CN106544273A - 一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法 - Google Patents

一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，它包括以下步骤：首先，取新鲜粪便粪水5mL,放入加有灭菌后50mL培养基A的瓶中，并摇匀1‑2分钟，然后向放入有粪便和培养基A的瓶中通入N2去除瓶中的O2，用塞子盖紧密封，避光放置于30℃厌氧恒温箱中孵育培养3天。本发明可通过沉淀的过程较为直观的观测细菌的培养过程，且对培养的混合菌活性及代谢特性进行进一步研究和分析，且较为简便。

Description

一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法
技术领域
本发明涉及一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法。
背景技术
异化Fe (Ⅲ)还原微生物是具有Fe (Ⅲ)还原功能的一类微生物的总称，它们以Fe(Ⅲ)作为末端电子受体，氧化有机质同时从中获得能量。近年来，陆续从从水域沉积物、地下水和土壤等多种环境中分离出异化Fe(III)还原微生物，对部分菌株基因组进行测序，仅在细菌域中异化Fe (Ⅲ)还原微生物在8个门、13个纲、22个目中都有分布。在古生菌中也发现了以Fe(III)作为末端电子受体进行Fe(III)还原作用获得能量而生长的微生物（如嗜高温菌），可见Fe(III)还原微生物在自然界存在的广泛性。猪粪尿中含有大量未消化的有机物质，如淀粉、蛋白质、脂肪、非淀粉碳水化合物等。畜禽废水中的的有机质在兼性厌氧或厌氧条件下经微生物的发酵作用，可产生胺类、挥发性脂肪酸、醇类和芳香类等恶臭化合物。异化Fe(Ⅲ)还原菌代谢能力强，它可通过异化Fe(Ⅲ)还原作用偶联畜禽废水中多种有机污染物的降解。这些特点使得异化Fe(Ⅲ)还原微生物在对畜禽废水恶臭污染控制中起着重要作用。然而，现今大多数技术培养技术只能培养单一的Fe(Ⅲ)还原微生物菌种，培养周期长，且费用较为昂贵。
发明内容
本发明提供了一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，它可通过沉淀的过程较为直观的观测细菌的培养过程，且对培养的混合菌活性及代谢特性进行进一步研究和分析，且较为简便。
本发明采用了以下技术方案：一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是它包括以下步骤：首先，取新鲜粪便粪水5mL, 放入加有灭菌后50mL培养基A的瓶中，并摇匀1~2分钟，然后向放入有粪水和培养基A的瓶中通入N2去除瓶中的O2，用塞子盖紧密封，避光放于30℃厌氧恒温箱中孵育培养3天得到异化Fe(Ⅲ)还原混合菌。
所述的培养基A的制备方法为：，准备培养基B，将培养基B通氮气2~3 min去除O2，120.0℃灭菌15min，待培养基B冷却后，在厌氧培养箱中，将经0.2μm滤膜过滤的乙酸和泛酸加入灭菌后的培养基B中，控制乙酸和泛酸的浓度分别为10 mg·L-1和0.05 mmol·L-1，加入0.2um滤膜过滤的的Fe(Ⅲ)-NTA作为电子受体，控制其浓度为10mmol·L-1，用氢氧化钠调节pH至6.8~7.2制得培养基A。
所述的Fe(Ⅲ)-NTA的制备方法为在70mL无离子水中溶解1.64gNaHCO3，添加2.56gC6H6NO6Na3和2.7gFeCl3·6H2O，溶液定容至100mL，通氮气2~3 min去除O2，并在厌氧无菌操作台上进行过滤并收集的液体，滤液收集于血清瓶中并在厌氧条件下保存。
所述的培养基B制备方法为在 800 mL的去离子水中加入NH4Cl 0.25 g，NaHCO3 2.50 g，KCl 0.10 g，NaH2PO4· H2O 0.60 g，微量矿物质复合溶液10.0 mL，Wolfe微量维生素复合溶液10.0 mL，最后将用无离子水定容该液体培养基至1000 mL。
