CN105385451A - 一种腐殖酸铁与微生物复合土壤污染修复剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种腐殖酸铁与微生物复合土壤污染修复剂及其制备方法,所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂,由腐殖酸铁和腐殖质还原菌组成,所述腐殖质还原菌为腐败希瓦氏菌或韩国丛毛单胞菌;每毫升复合修复剂中,所述腐殖酸铁的含量为0.002~0.01g,所述腐殖质还原菌数量>108CFU,所述腐殖酸铁是由腐殖酸与Fe(SO4)·7H2O制备而成的络合物;该复合修复剂的制备方法,包括如下步骤:提取腐殖酸;制备腐殖酸铁;摇瓶培养菌种;发酵制备菌剂;混合形成修复剂。与现有技术相比,本发明可以用于有机污染的土壤修复,具有修复效果好、速率快,生产成本低廉,制备方法简单方便,易于大规模生产等优点。
Description
技术领域
本发明涉及土壤治理修复领域,具体涉及一种腐殖酸铁与微生物复合土壤污染修复剂及其制备方法。
背景技术
由于农药化肥的大量使用及石油、多环芳烃、有机氯等污染物大量排放,导致我国土壤有机污染问题严重。2014年《全国土壤污染调查公报》指出,我国土壤中六六六、滴滴涕、多环芳烃3类有机污染物点位超标率分别为0.5%、1.9%、1.4%;超标最为严重的土壤类型主要是耕地和林地,以及重污染企业用地、工业废弃地、工业园区、固体废物集中处理处置场地、采油区等。另外,据广东省生态环境与土壤研究所的调查结果,珠三角地区土壤样品中滴滴涕、六六六等7种持久性有机污染物的浓度范围达0.03~1.568mgkg-1,而蔬菜中的浓度为0.01~1.102mgkg-1,已经引起突出的农产品安全与环境健康问题,而在长三角、环渤海湾地区也同样存在这一问题。
针对我国农业土壤中以及工业场地中普遍存在的有机污染问题,选择适合的技术实现土壤污染修复是当前研究的热点。微生物修复技术作为一种温和的、环境友好的修复技术,因其成本低、操作方便等优势等到广泛关注。该技术是指利用土著的或人工添加的功能微生物菌群,通过在一定条件下促进或强化其代谢功能,实现土壤中污染物的降解去除或者无害化的过程。微生物修复技术的实质是污染物的生物降解,即微生物催化的氧化还原过程,具体而言,是指在功能微生物的作用下,有机污染物作为电子供体,与外源的电子受体发生氧化还原反应,使目标污染物降解成无毒无害的物质。一般情况下,O2是有机污染物降解的最适合的电子受体。然而,在土壤环境中,O2由于溶解度低、难以扩散等问题很难在原位条件下实现土壤表层下污染物的代谢降解;工程中以机械鼓风曝气的形式通氧,也存在能耗高、操作复杂从而导致成本高等问题。因此,如何在厌氧条件下开展土壤有机污染的原位修复,是有机污染土壤微生物修复技术的发展与应用的关键。
中国专利申请CN101586094A介绍了一种可加速有机氯降解的铁还原菌-矿物复合菌剂,该菌剂可在厌氧条件下将Fe(III)还原生成具有还原脱氯活性的Fe(II),从而加速土壤中有机氯降解。但由于在土壤环境中,有机污染物、铁氧化物和铁还原微生物之间的电子传递速率有待提高,因此污染修复效率也受到很大限制。此外,中国发明专利CN102443400B提出了一种可应用于土壤和河涌底泥原位有机污染修复的铁氧化物与腐殖质及其还原菌三元复合修复剂,该修复剂包含了铁氧化物、腐殖质和铁还原微生物,可以使铁还原菌在厌氧条件下为铁氧化物的还原提供强大的驱动力。相比于专利申请CN101586094A中的铁还原菌-矿物复合菌剂,该三元复合修复剂具有更高的电子传递效率和有机污染修复效率,但铁氧化物与腐殖质作为两种不同外源电子受体以及电子穿梭体,其协同铁还原菌促进污染物降解的效率仍具有很大的提升空间。
发明内容
针对以上技术缺陷,本发明目的在于提供一种可应用于土壤有机污染修复的腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂及其制备方法,该修复剂可实现快速高效的土壤有机修复且其制备方法简单方便,易于大规模生产,具备良好的应用前景。
本发明通过以下技术方案实现:
一种腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂,由腐殖酸铁和腐殖质还原菌组成,所述腐殖质还原菌为腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)或韩国丛毛单胞菌(Comamonaskoreensis);每毫升复合修复剂中,所述腐殖酸铁的含量为0.002~0.01g,所述腐殖质还原菌数量>108CFU。
所述腐殖酸铁是由腐殖酸(HA)与Fe(SO4)·7H2O制备而成的络合物。
一种腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,包括如下步骤:
S1:提取腐殖酸;
S2:制备腐殖酸铁;
S3:摇瓶培养菌种;
S4:发酵制备菌剂;
S5:混合形成修复剂。
利用上述方法进行二元复合修复剂的制备,具体包括:
