CN113846038A - 一株节杆菌及其在降解马兜铃酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，公开了一株节杆菌及其在降解马兜铃酸中的应用。本发明的菌株为节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610，它的保藏编号为GDMCC NO:61799。本发明的菌株可在有氧的条件降解马兜铃酸，能够以马兜铃酸为唯一碳、氮和能源原料繁殖生长，通过氧化途径将马兜铃酸矿化，进行硝基的脱除并最终分解为二氧化碳、水和亚硝酸根，实现马兜铃酸的完全脱毒/解毒，因此，该菌株可用于原位修复环境中的马兜铃酸污染，还可用于含马兜铃酸中药的炮制解毒，具有繁殖率快、解毒完全等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610及其在降解马兜铃酸中的应用，该节杆菌能够以马兜铃酸为唯一碳、氮和能源原料繁殖生长，通过氧化途径矿化马兜铃酸，在此过程中伴随着硝基的脱除和亚硝酸根的生成。
背景技术
马兜铃酸(AAs)为硝基菲类有机酸类化合物，主要含马兜铃酸A、马兜铃酸B等，天然存在于诸如马兜铃属(Aristolochia)及细辛属(Asarum) 等马兜铃科植物中。这些的植物曾广泛地经炮制解毒后作为原生药材入药，但长期服用含马兜铃酸的中草药及其制剂将会导致肾毒性及致癌性。马兜铃酸已被证明与肝癌及肾病等有关，马兜铃酸及含马兜铃酸的植物已被列入一类致癌物清单，目前多个国家已禁止含马兜铃酸药材的使用。此外，植物分泌的马兜铃酸因性质稳定而易于在环境中积累并进入人类食物链，造成马兜铃酸引起的食品污染。
研究还表明，在马兜铃酸植物生长的土壤及附近水体中均能检测到多种马兜铃酸的存在，这些物质能够通过农作物根部吸收在作物的果实、种子等部位积累。长期使用含有马兜铃酸的食物将造成肾脏的不可逆损伤，严重者可致肾衰竭。因此，修复土壤及水体中的马兜铃酸污染具有现实的意义。
含马兜铃酸中药材的炮制解毒是此类中药材应用的重要一步，其中，利用微生物进行发酵减毒或解毒是一种非常经济、绿色可持续的方法。但由于马兜铃酸化学性质稳定，目前对于其微生物减毒的研究包括利用霉菌发酵将马兜铃酸I转化为其脱甲氧基化合物，达到部分减毒的作用，但导致其毒性的最重要的硝基基团并未去除。因此，寻找一种实现马兜铃酸及含马兜铃酸植物完全解毒的微生物具有很重要的意义。
发明内容
针对现有技术的上述问题，本发明提供了一株节杆菌及其在降解马兜铃酸中的应用，该菌从北马兜铃根际土壤分离得到，能够以马兜铃酸A和马兜铃酸B为唯一碳、氮和能源繁殖生长，命名为Arthrobactersp.NyZ610。该菌通过氧化途径矿化马兜铃酸，在此过程中伴随着硝基的脱除及亚硝酸根的生成。
本发明的技术方案如下：
本发明的一株节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610，已于2021年7月21 日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路 100号大院59号楼5楼，邮编：510075)，保藏编号为GDMCC NO:61799。
在本发明的一实施例，所述的节杆菌NyZ610包括如SEQ ID NO.1所述的基因序列。
本发明还提供了所述的节杆菌NyZ610在降解马兜铃酸中的应用。
在本发明的一实施例，所述的兜铃酸为马兜铃酸I或马兜铃酸II中的一种或两种。
本发明还提供了用于培养所述的节杆菌NyZ610的培养基，该培养基的制备方法为：将6g胰蛋白胨大豆肉汤粉末加入1000mL蒸馏水中搅拌溶解， 120～125℃灭菌15-20分钟。
本发明还提供了一种降解马兜铃酸的方法，将所述的节杆菌NyZ610与马兜铃酸溶液混合培养，有氧条件下降解马兜铃酸。
在本发明的一实施例，所述的降解马兜铃酸的方法还包括将所述的节杆菌NyZ610的种子液接种至上述的培养基中富集培养。
在本发明的一实施例，所述的降解马兜铃酸的方法，所述的种子液的制备方法为：将所述的节杆菌NyZ610接种于种子液培养基中，于25～35℃培养 8-12h，得到种子液；
其中，所述的种子液培养基的制备方法为：将6g胰蛋白胨大豆肉汤粉末及15g琼脂加入1000mL蒸馏水中搅拌均匀，121℃灭菌15-20分钟。
在本发明的一实施例，所述的降解马兜铃酸的方法还包括如下步骤：
(1)将上述的培养的富集液于4℃，5000-8000g离心5-10min，收集菌体，并用灭菌的基本无机盐液体培养基清洗菌体3次；
(2)将收集的菌体重悬于基本无机盐培养液，与马兜铃酸溶液混合培养，在有氧条件下降解马兜铃酸。
在本发明的一实施例，所述的降解马兜铃酸的方法，步骤(2)有氧下降解的条件为：转速为150-180r/min，温度为25-37℃，时间为25-50h。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下：
