具有腐殖质还原或Fe(III)还原活性的丛毛单胞菌。
发明内容
本发明的目的在于提供具有腐殖质还原和铁还原活性的铁还原丛毛单胞菌。
本发明的另一个目的在于提供上述铁还原丛毛单胞菌在腐殖质还原或三价铁还原中的应用。
本发明分离筛选所得的铁还原丛毛单胞菌(Comamonasferrireducens)CY01为革兰氏阴性菌，长杆状，于2007年3月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC 1968。
一、菌种的分离、纯化
取5g古森林土壤样品于100mL液体培养基中，培养基组成为(g/L)：AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)0.0412g，乙酸钠1.36g，NaHCO32.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，维生素溶液10.0mL(每升维生素溶液含：生物素2.0mg，叶酸2.0mg，维生素B610.0mg，核黄素5.0mg，维生素B150mg，烟酸5.0mg，泛酸5.0mg，维生素B12 0.1mg，硫辛酸5.0mg)，微量元素溶液10.0mL(每升微量元素溶液中含：氨三乙酸1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，CaCl2 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.01g，AlKSO4·12H2O 0.01g，H3BO30.01g，Na2M0O40.01g，NiCl2·6H2O 0.024g)，pH 5.0～5.5。接种前向培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，铝盖密封，培养液置于厌氧工作站(N2/CO2＝80/20)，30℃静置培养，检测还原态腐殖质模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)产率的同时观察培养液的颜色变化情况。当还原态AQDS的产量不断增加时，培养液从无色变为黄色，颜色逐渐加深。当培养液颜色稳定不再变化时，以10％的接种量富集培养三次，然后稀释，均匀涂布于固体培养基上(每升培养液加16克琼脂，其它成分同上述液体培养基)，置于厌氧工作站(N2/CO2＝80/20)30℃培养48小时，挑取单菌落进行分离、纯化。
二、本发明菌株具有如下形态和生理、生化特性：
(1)菌体形态特性
采用常规细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，该菌株为革兰氏阴性菌，长杆状，大小为1.2～1.5×0.3～0.4μm，具有运动性。
(2)菌落形态特性
在牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基平板上好氧培养24小时后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，淡粉色，菌落大小(d)为1～2mm；在上述培养基上好氧培养48小时后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，黄色，菌落大小(d)为3～4mm。
(3)主要的生理、生化特性
在好氧条件下氧化酶反应为阳性，不产气，柠檬酸盐利用试验为阳性。具有兼性厌氧生长的能力；在好氧条件下，用BIOLOG鉴定后发现，在96种不同碳源中，该菌能利用其中的38种。在厌氧条件下能氧化的电子供体有：丙三醇、葡萄糖、蔗糖；利用上述电子供体，该菌能还原柠檬酸铁、氢氧化铁、水铁矿、针铁矿等三价铁，也能还原腐殖质与腐殖质模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)。
(4)分子生物学特性
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24∶1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物F8和R1542扩增细菌的16S rDNA，在1500bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比对。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列的结果，该菌株应归属于丛毛单胞菌属，命名为铁还原丛毛单胞菌(Comamonas ferrireducens)CY01。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
发明人经过大量的实验研究，筛选出了铁还原丛毛单胞菌，其具有腐殖质还原和铁还原活性。此菌能还原柠檬酸铁、氢氧化铁、水铁矿、针铁矿等三价铁；也能还原腐殖质与腐殖质模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)。铁还原丛毛单胞菌兼性厌氧，电子供体利用谱较广，此菌能在厌氧条件下能氧化的电子供体有：丙三醇、葡萄糖、蔗糖。
附图说明
图1为Comamonas ferrireducens CY01的扫描电镜图片。
具体实施方式
实施例1：菌种的分离、纯化
取5g古森林土壤样品于100mL液体培养基中，培养基组成为(g/L)：AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)0.0412g，乙酸钠1.36g，NaHCO32.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，维生素溶液10.0mL(每升维生素溶液含：生物素2.0mg，叶酸2.0mg，维生素B610.0mg，核黄素5.0mg，维生素B150mg，烟酸5.0mg，泛酸5.0mg，维生素B12 0.1mg，硫辛酸5.0mg)，微量元素溶液10.0mL(每升微量元素溶液中含：氨三乙酸1.5g，MgSO4·7H2O 3.0g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1.0g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·6H2O 0.1g，CaCl2 0.1g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.01g，AlKSO4·12H2O 0.01g，H3BO30.01g，Na2M0O4 0.01g，NiCl2·6H2O 0.024g)，pH 5.0～5.5。