步骤一:采用NaOH提取法从富含腐殖酸的原料中提取腐殖酸,经冷冻干燥后备用。
步骤二:将1.5~2.0g上述提取的腐殖酸加入至500~1000ml浓度为0.01~0.02M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后固液分离弃去固相沉淀物;在快速搅拌的同时,往液相中加入浓度为5~10mM的FeSO4·7H2O,调节混合溶液的pH至7.0~7.2;经过长时间沉淀处理,所得沉淀物经冷冻干燥后即为制备的腐殖酸铁络合物。
步骤三:将腐殖质还原菌接种到含有高压蒸汽灭菌后的LB(Luria-Bertani)液体培养基中,28~32℃下进行好氧培养,得到摇瓶菌种。
步骤四:将上述摇瓶中的菌种按2%~5%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,得到发酵液。
步骤五:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤二中制得的腐殖酸铁按质量比0.2%~1%添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
进一步地,所述富含腐殖酸的原料是指泥炭土、褐煤或风化煤等。
进一步地,所述NaOH提取法是指:将100g泥炭土、褐煤、风化煤等富含腐殖酸的原料中加入150~200ml的0.1~0.15MNaOH溶液中,150~200rmp转速下提取12~24h,4000~6000g下离心10~20min固液分离;固相部分再次加入150~200ml0.1~0.15M的NaOH,150~180rmp转速下提取12~24h,重复提取2~4次;将多次提取的液相合并,然后加入1~3M的HCl酸化至pH<2.0,得到絮状沉淀物即为提取的腐殖酸。
进一步地,步骤二中所述固液分离条件为:12000~15000g离心15~20min。
进一步地,步骤二中所述长时间沉淀处理条件为:混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,30~35℃条件下保持5~9天(day,d),之后12000~15000g离心20~30min,弃去液相。
进一步地,步骤三中所述摇瓶培养的条件为:转速100~200rmp,培养时间12~24h。
进一步地,步骤三和步骤四中,所述LB液体培养基组分为:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,H2O1000ml,pH7.0。
进一步地,步骤四中所述发酵条件为:温度28~32℃,通气量0.8~1.0∶1.0v(v·min)-1,搅拌转速100~200rmp,发酵时间24~48h。
本发明的有益效果是:
1、修复效果快速高效。本发明涉及的修复剂,通过充分发挥外源腐殖质还原菌的功能和腐殖酸铁高效的电子传递特性,可以使厌氧条件下土壤中的多种有机污染物发生还原降解,实现土壤等环境中有机污染物的快速修复。
2、生产成本低廉且环境风险小。本发明的修复剂,基于微生物修复技术的基本原理且为二元复合修复剂,成分简单且具有生产成本低、对环境友好、无二次污染等优点。
3、制备方法简便易于实现大规模生产。利用本发明的修复剂制备方法,可以简便、快捷的得到复合有机污染修复剂产品。
4、施用方法简单且适合大面积推广。本修复剂的施用方法简单,可以在无需通氧的前提下实现大范围内土壤、底泥等多种污染环境的原位修复。
附图说明
图1为本发明实施例7修复剂和对照组对六六六的平均降解速率-时间关系曲线图;
图2为本发明实施例7修复剂和对照组对滴滴涕的平均降解速率-时间关系曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例,进一步说明本发明。
一种腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂,由腐殖酸铁和腐殖质还原菌组成,所述腐殖酸铁是由腐殖酸(HA)与Fe(SO4)·7H2O制备而成的络合物;所述腐殖质还原菌为腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)或韩国丛毛单胞菌(Comamonaskoreensis),每毫升复合修复剂中,所述腐殖酸铁的含量为0.002~0.01g,所述腐殖质还原菌数量>108CFU。
一种腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,包括如下步骤:
S1:提取腐殖酸;
S2:制备腐殖酸铁;
S3:摇瓶培养菌种;
S4:发酵制备菌剂;
S5:混合形成修复剂。
利用上述方法进行二元复合修复剂的制备,具体包括:
步骤一提取腐殖酸:将100g泥炭土、褐煤或风化煤等富含腐殖酸的原料加入150~200ml的0.1~0.15MNaOH溶液中,150~200rmp转速下提取12~24h,4000~6000g下离心10~20min固液分离;固相部分再次加入150~200ml0.1~0.15M的NaOH,150~180rmp转速下提取12~24h,重复该步骤2~4次;将多次提取的液相合并,然后加入1~3M的HCl酸化至pH<2.0,得到絮状沉淀物即为提取的腐殖酸,经冷冻干燥后备用。
