CN105039234B

CN105039234B - 一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群

Info

Publication number: CN105039234B
Application number: CN201510405484.2A
Authority: CN
Inventors: 赵阳国; 郑宇�; 白洁; 田伟君; 胡泓; 佘宗莲; 高孟春; 郭亮
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN105039234A

Abstract

本发明的目的是提供一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群，能够解决纯菌生态位狭窄、无法适应沉积物环境、容易在较短时间内被淘汰、生物量低、代谢缓慢等问题。本发明的复合菌群，包含芽孢杆菌(Bacillus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和脱硫弧菌(Desulfovibrio spp.)。本发明的微生物复合菌群的菌种来源于硫化物含量丰富的近海养殖区沉积物，经过驯化获得，避免了在应用时由于环境差异较大而导致的适应过程；且在去除硫化物的过程中，菌群结构能够保持较好的稳定性。

Description

一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群

技术领域

本发明属于功能微生物复合菌群筛选技术领域，具体涉及一种海水养殖沉积物中硫化物治理的微生物复合菌群、菌群组成、菌群遗传稳定性以及其制备方法。

技术背景

我国是海水养殖大国，在近海养殖区，人们为了提高海水养殖的产量，往往向养殖区投加大量的有机饵料，造成养殖区水体的有机质污染严重。在近海养殖区沉积物-水界面环境中，有机质的有氧降解导致水体中溶解氧大量消耗，造成水体的氧化-还原电位(Eh)降低。在此条件下，沉积物中的硫酸盐还原菌(Sulfate-reducing bacteria，简称SRB)将通过硫酸盐呼吸过程产生大量的硫化物，硫化物在沉积物-水界面大量累积并向上层水体扩散，高浓度硫化物的毒害作用严重威胁着海水中，尤其是底栖的生物，导致养殖区沉积物的“老化”现象，影响海水养殖产业的健康发展。

目前，针对海水养殖区“老化”现象，尤其是硫化物浓度过高的问题，人们多采取物理或化学的方法进行治理，某些物理方法作用不能够持久，而部分化学治理措施二次污染严重，相比而言，选择适合的微生物菌剂用于硫化物消除具有效果持久、环境相容性好、无二次污染等优点。研究发现，利用纯菌去除环境中的污染物，往往存在环境适应性差、生物量低、代谢缓慢等缺点。基于此，研发针对沉积物中高浓度硫化物污染治理的微生物复合菌群具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于消除沉积物中硫化物的微生物复合菌群，能够解决纯菌生态位狭窄、无法适应沉积物环境、容易在较短时间内被淘汰、生物量低、代谢缓慢等问题。

本发明的复合菌群，包含芽孢杆菌(Bacillus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和脱硫弧菌(Desulfovibrio spp.)，作为实施例的一种优选，上述菌群的数量比例为10：6：5：2。

上述的复合菌群用于消除沉积物中的硫化物，优选为海水沉积物。

上述用于消除沉积物中硫化物的复合菌群的筛选方法如下：

1)采集近海养殖区的表层沉积物制成菌悬液；

2)将上述步骤1)的菌悬液按比例接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，驯化培养后得到一级培养液；一级培养液分为两份，一份用于下一步选择培养基的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20℃，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定；

一级选择培养基的配制比例为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S：1.5g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。

3)将上述步骤2)的一级培养液按比例接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，驯化培养后得到二级培养液。二级培养液同样分为两份，其他操作与上述步骤1)中相同；

二级选择培养基的配制比例为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S：2.0g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。

4)将上述步骤3)的二级培养液按比例接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，驯化培养后得到三级培养液。三级培养液同样分为两份，其他操作与上述步骤1)中相同；

三级选择培养基的配制比例为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S：2.5g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。

