CN107312715A - 一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法 - Google Patents

一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，该方法通过模拟反硝化聚磷菌的生存环境，设计了厌氧‑缺氧两相交替条件，分别在厌氧相采用含外加碳源无磷培养基和缺氧相采用无外加碳源含磷培养基进行筛选，接着将驯化培养液稀释后涂布筛选出单株菌，然后将筛选出的单株菌分别点种在含5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基磷酸酯高、低磷固体培养基上，挑选在上述两种培养基中同时出现蓝斑的菌株，将其在BTB反硝化培养基中划线培养，挑选使培养基变蓝的菌株。本发明具有选择性强、工作量小、能大大缩短筛选周期等优点。

Description

一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种高效、快速的两相法筛选反硝化聚磷菌方法。
背景技术
在我国的水体污染问题中，水体富营养化污染尤为严重，而氮、磷污染物是导致众多水体富营养化的主要因素。每年有接近600亿吨携带着大量的氮和磷的废水进入水体，造成水体富营养化，进而引起水环境藻类大量繁殖，消耗水中的溶解氧，影响水中生物的生长。所以开发高效经济的污染水体脱氮除磷技术具有重要意义。
硝化菌与传统聚磷菌的菌龄不同，反硝化菌与聚磷菌存在碳源上的竞争，使得传统的生物脱氮除磷处理过程存在着很大矛盾，而反硝化聚磷菌(Denitrif yingPhosphorus Accumulating Organisms，DPAOs)能解决这一矛盾。它能在厌氧-缺氧交替的环境下实现厌氧释磷，缺氧条件下，以硝酸盐作为电子受体，通过DPAOs代谢同时完成反硝化与过量吸磷的过程，解决碳源利用和泥龄差异问题。该过程比传统工艺节省50％的COD和30％的耗氧量。
目前国内外对DPAOs的种类、除磷机理及影响DPAOs的脱氮除磷效果的主要因素有了一定的研究，在DPAOs的富集筛选方法上也有了一定的积累，但是筛选过程都存在工作量比较大、耗时较长等缺点。目前比较常规的筛选方法是在模拟SBR反应器中先进行富集，然后在通过固体培养基进行分离纯化，筛得单菌落再进行除磷效果试验、反硝化产气试验或在BTB(含溴百里酚蓝)固体反硝化培养基中鉴定反硝化能力。该方法的富集过程需要1-2个月时间，并且外加碳源的加入使杂菌滋生，消耗了外加碳源，降低了筛菌的针对性，使得筛菌的效率大大降低。
碱性磷酸酯酶是一种单酯磷酸水解酶，能催化磷酸单酯水解生成无机磷酸盐和相应的醇或酚，是参与细胞磷代谢的主要酶类。现有的研究表明，在磷含量较低的条件下，聚磷菌的碱性磷酸酯酶的表达不受抑制，菌株可以将5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯水解成蓝色的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯二聚体微粒，使菌株细胞被染成蓝色。但在磷含量较高的条件下，菌株的碱性磷酸酯酶的表达受抑制，菌株不被染色。然而，如果菌株的phoU基因发生突变，即使在高磷含量的条件下，碱性磷酸酯酶的表达也不再受到高磷浓度的限制，菌株可以把5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯水解成蓝色的5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯二聚体微粒，使得细胞被染成蓝色。故可以利用菌株能够在低、高磷含量的条件下均能使5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯水解而自身变蓝的原理来筛选出具有高效聚磷功能的菌株。
本发明根据DPAOs的生长特点，采用两相法快速筛菌，交替模拟厌氧-缺氧条件，分别选用不同的培养基，大大缩短了菌株富集时间，采用含5-溴-4氯-3-吲哚基磷酸酯的固体培养基进行具有高效聚磷能力的菌株筛选，并用BTB反硝化固体培养基筛选出反硝化聚磷菌，最终大大缩短了筛菌时间。
发明内容
本发明的目的在于克服现有反硝化聚磷菌富集筛选方法存在的工作量大、耗时长等不足，提供一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法。该方法通过模拟反硝化聚磷菌的生存环境，设计厌氧-缺氧两相交替条件，分别在厌氧相采用含外加碳源无磷培养基、缺氧相采用无外加碳源含磷培养基进行选择性筛选，极大的缩短了筛选周期。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，包括以下步骤：(a)首先将活性污泥与水混合后震荡培养，离心后弃去上清液得混合物；(b)按比例向混合物中加入含外加碳源无磷培养基，进行厌氧培养；(c)步骤(b)所得厌氧培养液离心后弃去上清液，按比例加入无外加碳源含磷培养基，进行缺氧培养；(d)步骤(c)所得缺氧培养液离心后弃去上清液，按照步骤(b)和(c)的方法交替进行厌氧培养和缺氧培养多次；(e)依次采用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基、BTB反硝化固体培养基筛选出目标菌株。
按照上述方案，步骤(a)中按照1:7.5-14的体积比将活性污泥与水混合，在30℃恒温振荡培养20-24h，离心后弃去上清液。
按照上述方案，步骤(b)中按照活性污泥：含外加碳源无磷培养基1:7.5-14的体积比向混合物中加入含外加碳源无磷培养基，通氮气后密封，在30℃恒温厌氧培养20-24h。
按照上述方案，步骤(c)中按照活性污泥：无外加碳源含磷培养基1:7.5-14的体积比加入无外加碳源含磷培养基，在30℃恒温缺氧培养20-24h。