步骤二制备腐殖酸铁:取1.5~2.0g上述提取的腐殖酸加入至500~1000ml浓度为0.01~0.02M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后,12000~15000g离心15~20min固液分离弃去固相沉淀物;在快速搅拌的同时,往液相中加入浓度为5~10mM的Fe(SO4)·7H2O,调节混合溶液的pH至7.0~7.2;将混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,放置在30~35℃条件下保持5~9d后,用12000~15000g离心20~30min,弃去液相,所得沉淀物经冷冻干燥后即为制备的腐殖酸铁络合物。
步骤三摇瓶培养菌种:将腐殖质还原菌接种到含有高压蒸汽灭菌后的LB(Luria-Bertani)液体培养基中(培养基组分:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,H2O1000ml,pH7.0),28~32℃好氧培养,培养转速为100~200rmp,培养时间为12~24h,得到摇瓶菌种。
步骤四发酵制备菌剂:将上述摇瓶中的菌种按2%~5%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,发酵培养条件为:温度28~32℃,通气量0.8~1.0∶1.0v(v·min)-1,搅拌转速100~200rmp,发酵时间24~48h,得到发酵液。
步骤五混合形成修复剂:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤二中制得的腐殖酸铁按质量比0.2%~1%添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
实施例1
泥炭土腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合有机污染修复剂的制备
(1)腐殖酸提取:将100g泥炭土加入150ml的0.15MNaOH溶液中,150rmp转速下提取24h,6000g下离心10min固液分离;对固相部分重复该步骤2次后,将多次提取的液相合并,然后加入2M的HCl酸化至pH为1.92,得到絮状沉淀物,冷冻干燥后,备用。
(2)腐殖酸铁制备:将1.5g提取的腐殖酸加入至500ml浓度为0.02M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后,14000g离心15min固液分离弃去固相沉淀物;对液相部分在快速搅拌的同时加入浓度为7.5mM的Fe(SO4)·7H2O,调节混合溶液的pH至7.0;然后将混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,35℃条件下保持5d,之后15000g离心20min,弃去液相,所得沉淀物为腐殖酸铁,冷冻干燥后备用。
(3)菌种培养:从保藏的腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens,Sp200)斜面培养基上挑取一环接种到装有LB培养基的三角瓶中,30℃进行摇瓶培养,培养转速为200rmp,培养时间为12h,得到摇瓶菌种。
(4)菌剂发酵:将上述摇瓶中的菌种按3%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,发酵培养条件为:温度30℃,通气量为0.8∶1.0v·(v·min)-1,搅拌转速为150rmp,发酵时间为24h,得到发酵液。
(5)修复剂制备:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤(2)中制得的腐殖酸铁按0.5%的质量比添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
(6)质量检验:采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)分析步骤(2)中制备的腐殖酸铁络合物中总Fe含量,结果显示为186.7g·kg-1;采用细菌稀释平板计数法检验修复剂产品中腐败希瓦氏菌的含量,结果显示为5.5×108CFU·ml-1。
实施例2
泥炭土腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合有机污染修复剂的制备
(1)腐殖酸提取:将100g泥炭土加入到200ml的0.1MNaOH溶液中,200rmp转速下提取12h,6000g下离心15min固液分离;对固相部分重复该步骤4次后,将多次提取的液相合并,然后加入3M的HCl酸化至pH为1.84,得到絮状沉淀物,冷冻干燥后,备用。