5)将上述步骤4)的三级培养液按比例接种到无机盐培养基，待细菌生长至对数期后即得到用于沉积物中硫化物消除的复合菌剂。

本发明用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群具有以下优点：

1、本发明的微生物复合菌群，解决了纯菌生态位狭窄、易淘汰、生物量低、代谢缓慢等问题。

2、本发明的微生物复合菌群，菌种来源于硫化物含量丰富的近海养殖区沉积物，经过驯化获得，降低了由于环境差异而导致的应用时的适应过程。

3、本发明的微生物复合菌群在去除硫化物的过程中，菌群结构能够保持结构和组成稳定。

附图说明

图1：本发明中用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群组成。

图2：本发明中用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的稳定性DGGE群落结构分析。

其中，M为近海养殖区10cm内表层沉积物；A1,A2和A3分别为一级、二级、三级培养液；P为保存30天后的菌剂；T1-T5分别为菌剂在硫化物初始浓度200、400、600、800、1000mg/l的无机盐培养基上培养后的群落结构。

图3：本发明用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群对硫化物的去除率随时间的变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的筛选、鉴定及遗传稳定性

(1)用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的筛选

1)采集近海养殖区深度10cm以内的表层沉积物，按10％的体积百分数接种制成菌悬液：

在锥形瓶中，将采集的近海养殖区深度10cm以内的表层沉积物按照10％的体积百分数接种于灭菌的陈海水。将锥形瓶用铝箔封口后置于恒温摇床，30℃，120r/min振荡30min，使沉积物中的细菌充分释放出来。振荡结束后静置30min，待沉积物重新沉淀，上清液即为菌悬液；

2)将上述步骤1)的菌悬液按体积百分数为10％的接种量接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，驯化培养6d后得到一级培养液。一级培养液分为两份，一份用于继续选择培养的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20℃，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定：

在厌氧瓶中，将上述步骤1)的菌悬液按体积百分数为10％的接种量接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，使用N₂吹脱1min，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养6d后得到一级培养液；其中，一级选择培养基的配制比例为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S：1.5g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。

将一份一级培养液使用离心管于4℃，6000r/min离心10min，倒掉上清液，收集沉淀于新的离心管，-20℃保存。

3)将上述步骤2)的一级培养液按体积百分数为10％的接种量接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，驯化培养6d后得到二级培养液。二级培养液分为两份，一份用于继续选择培养的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20℃，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定：

在厌氧瓶中，将上述步骤2)的一级培养液按体积百分数为10％的接种量接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，使用N₂吹脱1min，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，30℃，140r/min振荡培养6d后得到二级培养液；其中，二级选择培养基中Na₂S的配制比例为2.0g/l,其他成分的配制比例以及配制方法与一级培养基相同。

将一份二级培养液使用离心管于4℃，6000r/min离心min，倒掉上清液，收集沉淀于新的离心管，-20℃保存。

4)将上述步骤3)的二级培养液按体积百分数为10％的接种量接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，驯化培养6d后得到三级培养液。三级培养液分为两份，一份用于继续选择培养的接种，另一份离心后收集沉淀保存于-20℃，用于后续微生物复合菌群组成以及稳定性的鉴定：

在厌氧瓶中，将上述步骤3)的二级培养液按体积百分数为10％的接种量接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，使用N₂吹脱1min，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，30℃，130r/min振荡培养6d后得到三级培养液；其中，三级选择培养基中Na₂S的配制比例为2.5g/l,其他成分的配制比例以及配制方法与一级培养基相同。

将一份三级培养液使用离心管于4℃，6000r/min离心min，倒掉上清液，收集沉淀于新的离心管，-20℃保存。

5)将上述步骤4)的三级培养液按体积百分数为10％的接种量接种到无机盐培养基，待细菌生长至对数期后即得到用于硫化物消除的微生物复合菌群：

在厌氧瓶中，将上述步骤4)的三级培养液按体积百分数为10％的接种量接种到无机盐培养基，使用N₂吹脱1min，创造厌氧环境，然后置于恒温摇床，30℃，150r/min振荡培养4d后得到用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群。其中，无机盐培养基为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S₂O₃·5H₂O：2g/l,使用灭菌的陈海水进行配制。