按照上述方案，步骤(d)中按照步骤(b)和(c)的方法交替进行厌氧培养和缺氧培养各5-7次，步骤(e)中将驯化培养液稀释后涂布筛选出单株菌，分别点种在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基中，挑选出在两种5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基中同时出现蓝斑的菌株，所得菌株在BTB反硝化培养基中划线培养，挑选出使BTB反硝化培养基变蓝的菌株。
上述方案中，所述含外加碳源无磷培养基成分包括：1-2g/LCH3COONa，0.1-0.15g/LNH4Cl，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，pH值为7.0-8.0，1.0-1.5MPa灭菌10-15min；所述无外加碳源含磷培养基成分包括：0.02-0.04g/LKH2PO4，0.15-0.2g/LKNO3，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，pH值为7.0-8.0，1.0-1.5MPa灭菌10-15min。
上述方案中，所述5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基，其中5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基成分包括：1-2g/LCH3COONa，0.1-0.15g/LNH4Cl，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.01-0.02g/LKH2PO4，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，15-20g/L琼脂，pH值为7.0-7.5，1.0-1.5MPa灭菌10-15min；5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基成分包括：1-2g/LCH3COONa，0.1-0.15g/LNH4Cl，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.1-0.15g/LKH2PO4，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5mL/L微量元素溶液，15-20g/L琼脂，pH值为7.0-7.5，1.0-1.5MPa灭菌10-15min；制备时待两种5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基冷却后，在其表面涂布0.1-0.2ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂。
上述方案中，所述5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂中5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯的浓度为50-100mg/L，N-N二甲基甲酰胺的浓度为10-20mL/L。
上述方案中，所述BTB反硝化固体培养基成分包括：1-2g/LNa3C6H5O7·2H2O，1.0-1.2g/LKNO3，1-1.5g/LKH2PO4，0.2-0.5g/LMgSO4·7H2O，0.1-0.2g/LCaCl2，1-1.5ml/L微量元素，1-1.5mL 1wt％的溴百里酚蓝，15-20g/L琼脂，pH值为6.5-7.0，1.0-1.5MPa灭菌10-15min。
上述方案中，所述微量元素溶液成分包括：5-8g/LEDTA，1-1.5g/LFeCl3·6H2O，0.1-0.15g/LH3BO3，0.02-0.03g/LCuSO4·5H2O，0.18-0.2g/LKI，0.1-0.12g/LMnCl2·4H2O，0.05-0.1g/LNa2MoO4·2H2O，0.1-0.12g/LZnSO4·7H2O，0.1-0.15g/LCoCl2·6H2O，pH值为7.0-7.5，1.0-1.5MPa灭菌10-15min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)通过模拟反硝化聚磷菌生长环境的厌氧-缺氧两相交替条件，配合厌氧相含外加碳源无磷培养基和缺氧相无外加碳源含磷培养基进行筛选，解决了因外加碳源的加入使杂菌滋生，造成碳源竞争的矛盾；(2)提高了选择性，能在5个周期内使系统的聚磷能力达到90％以上，能在短时间内迅速提高系统中具有聚磷能力的菌株量，并且使反硝化聚磷菌达到系统的90％以上，成为优势菌群；(3)与传统的模拟SBR反应器需耗时1-2月进行富集筛选反硝化聚磷菌相比，减小了工作量，大大缩短筛选周期。
具体实施方式
为使本领域技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
实施例1
第一步：活性污泥的预处理
取20ml活性污泥于250ml锥形瓶中，加入150ml蒸馏水，在110rpm转速、30℃下恒温振荡培养24h，接着在4000rpm转速下离心，用倾析法弃去上清液得混合物。
第二步：厌氧相恒温培养
将混合物置于250ml锥形瓶中，加入150ml厌氧相含外加碳源无磷培养基，通入氮气10min，用封口膜迅速封住瓶口，置于110rpm转速、30℃下恒温振荡培养24h(DO<0.1mg/L)。厌氧培养完成后取水样检测其总磷含量。
其中，厌氧相含外加碳源无磷培养基包括以下组成：
2g/L CH3COONa；0.15g/L NH4Cl；
0.2g/L MgSO4；0.015g/L CaCl2；
0.1g/L NaCl；1ml/L微量元素溶液；
pH值为7.5；1.5MPa灭菌15min。
所述微量元素溶液包括以下组成：
8g/L EDTA；1.5g/L FeCl3·6H2O；