(2)腐殖酸铁制备:将2g提取的腐殖酸加入至1000ml浓度为0.012M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后,12000g离心20min固液分离弃去固相沉淀物;对液相部分在快速搅拌的同时加入浓度为6mM的Fe(SO4)·7H2O,调节混合溶液的pH至7.0;然后将混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,30℃条件下保持7d,之后15000g离心20min,弃去液相,所得沉淀物为腐殖酸铁,冷冻干燥后备用。
(3)菌种培养:从保藏的韩国丛毛单胞菌(Comamonaskoreensis,CY01)斜面培养基上挑取一环接种到装有LB培养基的三角瓶中,32℃进行摇瓶培养,培养转速为120rmp,培养时间为18h,得到摇瓶菌种。
(4)菌剂发酵:将上述摇瓶中的菌种按2%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,发酵培养条件为:温度32℃,通气量为1.0∶1.0v(v·min)-1,搅拌转速135rmp,发酵时间为40h,得到发酵液。
(5)修复剂制备:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤(2)中制得的腐殖酸铁按0.8%的质量比添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
(6)质量检验:采用ICP-AES分析步骤(2)中制备的腐殖酸铁络合物中总Fe含量,结果显示为225.1g·kg-1;采用细菌稀释平板计数法检验修复剂产品中韩国丛毛单胞菌的含量,结果显示为14.7×108CFU·ml-1。
实施例3
褐煤腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合有机污染修复剂的制备
(1)腐殖酸提取:将100g褐煤加入160ml的0.12MNaOH溶液中,175rmp转速下提取20h,5000g下离心15min固液分离;对固相部分重复该步骤3次后,将多次提取的液相合并,然后加入1.5M的HCl酸化至pH为1.99,得到絮状沉淀物,冷冻干燥后,备用。
(2)腐殖酸铁制备:将1.8g提取的腐殖酸加入至1000ml浓度为0.01M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后,15000g离心15min固液分离弃去固相沉淀物;对液相部分在快速搅拌的同时加入浓度为10mM的Fe(SO4)·7H2O,调节混合溶液的pH至7.0;然后将混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,30℃条件下保持8d,之后13000g离心20min,弃去液相,所得沉淀物为腐殖酸铁,冷冻干燥后备用。
(3)菌种培养:从保藏的腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens,Sp200)斜面培养基上挑取一环接种到装有LB培养基的三角瓶中,28℃进行摇瓶培养,培养转速为150rmp,培养时间为24h,得到摇瓶菌种。
(4)菌剂发酵:将上述摇瓶中的菌种按5%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,发酵培养条件为:温度28℃,通气量为0.9∶1.0v(v·min)-1,搅拌转速175rmp,发酵时间48h,得到发酵液。
(5)修复剂制备:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤(2)中制得的腐殖酸铁按1.0%的质量比添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
(6)质量检验:采用ICP-AES分析步骤(2)中制备的腐殖酸铁络合物中总Fe含量,结果显示为161.4g·kg-1;采用细菌稀释平板计数法检验修复剂产品中腐败希瓦氏菌的含量,结果显示为8.2×108CFU·ml-1。
实施例4
风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合有机污染修复剂的制备
(1)腐殖酸提取:将100g风化煤加入175ml的0.1MNaOH溶液中,160rmp转速下提取16h,4000g下离心20min固液分离;对固相部分重复该步骤3次后,将多次提取的液相合并,然后加入2.5M的HCl酸化至pH为1.90,得到絮状沉淀物,冷冻干燥后,备用。
(2)腐殖酸铁制备:将1.5g提取的腐殖酸加入至800ml浓度为0.015M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后,14000g离心15min固液分离弃去固相沉淀物;对液相部分在快速搅拌的同时加入浓度为5mM的Fe(SO4)·7H2O,调节混合溶液的pH至7.2;然后将混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,32℃条件下保持6d,之后14000g离心15min,弃去液相,所得沉淀物为腐殖酸铁,冷冻干燥后备用。