6)将上述步骤5)获得的微生物复合菌群按体积百分数为1％的接种量接种至起始浓度为1000mg/l的无机盐培养基中，30℃,150r/min振荡培养5h后获得菌液，将菌液与65％的甘油按照3:1的比例充分混合后，置于-80℃保存，即可用于微生物复合菌群的保存：

在锥形瓶中，将上述步骤5)获得的微生物复合菌群按体积百分数为1％的接种量接种至1000mg/l的无机盐培养基，使用铝箔封口后置于恒温摇床，30℃,150r/min振荡培养5h后获得菌液。在灭菌的试管中，将菌液与65％的甘油按照3:1的比例加入混合，用铝箔将试管封口后，保存于-80℃冰箱，即为微生物复合菌群的保存。保存后的微生物复合菌群置于30℃的水浴中快速解冻即可重新使用；其中，无机盐培养基为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S₂O₃·5H₂O：3.875g/l，使用灭菌的陈海水进行配制。

步骤1)和步骤5)中的灭菌的陈海水由陈海水通过121℃灭菌20min后冷却至室温制得。

(2)微生物复合菌群的菌种鉴定

1)将实施例1中步骤6)得到的微生物复合菌群使用离心管于4℃，6000r/min离心10min，倒掉上清液，收集沉淀，使用环境微生物样品总群落基因组DNA提取试剂盒(美国MOBIO公司)提取菌剂总DNA，DNA提取方法参考DNA提取试剂盒说明书。

2)以上述步骤1)得到的DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′；BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′进行PCR扩增。PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保存。

3)将PCR产物电泳，采用胶回收试剂盒(大连宝生物公司)切胶回收，回收方法参考胶回收试剂盒说明书。采用T载体试剂盒(大连宝生物公司)，将切胶回收产物与pMD19-T载体连接，并转化DH5α，37℃培养过夜，次日进行阳性菌落的PCR检测。菌落PCR检测时，采用pUC载体通用引物：M13R(-26)：CAGGAAACAGCTATGAC；M13F(-40)：GTTTTCCCAGTCACGAC；直接以菌落为模板进行PCR扩增，反应程序中，预变性温度和时间改为95℃10min，其它不变。挑取25个阳性克隆菌落委托测序公司进行测序。

4)将测得的序列去除载体。通过RDP(https://rdp.cme.msu.edu/)中序列分类程序classifier对序列进行分类，即可得到微生物复合菌群的菌种组成为：芽孢杆菌(Bacillus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和脱硫弧菌(Desulfovibrio spp.)，其数量比例为10：6：5：2。弧菌(Vibrio spp.)是海洋微生物中常见的兼性厌氧细菌，广泛存在于河口入海处、近海岸的海水、海底沉积物以及近海水产养殖生物体内。假单胞菌(Pseudomonas spp.)功能和存在范围十分广泛，从植物根系到水体环境均有分布，能够氧化利用多种类型的有机物。脱硫弧菌(Desulfovibrio spp.)是硫酸盐还原菌，细菌生长时能够代谢硫酸盐，广泛分布于含水量高，有机质丰富的土壤或污泥中。芽孢杆菌(Bacillus spp.)分布广泛，常见于土壤、空气、水体和灰尘中，能利用多种类型的有机物，是一种在厌氧环境下也能很好的生长的革兰氏阳性菌。

(3)复合菌群的群落稳定性

1)将实施例1中步骤1)中用于接种的沉积物，步骤2)、3)、4)中-20℃保存的离心后的培养液沉淀，实施例2步骤3)中离心后的培养基沉淀，共9个样品，使用环境微生物总DNA提取试剂盒(美国MOBIO公司)提取菌剂总DNA，得到9个DNA样品，DNA提取方法参考DNA提取试剂盒说明书。

2)以上述步骤1)中得到的9个DNA样品，以及实施例2步骤1)中得到的DNA，共10个DNA样品为模板，采用细菌16S rDNA通用引物BA101F：5′-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3′；BA534R-GC:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3′，进行PCR扩增。PCR反应程序为：预变性94℃,5min；并接以30个循环包括,94℃变性40s,55℃退火40s,每一循环降0.1℃,72℃延伸1min,循环完毕,72℃延伸5min。