所述的Wolfe微量维生素复合溶液含有生物素核黄素5.0g·L-1、生物素 2.0 mg·L-1、硫胺素 5.0g·L-1、泛酸5.0g·L-1、烟酸 5.0g·L-1、叶酸2.0g·L-1、氨基苯甲酸5.0g·L-1、维生素B-12 0.1g·L-1、盐酸吡哆醇 10.0g·L-1和硫辛酸 5.0g·L-1。
所述的微量矿物质复合溶液含有NaCl 1.0g·L-1、 ZnCl2 0.13g·L-1、MgSO4 3.0mg·L-1、AlK(SO4)2·12H2O 0.01g·L-1、Na2MoO4 0.025g·L-1、CaCl2·2H2O 0.1g·L-1、MnSO4· H2O 0.5 g·L-1、FeSO4· H2O 0.1g·L-1、CoCl2· 6H2O 0.1g·L-1、 Na2WO4· 2H2O0.025 g·L-1、NiCl2·6H2O 0.024g·L-1、H3BO3 0.01g·L-1、Na2SeO3 0.02g·L-1 和CuSO4·5H2O 0.01g·L-1。
本发明具有以下有益效果：采用了以上技术方案后，本发明可通过沉淀的过程较为直观的观测细菌的培养过程，且对培养的混合菌活性及代谢特性进行进一步研究和分析，且较为简便。经过实例检验证明，通过培养基A培养富集后的异化Fe(Ⅲ)还原菌，较之无菌液空白组，可以较快将畜禽粪水中的Fe(Ⅲ)转换为Fe(II)。菌液组在第16d中的Fe(II)已经达到2447 mg·L-1并保持稳定，而无菌液对照组到第25d，系统内的Fe(II)浓度才达到2416 mg·L-1，较之菌液组延迟了9d。同时，菌液组较之无菌液组在降解畜禽废水中挥发性脂肪酸过程中也具有明显的优势。菌液组在第22d就已经将畜禽粪水中的挥发性脂肪酸降低到110mg·L-1，VFA降解率达到94.76%，而无菌液对照组内的挥发性脂肪酸到第35d才降解至630 mg·L-1，VFA降解率只有70.00%。
附图说明
图1为本发明添加菌液对猪粪尿样品中Fe(Ⅱ)累积影响的示意图。
图2为本发明添加菌液)对猪粪尿样品中VFAs降解影响的示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是它包括以下步骤：
首先，取新鲜粪便粪水5mL, 放入加有灭菌后50mL培养基A的瓶中，并摇匀1~2分钟，然后向放入有粪水和培养基A的瓶中通入N2去除瓶中的O2，用塞子盖紧密封，避光放于30℃厌氧恒温箱中孵育培养3天得到异化Fe(Ⅲ)还原混合菌。
考虑到异化Fe(Ⅲ)还原微生物是厌养微生物，其所处的环境大多是寡营养状态，因而本研究选定培养基的一个原则就是培养基中不含有机质，大多由矿物质和维生素类构成，所述的培养基A的制备方法为将培养基B通氮气2~3 min去除O2， 120.0℃灭菌15min，待培养基B冷却后，在厌氧培养箱中，将经0.2um滤膜过滤的乙酸、泛酸加入灭菌后的培养基B中，控制其浓度分别为10 mg·L-1和0.05 mmol·L-1，加入0.2μm滤膜过滤的的Fe(Ⅲ)-NTA作为电子受体，控制其浓度为10mmol·L-1，用Na(OH)调节至pH至6.8~7.2得到培养基A。所述的Fe(Ⅲ)-NTA的制备方法为在70mL无离子水中溶解1.64g NaHCO3，添加2.56g C6H6NO6Na3和2.7g FeCl3·6H2O，定容至100ml，通氮气2~3 min去除O2，并在厌氧条件下进行无菌过滤后收集的液体，滤液收集于血清瓶中厌氧条件下保存，禁止高温高压灭菌。所述的培养基B制备方法为往800 mL的去离子水中加入NH4Cl 0.25 g，NaHCO3 2.50 g，KCl 0.10 g，NaH2PO4·H2O 0.60 g，微量矿物质复合溶液10.0 mL，Wolfe微量维生素复合溶液10.0 mL，最后将液体培养基用无离子水定容至1000 ml。所述的Wolfe微量维生素复合溶液含有核黄素5.0g·L-1，生物素 2.0 mg·L-1，硫胺素 5.0g·L-1，泛酸5.0g·L-1，烟酸 5.0g·L-1，叶酸2.0g·L-1，氨基苯甲酸5.0g·L-1，维生素B-12 0.1g·L-1，盐酸吡哆醇 10.0g·L-1，硫辛酸 5.0g·L-1。