本发明的一株节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610，该菌株能够以马兜铃酸为唯一碳、氮和能源原料繁殖生长，通过氧化途径将马兜铃酸矿化，进行硝基的脱除并最终分解为二氧化碳、水和亚硝酸根，实现马兜铃酸的完全脱毒/ 解毒，因此，该菌株既可用于处理环境中的马兜铃酸污染，又可用于处理中草药及食物中的马兜铃酸。而且，该菌株生长速率快，在接种量为1％的情况下，其在胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中达到稳定生长期仅需6h，在应用上具有显著优势。所以，该菌株可用于原位修复环境中的马兜铃酸污染，还可用于含马兜铃酸中药的炮制解毒，具有繁殖率快、解毒完全等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610的菌落形态示意图；
图2为本发明实施例2节杆菌降解马兜铃酸I过程中，马兜铃酸I、亚硝酸根以及菌浓度变化示意图，其中，AAI为马兜铃酸I、Nitrite为亚硝酸根、 OD600为节杆菌；
图3为本发明实施例3节杆菌降解马兜铃酸II过程中，马兜铃酸II、亚硝酸根以及菌浓度变化示意图，其中，AAII为马兜铃酸II、Nitrite为亚硝酸根、OD600为节杆菌；
图4为本发明实施例4节杆菌降解马兜铃酸过程中，马兜铃酸I、马兜铃酸II、亚硝酸根以及菌浓度变化示意图，其中，AAI为马兜铃酸I、AAII为马兜铃酸II、Nitrite为亚硝酸根、OD600为节杆菌。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1筛选节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610
(1)准备培养基
胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基：胰蛋白胨大豆肉汤粉末6g，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌21分钟。
胰蛋白胨大豆肉汤固体培养基：胰蛋白胨大豆肉汤粉末6g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌21分钟。
基本无机盐液体培养基：十二水合磷酸氢二钠14.3g，磷酸二氢钾3g，硫酸锰0.28mg，硫酸亚铁0.3mg，硫酸镁0.06mg，氯化钙1mg，硫酸铜0.05mg，硫酸锌0.05mg，硼酸0.05mg，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
基本无机盐固体培养基：十二水合磷酸氢二钠14.3g，磷酸二氢钾3g，硫酸锰0.28mg，硫酸亚铁0.3mg，硫酸镁0.06mg，氯化钙1mg，硫酸铜0.05 mg，硫酸锌0.05mg，硼酸0.05mg，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
(2)筛选节杆菌菌
选取北马兜铃多年定植的土地区，采集其根际土壤样品，装袋并低温保藏。称取0.5g上述土壤样品加至250ml基本无机盐液体培养基中，同时加入 400μM的马兜铃酸I，置于摇床中，30℃，180r/min进行富集培养。根据马兜铃酸的降解情况，每2-4周进行一次转接，接种量为1％。将第四次转接的富集液稀释涂布至胰蛋白胨大豆肉汤平板，30℃培养16h。从上述平板挑取单菌落在基本无机盐液体培养基(含马兜铃酸)中进行生长验证，将能生长的菌进行保存留种。经平板划线纯化3次以上后，获得单菌，保存待用。
(3)菌株性状特征与生理生化鉴定
该菌株革兰氏染色为阳性，无芽孢。该菌在胰蛋白胨大豆肉汤固体平板上于30℃培养18h后呈黄色，半透明，菌落呈圆形，表面凸起，光滑，见图 1。
提取菌株NyZ610的基因组DNA，进行16S rRNA的扩增和测序。扩增引物为27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
PCR扩增条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环； 72℃10min。
对PCR产物进行一代测序，测序结果详见SEQ ID No.1，16S rRNA序列已提交至NCBI数据库。通过与NCBI Nucleotide collection(nr/nt)数据库中的数据进行比对，NyZ610属于节杆菌属，我们将其命名为节杆菌NyZ610 (Arthrobacter sp.NyZ610)，并与2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号：GDMCC NO:61799
实施例2节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610降解马兜铃酸I
