CN102373155A

CN102373155A - 多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法

Info

Publication number: CN102373155A
Application number: CN 201010249762
Authority: CN
Inventors: 宫小燕; 刘洪娟; 陆雅海
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-08-10
Filing date: 2010-08-10
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2030-08-10
Also published as: CN102373155B

Abstract

本发明提供了一种多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法，包括1)制备多环芳烃降解菌系、2)筛选多环芳烃降解菌、3)对纯化的降解菌进行复筛三个步骤，所述步骤1)是在无机盐培养基中加入水稻秸秆和滤纸，高温蒸气灭菌后，再加入多环芳烃；以受多环芳烃污染的土壤为菌源，将其接入上述培养基中，摇床避光培养至培养液变为深棕色；将上述培养液进行传代培养，每次传代培养时培养基中水稻秸秆的加入量均比上一代减少，且不再添加滤纸，每次传代培养均以培养液变为深棕色为传代标准，传代培养在五代以上。本发明方法缩短了筛选时间，且能够得到高效降解菌系和降解菌。

Description

多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法

技术领域

本发明属于受污染土壤与水的生物修复技术领域，具体地说，涉及多环芳烃好氧降解菌的快速富集、筛选方法。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上苯环连在一起构成的烃类化合物，其中许多种类具有致癌、致畸、致突变作用，而且其毒性和致癌性随着苯环数目的增加而增加。由于PAHs分子中存在共扼大π键电子体系，具有较高的稳定性，而成为环境中持久性污染物。

环境中PAHs主要来源于人类活动，如石油冶炼、运输业、煤气制造等。由于石油及石油产品的大量使用，环境中多环芳烃有不断增多的趋势，而且分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中都检测到多种PAHs的存在。

环境中的PAHs主要依靠微生物的降解作用去除，而PAHs的好氧生物降解比厌氧生物降解的速率要快很多倍，因此，筛选出高效好氧降解菌是多环芳烃污染土壤生物修复技术的一个关键。

目前常用的筛选方法是液体摇瓶培养法，其是在无机盐液体培养基中添加固体或有机溶剂溶解的多环芳烃，然后接入土壤等菌源，摇床培养，富集并筛选多环芳烃降解菌。例如，Singleton等人在无机盐培养基中加入菲，摇瓶培养后平板稀释，从而得到菲降解菌(Appliedand Environmental Microbiology，75(9)：2613-2620，2009)。

但是，由于四环及其以上的多环芳烃的分子量大、疏水性强、水溶性低，因此目前常用的摇瓶培养法仅适合于筛选三环及三环以下多环芳烃的降解菌，而对于四环及其以上多环芳烃的降解微生物的筛选，会出现周期长、筛出机率小，筛出的降解菌系稳定性差、降解率不高等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法，该方法筛选时间短，更易得到高效降解菌系和降解菌，特别适合于筛选四环及其以上多环芳烃的降解菌。

为了实现上述目的，本发明的多环芳烃好氧降解菌的富集、筛选方法包括1)制备多环芳烃降解菌系、2)筛选多环芳烃降解菌及3)对纯化的降解菌进行复筛三个步骤，其中，所述步骤1)是在无机盐培养基中加入水稻秸秆和滤纸，高温蒸气灭菌后，再加入多环芳烃；以受多环芳烃污染的土壤为菌源，将其接入上述培养基中，摇床避光培养至培养液变为深棕色；将上述培养液进行传代培养，每次传代培养时培养基中水稻秸秆的加入量均比上一代减少，且不再添加滤纸，每次传代培养均以培养液变为深棕色为传代标准，传代培养在五代以上，最后一代培养时培养基中不再添加水稻秸秆。

其中，所述多环芳烃包括芘或荧蒽，或其他四环以上多环芳烃；多环芳烃的加入量是使其终浓度为200mg/L。

所述水稻秸秆的加入量为无机盐培养基重量的0.3～0.5％，传代培养时水稻秸秆的加入量均比上一代减少1/3；所述滤纸为5cm×1cm的滤纸条。

所述菌源是将受多环芳烃污染的土壤制成浓度为12.5g/mL的菌悬液，并按培养液体积的5～10％接种；所述摇床避光培养的条件为：温度28～30℃、转速150rpm、培养时间为14～21天。

此外，步骤2)筛选多环芳烃降解菌用本领域常用方法即可，例如按如下方法进行筛选：

在无机盐培养基中加入琼脂，高温蒸气灭菌后，倒于平板上，待培养基凝固后，加入步骤1)中所述多环芳烃的丙酮溶液，分布均匀后静置使丙酮挥发；将步骤1)制得的多环芳烃降解菌系培养液经梯度稀释后涂布于上述平板上，30℃温度下培养7～14天；挑取周围有透明圈的菌落，接种于新的上述固体平板上划线分离，得到纯化的降解菌。