3)将上述步骤2)中的PCR产物采用Bio-Rad公司DcodeTM基因突变检测系统进行DGGE分析。使用梯度混合装置制备30％至60％的变性梯度胶,其中变性剂的浓度自上而下依次递增。待胶凝固后,将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中,取15μL上述步骤2)中的PCR产物和10μL 10×加样缓冲液混合后加入上样孔。在135V的电压下,60℃电泳11h。

4)电泳结束后，剥胶银染，并获取胶的扫描图，见图2，通过对比分析DGGE图谱中群落的结构变化，揭示微生物复合菌群的群落结构的稳定性。根据图2发现，驯化成功的微生物复合菌群，经过多次应用、长期保存后，菌群的群落结构基本保持不变，表现了很好的遗传稳定性。

实施例2：本研究微生物复合菌剂对硫化物去除效果

1)将实施例1中确定的用于沉积物中硫化物消除的微生物复合菌群的筛选”步骤6)的-80℃保存的微生物复合菌群于30℃水浴快速解冻；

2)分别将步骤1)中解冻后的微生物复合菌群按体积百分数为10％的接种量接种于硫化物起始浓度为1000mg/l的无机盐培养基中，于厌氧瓶中，30℃，150r/min恒温振荡培养。其中，无机盐培养基为：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S₂O₃·5H₂O：3.875g/l，使用灭菌的陈海水进行配制。

同时，将实施例1中确定的微生物选取具体的菌种进行(拟态弧菌、脱硫弧菌、嗜盐假单胞菌、枯草芽孢杆菌)分别用无机盐培养基扩大培养后，按照10：6：5：2的数量比进行复配。

3)每隔2小时使用碘量法检测厌氧瓶中硫化物的浓度，并计算硫化物的去除率，结果表明，菌剂在2小时以内开始发挥作用，在10小时对起始浓度为1000mg/l的硫化物的去除率达到90％，结果表明本发明的复合微生物菌群具有高效去除沉积物中硫化物的能力。而复配的菌群，其在10小时对起始浓度为1000mg/l的硫化物的去除率达到95％，效果更好。推测原因是去除了菌群中的其它杂菌后，更好的发挥了复配菌中的协同效应。

Claims

1.一种用于消除沉积物中硫化物的复合菌群，其特征在于，所述的复合菌群包含芽孢杆菌、弧菌、假单胞菌和脱硫弧菌；其中芽孢杆菌、弧菌、假单胞菌和脱硫弧菌的数量比例为10：6：5：2；

所述的复合菌群，其筛选方法如下：

1)采集近海养殖区的表层沉积物为接种源制成菌悬液，

2)将上述步骤1)的菌悬液按比例接种到硫化物浓度为600mg/l的一级选择培养基，驯化培养后得到一级培养液；

3)将上述步骤2)的接种用的一级培养液按比例接种到硫化物浓度为800mg/l的二级选择培养基，驯化培养后得到二级培养液；

4)将上述步骤3)的接种用的二级培养液按比例接种到硫化物浓度为1000mg/l的三级选择培养基，驯化培养后得到三级培养液；

5)将上述步骤4)的接种用的三级培养液按比例接种到无机盐培养基，待细菌生长至对数期后即得到用于沉积物中硫化物消除的复合菌剂；

所述的一级选择培养基的组成如下：K₂HPO₄：1.2g/l，KH₂PO₄：1.2g/l，NH₄Cl:0.4g/l，MgCl₂：0.2g/l，柠檬酸铁：0.01g/l，NaHCO₃：2g/l，Na₂S：1.5g/l；二级、三级选择培养基组成中Na₂S浓度分别提升至2.0g/l和2.5g/L,其它不变；使用灭菌的陈海水进行配制。

2.权利要求1所述的复合菌群在生物消除沉积物中的硫化物的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的沉积物为海水沉积物。