(3)菌种培养:从保藏的韩国丛毛单胞菌(Comamonaskoreensis,CY01)斜面培养基上挑取一环接种到装有LB培养基的三角瓶中,30℃进行摇瓶培养,培养转速为145rmp,培养时间为16h,得到摇瓶菌种。
(4)菌剂发酵:将上述摇瓶中的菌种按4%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,发酵培养条件为:温度30℃,通气量为1.0∶1.0v·(v·min)-1,搅拌转速145rmp,发酵时间32h,得到发酵液。
(5)修复剂制备:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤(2)中制得的腐殖酸铁按0.2%的质量比添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
(6)质量检验:采用ICP-AES分析步骤(2)中制备的腐殖酸铁络合物中总Fe含量,结果显示为149.8g·kg-1;采用细菌稀释平板计数法检验修复剂产品中韩国丛毛单胞菌的含量,结果显示为11.2×108CFU·ml-1。
实施例5
泥炭土腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合修复剂修复五氯酚污染土壤
按10ml·kg-1土称取实施例1制备所得的泥炭土腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合修复剂,用水稀释10倍后,投放到五氯酚浓度为5mg·kg-1的土壤中,充分混合均匀;同时以不接种修复剂的五氯酚污染土壤为对照(五氯酚浓度为5mg·kg-1),测定28d五氯酚的降解情况,结果如表1所示。
表1泥炭土腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合修复剂对五氯酚污染土壤的修复效果(mg·kg-1)
从上表中可以看出,添加泥炭土腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合修复剂的土壤中,经过14d处理,五氯酚降解率达到75%,21d时完全降解,此时对照中五氯酚降解率仅为21%。
实施例6
风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合复剂修复2,4-二氯苯氧乙酸污染土壤
按10ml·kg-1土称取实施例4制备所得的风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合复剂,用水稀释10倍后,投放到含2,4-二氯苯氧乙酸10ml·kg-1的土壤中,充分混合均匀;同时以不接种修复剂的污染土壤为对照(2,4-二氯苯氧乙酸浓度为10ml·kg-1),测定两个不同处理21d内2,4-二氯苯氧乙酸的降解情况,结果如表2所示。
表2风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合复剂修复对2,4-二氯苯氧乙酸污染土壤的修复效果(mg·kg-1)
从表2中可以看出,对于添加风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合修复剂的土壤,经过14d修复处理,2,4-二氯苯氧乙酸的降解率达95%,此时,对照处理中2,4-二氯苯氧乙酸的降解率为37%。因此,采用本发明所制备的修复剂14d后可使得土壤中2,4-二氯苯氧乙酸的降解率提高至约2.6倍;21d后就可使得中的2,4-二氯苯氧乙酸实现完全降解,而此时对照组土壤中的降解率只能达到35%。
实施例7
褐煤腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合修复剂修复多种有机氯农药污染土地
按10ml·kg-1土称取实施例3制备所得的风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合复剂,用水稀释10倍后,投放到含六六六和滴滴涕浓度分别为2mg·kg-1和5mg·kg-1的土壤中,充分混合均匀;同时以不接种修复剂的污染土壤为对照(六六六和滴滴涕浓度分别为2mg·kg-1和5mg·kg-1),测定两个不同处理28d内六六六和滴滴涕的降解情况,结果如表3所示。
表3褐煤腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合复剂对六六六和滴滴涕污染土壤修复效果(mg·kg-1)
从表3中可以看出,对于添加风化煤腐殖酸铁与韩国丛毛单胞菌复合修复剂的土壤,经过28d修复处理,六六六的降解率为90%,对照组仅降低了17.59%;滴滴涕的降解率为81%,对照组仅降低了15.93%,因此,采用本发明制备的复合修复剂可同时将土壤中六六六和滴滴涕的降解率提高5倍以上。