其中，所述琼脂的添加量为无机盐培养基重量的1.5～2％；所述多环芳烃的丙酮溶液的浓度为5g/L；所述无机盐培养基与多环芳烃的丙酮溶液的体积比为50～100∶1；所述梯度稀释是将上述多环芳烃降解菌系培养液按体积分别稀释10³、10⁴、10⁵倍。

此外，步骤3)对纯化的降解菌进行复筛使用本领域常用方法即可，也可以使用如下方法进行复筛：

所述步骤3)是将步骤2)得到的降解菌接种于LB平板培养基中，长出菌落后，制成浓度为OD₆₀₀＝1的菌液，备用；在血清瓶中加入上述多环芳烃的丙酮溶液，待丙酮挥发后，加入无机盐培养基，将上述菌液接入血清瓶中，30℃温度下避光摇床培养7～14天；用高效液相色谱(HPLC)方法测定剩余的多环芳烃，计算降解率，选取降解率在90％以上的菌株。

其中，所述菌液按本领域常用方法制备即可，如将菌种刮于含玻璃珠的无菌水中，将菌打散形成菌液。

所述多环芳烃的丙酮溶液的浓度为5g/L；所述菌液、多环芳烃的丙酮溶液及无机盐培养基的体积比为2.5～5∶1∶100；所述LB平板培养基的组成为：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000ml、琼脂粉15g、pH为7.2～7.4。

本发明所述的无机盐培养基的组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 8.8g、KH₂PO₄3.0g、NH₄NO₃1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.246g、FeCl₃0.05g、CaCl₂0.02g、微量元素溶液2.5mL、蒸馏水1000mL。

其中，所述微量元素溶液的组成为：MnSO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.03g、CoCl₂.6H₂O 0.04g、CuCl₂.2H₂O 0.01g、NiCl₂.6H₂O 0.02g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.03g、ZnCl₂0.05g、pH＝7、蒸馏水1000mL。

本发明方法在培养基的配制过程中，添加了一定量的水稻秸秆和滤纸，利用水稻秸秆和滤纸的协同作用，缩短降解菌的筛选时间，有利于得到高效降解菌系和降解菌。其原理是：水稻秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，三者相互交织形成植物细胞壁，结构复杂且难以降解；但滤纸降解可以为秸秆中纤维素的降解提供大量微生物和诱导物，从而诱导秸秆的降解；而秸秆的降解为培养液富集了大量强力降解难降解天然有机物的微生物，从而为PAHs的降解提供更多的菌株；此外，四环及其以上的多环芳烃的水溶性低，极易吸附到颗粒物上，而滤纸可以作为载体，增加了微生物与多环芳烃的接触机会，从而进一步缩短降解菌的筛选时间，并且更易得到高效降解菌系和降解菌。

本发明提供的筛选方法可以在传代培养5次(约3个月)后即可获得四环及其以上多环芳烃降解菌的菌系，大大缩短了筛选时间；并且得到的降解菌系降解效果稳定，连续传代三次，每次对四环及其以上多环芳烃的降解率均在90～96％；经过复筛得到的纯化的降解菌，培养14天对30mg/L的多环芳烃的降解率可以达到90％以上。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)菌源的采集和菌悬液的制备：采集焦化厂周围受多环芳烃污染的土壤，立即置于4℃冰箱内保存备用；取20g采集的土壤置于250mL的无菌水中，30℃振荡12小时，制成菌悬液；

(2)富集、筛选培养基的配制：在50mL无机盐培养基中加入0.3％(重量)水稻秸秆和5cm×1cm的滤纸条，高温蒸气灭菌；灭菌后向培养基中加入0.01g荧蒽，使其终浓度达到200mg/L，配制成以荧蒽为唯一碳源的无机盐培养基；

无机盐培养基的组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 8.8g、KH₂PO₄3.0g、NH₄NO₃1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.246g、FeCl₃0.05g、CaCl₂0.02g、微量元素溶液2.5mL、蒸馏水1000mL；其中，微量元素溶液的组成为：MnSO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.03g、CoCl₂·6H₂O 0.04g、CuCl₂·2H₂O0.01g、NiCl₂·6H₂O 0.02g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.03g、ZnCl₂0.05g、pH＝7、蒸馏水1000mL(注：以下使用的无机盐培养基的组成均与此相同)；