微量矿物质复合溶液含有NaCl 1.0g·L-1， ZnCl2 0.13g·L-1, MgSO4 3.0 mg·L-1，AlK(SO4)2·12H2O 0.01g·L-1，Na2MoO4 0.025g·L-1，CaCl2·2H2O 0.1g·L-1, MnSO4·H2O 0.5 g·L-1，FeSO4· H2O 0.1g·L-1，CoCl2· 6H2O 0.1g·L-1， Na2WO4· 2H2O 0.025g·L-1，NiCl2·6H2O 0.024g·L-1，H3BO3 0.01g·L-1，Na2SeO3 0.02g·L-1 ，CuSO4· 5H2O0.01g·L-1。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，只要不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
本发明一种所述培养基微量矿物质复合溶液制备方法，于1L容量瓶中加入600ml的水，分别加入NaCl 1.0g·L-1，ZnCl2 0.13g·L-1, MgSO4 3.0 mg·L-1，AlK(SO4)2·12H2O0.01g·L-1，Na2MoO4 0.025g·L-1，CaCl2·2H2O 0.1g·L-1, MnSO4· H2O 0.5 g·L-1，FeSO4· H2O 0.1g·L-1，CoCl2· 6H2O 0.1g·L-1， Na2WO4·2H2O 0.025 g·L-1，NiCl2·6H2O 0.024g·L-1，H3BO3 0.01g·L-1，Na2SeO3 0.02g·L-1，CuSO4· 5H2O 0.01g·L-1，后定容至1000mL备用。
将上述液体培养基分装入多个500mL的锥形瓶中，液体培养基不宜超过锥形瓶的体积的三分之一。利用氮气除去培养基中的氧气后，放入高压灭菌锅120.0℃灭菌15min。待其冷却之后，在厌氧培养箱中，将经0.2μm滤膜过滤的乙酸、泛酸加入灭菌后的培养基中，对应浓度分别为 10 mg·L-1、0.05 mmol·L-1，最后加入经0.2 μm滤膜过滤的Fe(Ⅲ)-NTA作为电子受体，控制其浓度为10 mmol·L-1，此时液体培养基溶液呈透明的橙色。用氢氧化钠调pH至6.8~7.2。
在厌氧培养箱中将灭菌后的液体培养基分装至100mL瓶（已高温灭菌）中，每个瓶中加入培养基50 mL，接种猪粪尿废水5 mL。加塞后，塞外用封口膜密封同时避光保存，放于30℃厌氧培养箱中培养3 d。
将上述液体培养基分150mL装入500mL的锥形瓶中。利用N2除去培养基中的氧气后，放入灭菌锅中灭菌，120.0℃灭菌15min。待培养基冷却后，在厌氧培养箱中，将经0.2μm滤膜过滤的乙酸、泛酸加入灭菌后的培养基中，对应浓度分别为 10 mg·L-1、0.05mmol·L-1，最后加入经0.2μm滤膜过滤的Fe(Ⅲ)-NTA作为电子受体，控制其浓度大小为10mmol·L-1，此时液体培养基溶液呈透明的橙色。用氢氧化钠溶液调pH至6.8~7.2，制得培养基A。
在图1和图2中，当锥形瓶底部出现白色氢氧化亚铁沉淀时，表明血清瓶中含有异化Fe(Ⅲ)还原菌。将初步富集的菌液离心，收集菌体制成菌悬液。接种10mL菌悬液接入到新鲜富集培养基中，经过3周的来回转接获得富集程度较高的异化Fe(III)还原混合菌。
为检验异化Fe(III)还原混合菌偶联降解畜禽废水中挥发性脂肪酸的效果，以柠檬酸铁溶液做为Fe (Ⅲ)末端电子受体，分别向2组容积为1000 mL的棕色广口瓶中各添加猪粪尿400 mL，其中第一组为对照组，仅添加250 moL·L-1柠檬酸铁溶液140 mL；第二组添加异化Fe(Ⅲ)还原菌液80 mL和250 mM的柠檬酸铁溶液140 mL，两组最终用去离子水定容至700 mL。通氮气2~3 min后密封，放置于30℃水浴锅中进行培养。