接种前往培养液中鼓充高纯混合气体(N2/CO2-80/20)≥1小时，铝盖密封，培养液置于厌氧工作站(N2/CO2＝80/20)，30℃静置培养，检测还原态腐殖质模型物AQDS(蒽醌-2，6-二磺酸)产率的同时观察培养液的颜色变化情况。当还原态AQDS的产量不断增加时，培养液从无色变为黄色，颜色逐渐加深。当培养液颜色稳定不再变化时，以10％的接种量富集培养三次，然后稀释，均匀涂布于固体培养基上(每升培养液加16克琼脂，其它成分同上述液体培养基)，置于厌氧工作站(N2/CO2＝80/20)30℃培养48小时，挑取单菌落进行分离、纯化。
实施例2：菌种的鉴定
(1)生理生化性质的测定：
表1.CY01菌株的生理生化特性
检测项目 结果      检测项目     结果
革兰氏染色细胞形状细胞大小产色素运动性菌落形态菌落大小产气菌落颜色(24h)菌落颜色(48h)氧化酶反应厌氧情况还原水铁矿(厌氧条件)还原柠檬酸铁(厌氧条件)还原氢氧化铁(厌氧条件)还原针铁矿(厌氧条件)蔗糖麦芽糖 阴性长杆状1.2～1.5×0.3～0.4μm-+圆形1～2mm-淡粉黄色+兼性厌氧++++--      D-果糖L-海藻糖D-半乳糖D-甘露醇D-甘露糖丙酮酸甲酯琥珀酸单甲酯乙酸顺式乌头酸柠檬酸α-羟丁酸D-半乳糖酸内脂D-半乳糖醛酸D-葡萄糖酸丙二酸D-葡萄糖醛酸甘油/丙三醇木糖醇     -----++++++--+----
注：+表示可以利用；-表示不能利用
(2)分子生物学鉴定
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24∶1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物F8和R1542扩增细菌的16S rDNA，在1500bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列的结果，该菌株应归属于丛毛单胞菌属，命名为铁还原丛毛单胞菌(Comamonas ferrireducens)CY01。
实施例3：还原活性的鉴定
电子供体为葡萄糖，电子受体为水铁矿
培养基配方：每升去离子水中含水铁矿10g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，葡萄糖0.9008g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液配方同实施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃灭菌20分钟，灭菌时葡萄糖和其它成分分开，灭菌后将葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，接种C.ferrireducens CY01细菌悬浮液，使其菌数达到108/mL，于30℃静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况，每隔5天取4mL培养液于16mL0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩尔数)中180转/分振荡1.5小时。邻菲罗林法测定Fe(II)的含量，计算Fe(III)还原率。Fe(III)还原率＝Fe(II)浓度/Fe(III)起始浓度×100％。
表2以葡萄糖为电子供体，水铁矿为电子受体，验证了C.ferrireducens CY01菌株的铁还原能力。
表2.不同培养时间下的Fe(III)还原率(％)
  0天   5天   10天   15天   20天
  对照   0.04   0.54   0.87   1.52   2.03
  CY0菌株   0.04   0.89   2.23   3.42   4.74
实施例4：还原活性的鉴定
电子供体为葡萄糖，电子受体为针铁矿
培养基配方：每升去离子水中含针铁矿9g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，葡萄糖0.9008g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液配方同实施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃灭菌20分钟，灭菌时葡萄糖和其它成分分开，灭菌后将葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，接种C.ferrireducens CY01细菌悬浮液，使其菌数达到108/mL，于30℃静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况，每隔10天取4mL培养液于16mL0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩尔数)中180转/分振荡1.5小时。邻菲罗林法测定Fe(II)的含量，计算Fe(III)还原率。Fe(III)还原率＝Fe(II)浓度/Fe(III)起始浓度×100％。
表3以葡萄糖为电子供体，针铁矿为电子受体，验证了C.ferrireducens CY01菌株的铁还原能力。
表3.不同培养时间下的Fe(III)还原率(％)
  0天   10天   20天   30天   40天
  对照   0.08   1.14   2.16   2.54   2.84
  CY0菌株   0.09   1.74   3.36   5.42   6.74
实施例5：还原活性的鉴定
电子供体为蔗糖，电子受体为水铁矿