(3)荧蒽降解菌的富集：在上述培养基中加入5mL步骤(1)制得的菌悬液，摇床避光培养至培养液变为深棕色，培养温度为30℃，转速为150rpm，约培养21天；

(4)传代培养：按照步骤(2)方法配制荧蒽无机盐培养液，但水稻秸秆的加入量减少1/3，且不再添加滤纸；将5mL步骤(3)得到的培养液接种于新的培养基中进行传代培养，接种比例为10％(体积)，按步骤3)的培养条件培养至菌液变为深棕色；

重复传代培养，每传代一次，培养基中水稻秸秆的加入量均比上一代减少1/3，且培养时间逐代缩短；至第五代时培养基中不再添加水稻秸秆，且培养时间缩短为14天，此时得到降解荧蒽的菌系；

(5)配制无机盐荧蒽的固体平板培养基：在25mL无机盐培养基中添加1.5％(重量)的琼脂，高温蒸气灭菌后，倒于灭菌的平板上，待培养基凝固后，加入0.5mL浓度为5g/L的荧蒽的丙酮溶液，转动培养皿使丙酮溶液分布均匀，将培养皿在超净台中放置2天，使丙酮挥发；

(6)获得纯化的荧蒽降解菌：将步骤(4)得到的荧蒽降解菌系分别稀释10³、10⁴、10⁵倍(体积)，涂布于上述固体平板上，30℃培养14天；挑取周围有透明圈的菌落，接种于新的固体平板上划线分离，最终得到纯化的荧蒽降解菌；

(7)对纯化的降解菌进行复筛：将步骤(6)得到的荧蒽降解菌接种于LB平板培养基中，培养6天，待长出菌落后，将菌种刮于含玻璃珠的无菌水中，将菌打散形成菌液，调节菌液的浓度为OD₆₀₀＝1，备用；血清瓶中加入0.2mL 5g/L的多环芳烃丙酮溶液，待丙酮挥发后，加入20mL无机盐培养基，培养基中荧蒽的最终浓度为100mg/L，取0.5mL上述菌液接入血清瓶中，30℃温度下避光摇床培养14天；用高效液相色谱方法HPLC测定剩余的荧蒽，选取降解率在90％以上的菌株作为高效降解菌；

其中，LB培养基的组成为：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000ml、琼脂粉15g、pH 7.2～7.4；

最终得到的荧蒽降解菌系能够以荧蒽为底物生长，好氧降解试验结果表明菌群能够对荧蒽进行有效的好氧降解；当荧蒽的初始浓度为50mg/L时，14天后降解率达到96％。此外，该降解菌还能够降解芘，好氧降解试验表明该降解菌能够以芘或芘和荧蒽的混合物为底物生长，当以芘和荧蒽的混合物为底物时，14天后芘的降解率达到96％(初始浓度为114mg/L)；荧蒽的降解率达到99％(初始浓度为140mg/L)。

实施例2

(1)菌源的采集和菌悬液的制备：与实施例1相同；

(2)富集、筛选培养基的配制：在50mL无机盐培养基中加入0.5％(重量)水稻秸秆和5cm×1cm的滤纸，高温蒸气灭菌，然后加入0.01g芘，使其终浓度达到200mg/L，配制成以芘为唯一碳源的无机盐培养基；

(3)降解菌的富集：在上述培养基中加入2.5mL步骤(1)制得的菌悬液，摇床避光培养至培养液变为深棕色，培养条件为：温度为28℃，转速为150rpm，约培养21天；

(4)传代培养：在步骤3)的培养条件下，按实施例1方法进行传代培养；

(5)配制无机盐荧蒽的固体平板培养基：在50mL无机盐培养基中添加2％的琼脂，高温蒸气灭菌后，倒于灭菌的平板上，待培养基凝固后，加入0.5mL浓度为5g/L芘的丙酮溶液，转动培养皿使丙酮溶液分布均匀，将培养皿在超净台中放置2天，使丙酮挥发；

(6)获得纯化的荧蒽降解菌：将步骤(4)得到的降解菌系分别稀释10³、10⁴、10⁵倍(体积)，涂布于上述固体平板上，30℃培养14天；挑取周围有透明圈的菌落，接种于新的固体平板上划线分离，最终得到纯化的荧蒽降解菌；

(7)对纯化的降解菌进行复筛：将步骤(6)得到的芘降解菌接种于LB平板培养基中，培养3天，待长出菌落后，将菌种刮于含玻璃珠的无菌水中，将菌打散形成菌液，调节菌液的浓度为OD₆₀₀＝1，备用；血清瓶中加入0.2mL 5g/L的多环芳烃丙酮溶液，待丙酮挥发后，加入20mL无机盐培养基，培养基中荧蒽的终浓度为100mg/L，取1mL上述菌液接入血清瓶中，30℃温度下避光摇床培养14天；用HPLC方法测定剩余的荧蒽，选取降解率在90％以上的菌株作为高效降解菌；