经过实例检验证明，通过培养基A培养富集后的异化Fe(Ⅲ)还原菌，较之无菌液空白组，可以较快将畜禽粪水中的Fe(Ⅲ)转换为Fe()。菌液组在第16d中的Fe()已经达到2447 mg·L-1并保持稳定，而无菌液对照组到第25d，系统内的Fe()浓度才达到2416 mg·L-1，较之菌液组延迟了9d。其次，无菌液组在降解挥发性脂肪酸也具有明显的滞后性。菌液组在第22d就已经将畜禽粪水中的挥发性脂肪酸降低到110mg·L-1，而无菌液对照组内的挥发性脂肪酸到第35d才降解至630 mg·L-1，VFA降解率只有70%。

Claims (6)

1.一种异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是它包括以下步骤：
首先，取新鲜粪便粪水5mL, 放入加有灭菌后50mL培养基A的瓶中，并摇匀1~2分钟，然后向放入有粪水和培养基A的瓶中通入N2去除瓶中的O2，用塞子盖紧密封，避光放于30℃厌氧恒温箱中孵育培养3天得到异化Fe(Ⅲ)还原混合菌。
2.根据权利要求1所述的异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是所述的培养基A的制备方法为：，准备培养基B，将培养基B通氮气2~3 min去除O2，120.0℃灭菌15min，待培养基B冷却后，在厌氧培养箱中，将经0.2μm滤膜过滤的乙酸和泛酸加入灭菌后的培养基B中，控制乙酸和泛酸的浓度分别为10 mg·L-1和0.05 mmol·L-1，加入0.2um滤膜过滤的Fe(Ⅲ)-NTA作为电子受体，控制其浓度为10mmol·L-1，用氢氧化钠调节pH至6.8~7.2制得培养基A。
3.根据权利要求2所述的异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是所述的Fe(Ⅲ)-NTA的制备方法为在70mL无离子水中溶解1.64gNaHCO3，添加2.56gC6H6NO6Na3和2.7gFeCl3·6H2O，溶液定容至100mL，通氮气2~3 min去除O2，并在厌氧无菌操作台上进行过滤并收集的液体，滤液收集于血清瓶中并在厌氧条件下保存。
4.根据权利要求2所述的异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是所述的培养基B制备方法为在 800 mL的去离子水中加入NH4Cl 0.25 g，NaHCO3 2.50 g，KCl 0.10 g，NaH2PO4· H2O 0.60 g，微量矿物质复合溶液10.0 mL，Wolfe微量维生素复合溶液10.0 mL，最后将用无离子水定容该液体培养基至1000 mL。
5.根据权利要求4所述的异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是所述的Wolfe微量维生素复合溶液含有生物素核黄素5.0g·L-1、生物素 2.0 mg·L-1、硫胺素 5.0g·L-1、泛酸5.0g·L-1、烟酸 5.0g·L-1、叶酸2.0g·L-1、氨基苯甲酸5.0g·L-1、维生素B-12 0.1g·L-1、盐酸吡哆醇 10.0g·L-1和硫辛酸 5.0g·L-1。
6.根据权利要求4所述的异化Fe(Ⅲ)还原混合菌培养方法，其特征是微量矿物质复合溶液含有NaCl 1.0g·L-1、 ZnCl2 0.13g·L-1、MgSO4 3.0 mg·L-1、AlK(SO4)2·12H2O0.01g·L-1、Na2MoO4 0.025g·L-1、CaCl2·2H2O 0.1g·L-1、MnSO4· H2O 0.5 g·L-1、FeSO4· H2O 0.1g·L-1、CoCl2· 6H2O 0.1g·L-1、 Na2WO4· 2H2O 0.025 g·L-1、NiCl2·6H2O 0.024g·L-1、H3BO3 0.01g·L-1、Na2SeO3 0.02g·L-1 和CuSO4· 5H2O 0.01g·L-1。
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