0.1g/L H3BO3；0.03g/L CuSO4·5H2O；
0.2g/L KI；0.12g/L MnCl2·4H2O；
0.05g/L Na2MoO4·2H2O；0.1g/L ZnSO4·7H2O；
0.15g/L CoCl2·6H2O；
pH值为7.0；1.5MPa灭菌15min。
第三步：缺氧相恒温培养
将厌氧相恒温培养液在4000rpm转速下离心后，用倾析法弃去上清液。置于250ml锥形瓶中加入150ml缺氧相无外加碳源含磷培养基。置于110rpm转速的30℃恒温振荡箱振荡培养24h(DO为0.3-0.5mg/L)。缺氧培养完成后取水样检测其总磷含量。
所述的缺氧相无外加碳源含磷培养基包括以下组成：
0.04g/L KH2PO4；0.15g/L KNO3；
0.2g/L MgSO4；0.015g/L CaCl2；
0.1g/L NaCl；1ml/L微量元素溶液；
pH值为7.5；1.5MPa灭菌15min。
所述的微量元素溶液包括以下组成：
8g/L EDTA；1.5g/L FeCl3·6H2O；
0.1g/L H3BO3；0.03g/L CuSO4·5H2O；
0.2g/L KI；0.12g/L MnCl2·4H2O；
0.05g/L Na2MoO4·2H2O；0.1g/L ZnSO4·7H2O；
0.15g/L CoCl2·6H2O；
pH值为7.0；1.5MPa灭菌15min。
第四步：缺氧相恒温培养
交替重复步骤二、三多次，培养完成后取水样检测其总磷含量，结果如表1所示。
表1厌氧相-缺氧相交替培养的水样总磷变化
从表1可知，该系统中在第4个周期时的吸磷率达到峰值90.77％。第5个周期吸磷率开始下降，说明该系统的耐受能力已经达到极限，可以进行下一步的筛菌。
第五步：筛选具有聚磷能力的细菌
将驯化培养液稀释成浓度梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的溶液，在恒温培育箱中培养48h，挑选出单菌并在含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基和含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基中划线，在30℃恒温培养箱中培育2天，挑选出能使高磷固体培养基和低磷固体培养基均变蓝色的菌株，筛选结果如表2所示。
所述含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基包括以下组成：
2g/L CH3COONa；0.15g/L NH4Cl；
0.2g/L MgSO4；0.015g/L CaCl2；
0.02g/L KH2PO4；0.1g/L NaCl；
1ml/L微量元素溶液；20g/L琼脂；
pH值为7.5；1.5MPa灭菌15min。
低磷固体培养基冷却后，在其表面涂布0.1ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂。该5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂中5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯的浓度为50mg/L，N-N二甲基甲酰胺的浓度为10ml/L。
所述5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基包括以下组成：
2g/L CH3COONa；0.15g/L NH4Cl；
0.2g/L MgSO4；0.015g/L CaCl2；
0.15g/L KH2PO4；0.1g/L NaCl；
1ml/L微量元素溶液；20g/L琼脂；
pH值为7.5；1.5MPa灭菌15min。
高磷固体培养基冷却后，在其表面涂布0.1ml同样的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂。
表2具有聚磷能力菌株筛选结果
从表2可知，在进行了5轮驯化之后，具有聚磷能力的菌株占菌株的比例为91.67％，具有聚磷能力的菌株为系统中的优势菌。
第六步：BTB反硝化固体培养基筛选出反硝化聚磷菌
将能使高磷固体培养基和低磷固体培养基均变蓝色的菌株，在BTB反硝化固体培养基中划线，置于30℃恒温培育箱中培养48h，挑选出能使培养基变蓝色的菌株，该类菌株为反硝化聚磷菌，筛选结果如表3所示。
所述BTB反硝化培养基包括以下组成：
2g/L Na3C6H5O7·2H2O；1.0g/L KNO3；
1g/L KH2PO4；0.2g/L MgSO4·7H2O；
0.2g/L CaCl2；1ml/L微量元素；
1ml 1wt％的溴百里酚蓝；20g/L琼脂；
pH值为7.0；1.5MPa灭菌15min。
所述微量元素溶液包括以下组成：
8g/L EDTA；1.5g/L FeCl3·6H2O；
0.1g/L H3BO3；0.03g/L CuSO4·5H2O；
0.2g/L KI；0.12g/L MnCl2·4H2O；
0.05g/L Na2MoO4·2H2O；0.1g/L ZnSO4·7H2O；
0.15g/L CoCl2·6H2O；
pH值为7.0；1.5MPa灭菌15min。
表3反硝化聚磷菌筛选结果
从表3可知，反硝化聚磷菌占具有聚磷能力的菌株的比例为90.9％，故该方法在运行5轮后，具有聚磷能力的菌占优势，其中反硝化聚磷菌占90.9％，为系统中的优势菌群。

Claims (10)

1.一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)首先将活性污泥与水混合后震荡培养，离心后弃去上清液得混合物；(b)按比例向混合物中加入含外加碳源无磷培养基，进行厌氧培养；(c)将步骤(b)所得厌氧培养液离心后弃去上清液，按比例加入无外加碳源含磷培养基，进行缺氧培养；(d)将步骤(c)所得缺氧培养液离心后弃去上清液，按照步骤(b)和(c)的方法交替进行厌氧培养和缺氧培养多次；(e)依次采用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基、BTB反硝化固体培养基筛选出目标菌株。