其中，LB培养基的组成与实施例1相同。

最终得到的芘降解菌系能够以芘为底物生长，好氧降解试验结果表明菌群能够对芘进行有效的好氧降解；当芘的初始浓度为100mg/L时，14天后降解率达到96％。此外，该降解菌还能够同时降解荧蒽，好氧降解试验表明该降解菌能够以芘或芘和荧蒽的混合物为底物生长，当以芘和荧蒽的混合物为底物时，14天后芘的降解率达到98.3％(初始浓度为75mg/L)；荧蒽的降解率达到97.6％(初始浓度为82mg/L)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.多环芳烃好氧降解菌的富集筛选方法，包括1)制备多环芳烃降解菌系、2)筛选多环芳烃降解菌及3)对纯化的降解菌进行复筛三个步骤，其特征在于，所述步骤1)是在无机盐培养基中加入水稻秸秆和滤纸，高温蒸气灭菌后，再加入多环芳烃；以受多环芳烃污染的土壤为菌源，将其接种于上述培养基中，摇床避光培养至培养液变为深棕色；将上述培养液进行传代培养，每次传代培养时培养基中水稻秸秆的加入量均比上一代减少，且不再添加滤纸，每次传代培养均以培养液变为深棕色为传代标准，传代培养在五代以上。

2.根据权利要求1所述的富集筛选方法，其特征在于，所述多环芳烃为芘或荧蒽；多环芳烃的加入量为使终浓度达到200mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的富集筛选方法，其特征在于，所述水稻秸秆的加入量为无机盐培养基重量的0.3～0.5％。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的富集筛选方法，其特征在于，所述摇床避光培养的条件为：温度28～30℃、转速150rpm、培养时间为14～21天。

5.根据权利要求1所述的富集筛选方法，其特征在于，所述步骤2)是在无机盐培养基中加入琼脂，高温蒸气灭菌后，倒于平板上，待培养基凝固后，加入所述多环芳烃的丙酮溶液，分布均匀后静置使丙酮挥发；将步骤1)制得的多环芳烃降解菌系培养液经梯度稀释后涂布于上述平板上，30℃温度下培养7～14天；挑取周围有透明圈的菌落，接种于新的上述固体平板上划线分离，得到纯化的降解菌。

6.根据权利要求5所述的富集筛选方法，其特征在于，所述多环芳烃的丙酮溶液的浓度为5g/L；所述琼脂的添加量为无机盐培养基重量的1.5～2％；所述无机盐培养基与多环芳烃的丙酮溶液的体积比为50～100∶1；所述梯度稀释是将培养液按体积分别稀释10³、10⁴、10⁵倍。

7.根据权利要求1所述的富集筛选方法，其特征在于，所述步骤3)是将步骤2)得到的降解菌接种于LB平板培养基中，在降解菌长出菌落后，制成浓度为OD₆₀₀＝1的菌液，备用；在血清瓶中加入所述多环芳烃的丙酮溶液，待丙酮挥发后，加入无机盐培养基，将上述菌液接入血清瓶中，30℃温度下避光摇床培养7～14天；用高效液相色谱方法测定剩余的多环芳烃，计算降解率，选取降解率在90％以上的菌株。

8.根据权利要求7所述的富集筛选方法，其特征在于，所述多环芳烃的丙酮溶液的浓度为5g/L；所述菌液、多环芳烃的丙酮溶液及无机盐培养基的体积比为2.5～5∶1∶100；所述LB平板培养基的组成为：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL、琼脂粉15g、pH为7.2～7.4。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的富集筛选方法，其特征在于，所述无机盐培养基的组成为：Na₂HPO₄·12H₂O 8.8g、KH₂PO₄3.0g、NH₄NO₃1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.246g、FeCl₃0.05g、CaCl₂0.02g、微量元素溶液2.5mL、蒸馏水1000mL。

10.根据权利要求9所述的富集筛选方法，其特征在于，所述微量元素溶液的组成为：MnSO₄·2H₂O 0.06g、H₃BO₃0.03g、CoCl₂·6H₂O0.04g、CuCl₂·2H₂O 0.01g、NiCl₂·6H₂O 0.02g、Na₂MoO₄·2H₂O 0.03g、ZnCl₂0.05g、pH＝7、蒸馏水1000mL。