根据上表对修复剂和对照组土壤中六六六和滴滴涕的平均降解速率进行计算,计算结果如表4所示:
平均降解速率=已降解的量/降解时间
表4褐煤腐殖酸铁与腐败希瓦氏菌复合复剂与土壤修复速率对照表
修复剂组和对照组对六六六的平均降解速率-时间关系如图1所示,修复剂组和对照组对滴滴涕的平均降解速率-时间关系如图2所示,从图1和图2中可以看出,修复剂组对六六六和滴滴涕的平均降解速率远高于对照组,修复剂组对六六六和滴滴涕的平均降解速率在21d内呈S型曲线增加且在21d时基本达到最大值,此后处于稳定期;而对照组则对六六六和滴滴涕的降解处于低速波动状态。
与现有技术相比,本发明产品修复效果好、修复速率高、制备方法简单、生产成本低廉、施用方法简单且适合大面积推广。
以上是对本发明进行了示例性的描述,显然本发明的实现并不受上述方式的限制,只要采用了本发明技术方案进行的各种改进,或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的,均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂,由腐殖酸铁和腐殖质还原菌组成,其特征在于:所述腐殖质还原菌为腐败希瓦氏菌或韩国丛毛单胞菌;每毫升复合修复剂中,所述腐殖酸铁的含量为0.002~0.01g,所述腐殖质还原菌数量>108CFU。
2.一种腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
S1:提取腐殖酸;
S2:制备腐殖酸铁;
S3:摇瓶培养菌种;
S4:发酵制备菌剂;
S5:混合形成修复剂。
3.根据权利要求2所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一:采用NaOH提取法从富含腐殖酸的原料中提取腐殖酸,经冷冻干燥后备用;
步骤二:将1.5~2.0g上述提取的腐殖酸加入至500~1000ml浓度为0.01~0.02M的Na4P2O7溶液中,充分混匀后固液分离弃去固相沉淀物;在快速搅拌的同时,往液相中加入浓度为5~10mM的FeSO4·7H2O,调节混合溶液的pH至7.0~7.2;经过长时间沉淀处理,所得沉淀物经冷冻干燥后即为制备的腐殖酸铁络合物;
步骤三:将腐殖质还原菌接种到含有高压蒸汽灭菌后的LB液体培养基中,28~32℃下进行好氧培养,得到摇瓶菌种;
步骤四:将上述摇瓶中的菌种按2%~5%的接种量接种至含LB液体培养基的发酵罐中,得到发酵液;
步骤五:发酵结束后,收集发酵罐中菌液,将步骤二中制得的腐殖酸铁按质量比0.2%~1%添加至发酵菌液中,混合均匀后得到复合有机污染修复剂。
4.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:所述富含腐殖酸的原料是指泥炭土、褐煤或风化煤。
5.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:所述NaOH提取法是指:将100g泥炭土、褐煤、风化煤等富含腐殖酸的原料中加入150~200ml的0.1~0.15MNaOH溶液中,150~200rmp转速下提取12~24h,4000~6000g下离心10~20min固液分离;固相部分再次加入150~200ml0.1~0.15M的NaOH,150~180rmp转速下提取12~24h,重复提取2~4次;将多次提取的液相合并,然后加入1~3M的HCl酸化至pH<2.0,得到絮状沉淀物即为提取的腐殖酸。
6.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:步骤二中所述固液分离条件为:12000~15000g离心15~20min。
7.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:步骤二中所述长时间沉淀处理条件为:混合溶液用聚丙烯塑料容器盛装,30~35℃条件下保持5~9天,之后12000~15000g离心20~30min,弃去液相。
8.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:步骤三中所述摇瓶培养的条件为:转速100~200rmp,培养时间12~24h。
9.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:步骤三和步骤四中,所述LB液体培养基组分为:胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,H2O1000ml,pH7.0。
10.根据权利要求3所述腐殖酸铁与腐殖质还原菌二元复合修复剂的制备方法,其特征在于:步骤四中所述发酵条件为:温度28~32℃,通气量0.8~1.0∶1.0v(v·min)-1,搅拌转速100~200rmp,发酵时间24~48h。
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