(1)将实施例1中筛选到的马兜铃酸降解菌NyZ610接种至胰蛋白胨大豆肉汤固体平板中，于30℃培养10h。用接种环从上述平板中刮取少量菌体接入5mL胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，于30℃，180r/min培养8h至 OD600约为0.8。将上述菌液于4℃，5000g离心5min，收集菌体。用灭菌的基本无机盐液体培养基清洗菌体3次，待用。
(2)将上述收集的菌体重悬于100μL基本无机盐培养液，接种至5mL 含200μM马兜铃酸I的基本无机盐培养液，初始接种OD600约为0.004，于30℃，1800r/min培养，定时取样测定马兜铃酸的浓度、OD600值及亚硝酸根浓度。
(3)结果如图2所示，在35h内，马兜铃酸I完全被NyZ610降解，同时检测到了少量亚硝酸根的产生，说明有氧条件下马兜铃酸I的降解是通过氧化途径进行的。同时检测到了生物量的积累，OD600值由初始的0.004增长至约0.02，这些结果说明NyZ610能利用马兜铃酸I作为唯一的碳源、氮源及能源生长。
实施例3节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610降解马兜铃酸II
(1)将实施例1中筛选到的马兜铃酸降解菌NyZ610接种至胰蛋白胨大豆肉汤固体平板中，于30℃培养10h。用接种环从上述平板中刮取少量菌体接入5mL胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，于30℃，180r/min培养8h至 OD600约为0.8。将上述菌液于4℃，5000g离心5min，收集菌体。用灭菌的基本无机盐液体培养基清洗菌体3次，待用。
(2)将上述收集的菌体重悬于100μL基本无机盐培养液，接种至5mL 含200μM马兜铃酸II的基本无机盐培养液，初始接种OD600约为0.004，于 30℃，1800r/min培养，定时取样测定马兜铃酸的浓度、OD600值及亚硝酸根浓度。
(3)结果如图3所示，NyZ610细胞生长50h后，马兜铃酸II的降解率为100％；生物量明显的积累，OD600值增长至0.018。
实施例4节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610降解马兜铃酸混合物
(1)将实施例1中筛选到的马兜铃酸降解菌NyZ610接种至胰蛋白胨大豆肉汤固体平板中，于30℃培养10h。用接种环从上述平板中刮取少量菌体接入5mL胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中，于30℃，180r/min培养8h至 OD600约为0.8。将上述菌液于4℃，5000g离心5min，收集菌体。用灭菌的基本无机盐液体培养基清洗菌体3次，待用。
(2)将上述收集的菌体重悬于100μL基本无机盐培养液，接种至5mL 含200μM马兜铃酸(马兜铃酸I和马兜铃酸II各100μM)的基本无机盐培养液，初始接种OD600约为0.004，于30℃，1800r/min培养，定时取样测定马兜铃酸的浓度、OD600值及亚硝酸根浓度。
(3)结果如图4所示，在30h内，马兜铃酸I和马兜铃酸II均被完全降解，且对马兜铃酸I的降解速率更快。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一株节杆菌及其在降解马兜铃酸中的应用
<130> 20210817
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1388
<212> DNA
<213> 节杆菌NyZ610 (Arthrobacter sp. NyZ610)
<400> 1
gtcgaacgat gatcccagct tgctggggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtgag 60
taacctgccc ttgactctgg gataagcctg ggaaactggg tctaataccg gatatgactc 120
ctcatcgcat ggtggggggt ggaaagcttt tgtggttttg gatggactcg cggcctatca 180
gcttgttggt ggggtaatgg cctaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggtga 240
ccggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 300
ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt 360
tgtaaacctc tttcagtagg gaagaagcgt aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg 420
ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttatcc ggaattattg 480
ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtttgtcgc gtctgctgtg aaagaccggg gctcaactcc 540
ggttctgcag tgggtacggg cagactagag tgcagtaggg gagactggaa ttcctggtgt 600
agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccgatggc gaaggcaggt ctctgggctg 660
taactgacgc tgaggagcga aagcatgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 720
atgccgtaaa cgttgggcac taggtgtggg ggacattcca cgttttccgc gccgtagcta 780
acgcattaag tgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac 840
gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga tgcaacgcga agaaccttac 900
caaggcttga catgaaccgg aaagacctgg aaacaggtgc cccgcttgcg gtcggtttac 960
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1020
gcgcaaccct cgttctatgt tgccagcggt tcggccgggg actcatagga gactgccggg 1080
gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aaatcatcat gccccttatg tcttgggctt 1140
cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg ttgcgatact gtgaggtgga gctaatccca 1200
aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct 1260
agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1320
gtcaagtcac gaaagttggt aacacccgaa gccggtggcc taacccttgt ggggggagcc 1380
gtcgaagg 1388
Claims (10)
1.一株节杆菌(Arthrobacter sp.)NyZ610，其保藏编号为GDMCC NO:61799。
2.根据权利要求1所述的节杆菌NyZ610，其特征在于，所述的节杆菌NyZ610包括如SEQID NO.1所述的基因序列。
3.权利要求1所述的节杆菌NyZ610在降解马兜铃酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的兜铃酸为马兜铃酸I或马兜铃酸II中的一种或两种。
5.用于培养权利要求1所述的节杆菌NyZ610的培养基，其特征在于，该培养基的制备方法为：将6g胰蛋白胨大豆肉汤粉末加入1000mL蒸馏水中搅拌溶解，120～125℃灭菌15-20分钟。
6.一种降解马兜铃酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述的节杆菌NyZ610与马兜铃酸溶液混合培养，有氧条件下降解马兜铃酸。
7.根据权利要求6所述的降解马兜铃酸的方法，其特征在于，所述方法还包括将权利要求1所述的节杆菌NyZ610的种子液接种至权利要求5所述的培养基中富集培养。
8.根据权利要求7所述的降解马兜铃酸的方法，其特征在于，所述的种子液的制备方法为：将权利要求1所述的节杆菌NyZ610接种于种子液培养基中，于25～35℃培养8-12h，得到种子液；
其中，所述的种子液培养基的制备方法为：将6g胰蛋白胨大豆肉汤粉末及15g琼脂加入1000mL蒸馏水中搅拌均匀，121℃灭菌15-20分钟。
9.根据权利要求7或8所述的降解马兜铃酸的方法，其特征在于，所述的方法还包括如下步骤：
(1)将权利要求7培养的富集液于4℃，5000-8000g离心5-10min，收集菌体，并用灭菌的基本无机盐液体培养基清洗菌体3次；
(2)将收集的菌体重悬于基本无机盐培养液，与马兜铃酸溶液混合培养，在有氧条件下降解马兜铃酸。
10.根据权利要求9所述的降解马兜铃酸的方法，其特征在于，有氧下降解的条件为：转速为150-180r/min，温度为25-37℃，时间为25-50h。
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2021
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