2.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于：步骤(a)中按照1:7.5-14的体积比将活性污泥与水混合，在30℃恒温振荡培养20-24h，离心后弃去上清液。
3.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于：步骤(b)中按照活性污泥：含外加碳源无磷培养基＝1:7.5-14的体积比向混合物中加入含外加碳源无磷培养基，通氮气后密封，在30℃恒温厌氧培养20-24h。
4.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于：步骤(c)中按照活性污泥：无外加碳源含磷培养基1:7.5-14的体积比加入无外加碳源含磷培养基，在30℃恒温缺氧培养20-24h。
5.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于：步骤(d)中按照步骤(b)和(c)的方法交替进行厌氧培养和缺氧培养各5-7次，步骤(e)中将驯化培养液稀释后涂布筛选出单株菌，分别点种在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基中，挑选出在两种5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基中同时出现蓝斑的菌株，所得菌株在BTB反硝化培养基中划线培养，挑选出使BTB反硝化培养基变蓝的菌株。
6.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于，所述含外加碳源无磷培养基成分包括：1-2g/LCH3COONa，0.1-0.15g/LNH4Cl，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，pH值为7.0-8.0，1.0-1.5MPa灭菌10-15min；所述无外加碳源含磷培养基成分包括：0.02-0.04g/LKH2PO4，0.15-0.2g/LKNO3，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，pH值为7.0-8.0，1.0-1.5MPa灭菌10-15min。
7.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于：所述5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基，其中5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯低磷固体培养基成分包括：1-2g/LCH3COONa，0.1-0.15g/LNH4Cl，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.01-0.02g/LKH2PO4，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，15-20g/L琼脂，pH值为7.0-7.5，1.0-1.5MPa灭菌10-15min；5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯高磷固体培养基成分包括：1-2g/LCH3COON a，0.1-0.15g/LNH4Cl，0.18-0.2g/LMgSO4，0.01-0.015g/LCaCl2，0.1-0.15g/LKH2PO4，0.1-0.15g/LNaCl，1-1.5ml/L微量元素溶液，15-20g/L琼脂，pH值为7.0-7.5，1.0-1.5MPa灭菌10-15min；制备时待两种5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯固体培养基冷却后，分别在其表面涂布0.1-0.2ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂。
8.根据权利要求7所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯指示剂中5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯的浓度为50-100mg/L，N-N二甲基甲酰胺的浓度为10-20ml/L。
9.根据权利要求1所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于，所述BTB反硝化固体培养基成分包括：1-2g/LNa3C6H5O7·2H2O，1.0-1.2g/LKNO3，1-1.5g/LKH2PO4，0.2-0.5g/LMgSO4·7H2O，0.1-0.2g/LCaCl2，1-1.5ml/L微量元素，1-1.5mL 1wt％的溴百里酚蓝，15-20g/L琼脂，pH值为6.5-7.0，1.0-1.5MPa灭菌10-15min。
10.根据权利要求6或7或9所述的一种两相法快速筛选反硝化聚磷菌的方法，其特征在于，所述微量元素溶液成分包括：5-8g/LEDTA，1-1.5g/LFeCl3·6H2O，0.1-0.15g/LH3BO3，0.02-0.03g/LCuSO4·5H2O，0.18-0.2g/LKI，0.1-0.12g/LMnCl2·4H2O，0.05-0.1g/LNa2MoO4·2H2O，0.1-0.12g/LZnSO4·7H2O，0.1-0.15g/LCoCl2·6H2O，pH值为7.0-7.5，1.0-1.5MPa灭菌10-15min。
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