培养基配方：每升去离子水中含水铁矿10g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO42H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(配方同实施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃灭菌20分钟，灭菌时蔗糖和其它成分分开，灭菌后将蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，接种C.ferrireducens CY01细菌悬浮液，使其菌数达到108/mL，于30℃静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况，每隔5天取4mL培养液于16mL 0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩尔数)中180转/分振荡1.5小时。邻菲罗林法测定Fe(II)的含量，计算Fe(III)还原率。Fe(III)还原率＝Fe(II)浓度/Fe(III)起始浓度×100％。
表4以蔗糖为电子供体，水铁矿为电子受体，验证了C.ferrireducens CY01菌株的铁还原能力。
表4.不同培养时间下的Fe(III)还原率(％)
  0天   5天   10天   15天   20天
  对照   0.03   1.17   1.22   2.16   3.24
  CYO菌株   0.04   1.47   1.61   13.42   16.74
实施例6：还原活性的鉴定
电子供体为蔗糖，电子受体为针铁矿
培养基配方：每升去离子水中含针铁矿9g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液配方同实施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃灭菌20分钟，灭菌时蔗糖和其它成分分开，灭菌后将蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，接种C.ferrireducens CY01细菌悬浮液，使其菌数达到108/mL，于30℃静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况，每隔5天取4mL培养液于16mL0.5M HCl溶液(M表示每升水中含HCl的摩尔数)中180转/分振荡1.5小时。邻菲罗林法测定Fe(II)的含量，计算Fe(III)还原率。Fe(III)还原率＝Fe(II)浓度/Fe(III)起始浓度×100％。
表5以葡萄糖为电子供体，水铁矿为电子受体，验证了C.ferrireducens CY01菌株的铁还原能力。
表5.不同培养时间下的Fe(III)还原率(％)
  0天   5天   10天   15天   20天
  对照   0.05   0.99   1.22   1.85   3.25
  CY0菌株   0.06   1.18   1.57   7.82   13.3
实施例7还原活性的鉴定
电子供体为葡萄糖，电子受体为腐殖质模型物AQDS
培养基配方：每升去离子水中含AQDS 0.0412g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液配方同实施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃条件下灭菌20分钟，灭菌时葡萄糖和其它成分分开，灭菌后将葡萄糖和其它成分混合，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，接种C.ferrireducens CY01细菌悬浮液，使其菌数达到108/mL，于30℃静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。观察培养液的颜色变化情况，每隔1天取培养液用0.22μm细菌滤器把菌体等沉淀滤掉，用紫外分光光度计测定还原型AQDS的含量，计算AQDS的还原率。AQDS还原率＝还原态AQDS浓度/AQDS起始浓度×100％。
表6以葡萄糖为电子供体，AQDS为电子受体，验证了C.ferrireducens CY01菌株的腐殖质还原能力。
表6.不同培养时间下的AQDS还原率(％)
  0天   1天   2天   3天   4天
  对照   0.10   0.10   0.24   0.21   0.31
  CY0菌株   0.18   4.3   17.6   66.3   90.1
实施例8：还原活性的鉴定
电子供体为蔗糖，电子受体为腐殖质(购自美国Aldrich公司)
培养基配方：每升去离子水中含腐殖质0.5g，NaHCO3 2.5g，NH4Cl 0.25g，NaH2PO4·2H2O 0.678g，KCl 0.1g，蔗糖3.423g，维生素溶液和微量元素溶液各10.0mL(维生素溶液和微量元素溶液配方同实施例1)，pH 5.0～5.5；于121℃灭菌20分钟，灭菌时蔗糖和其它成分分开，灭菌后将蔗糖和其它成分混合，然后鼓充高纯混合气体(N2/CO2＝80/20)≥1小时，接种C.ferrireducens CY01细菌悬浮液，使其菌数达到108/mL，于30℃静置厌氧培养，同时设置不加菌的对照。每隔1天取培养液用0.22μm细菌滤器把菌体等沉淀滤掉，测定还原态腐殖质含量，计算腐殖质的还原率。腐殖质还原率＝还原态腐殖质浓度/腐殖质起始浓度×100％。
表7以蔗糖为电子供体，腐殖质为电子受体，验证了C.ferrireducens CY01菌株的腐殖质还原能力。
表7.不同培养时间下的腐殖质还原率(％)
  0天   1天   2天   3天   4天
  对照   0.10   0.10   0.13   0.12   0.14
  CYO菌株   0.174   0.209   21.7   63.2   86.9

Claims (2)

1.一种铁还原丛毛单胞菌，其特征在于：其为革兰氏阴性菌，长杆状，于2007年3月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC1968。
2.权利要求1所述铁还原丛毛单胞菌在腐殖质还原或三价铁还原中的应用。
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