CN103243061A - 一株大熊猫链球菌sdx-1株及其pcr非诊断性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株大熊猫链球菌SDX-1株及其PCR非诊断性检测方法，大熊猫链球菌SDX-1(Streptococcus ailuropoda sp.novel，SDX-1株)，于2012年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M2012249。本发明建立的快速检测大熊猫链球菌的PCR方法具有较强的特异性和敏感性。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株大熊猫链球菌(Streptococcus ailuropodasp.novel)SDX-1株及其PCR非诊断性检测方法。
背景技术
链球菌属隶属链球菌科。链球菌属细菌为兼性厌氧、触酶阴性、不形成芽孢、不运动的革兰氏阳性球菌。细胞呈球形或卵圆形，直径0.5～2.0μm。在液体培养基中以成对或链状出现。生长营养要求高，有时需要CO2。DNA的G+C mol含量为36～46％。寄生于脊椎动物，主要栖息口腔和上呼吸道；有的重对人和动物致病。
近年来，由于分子生物学技术的发展，DNA-DNA杂交、DNAG+C mol含量测定、16S rRNA序列分析等在细菌分类中广泛应用。1986年Bergey’s Manual将原链球菌属分为了链球菌属、肠球菌属和乳链球菌属3个属。1933年Lancefield建立的血清学方法仍是现在链球菌鉴定的重要手段。根据溶血性不同将其分为α溶血性链球菌、β溶血性链球菌和不溶血性链球菌等几个大群。目前为止链球菌属至少由60多个菌种和亚种组成。
链球菌在自然界中分布广泛，水、尘埃、动物体表、消化道、呼吸道等都有存在，有些为非致病菌，有些能导致动物的各种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎和败血症等近年来陆续有链球菌感染大熊猫的报道。张志和等曾报道了β链球菌感染大熊猫的病例。王旭等从大熊猫化脓脚掌感染部位浓汁中分离了停乳链球菌。除此外还从其他大熊猫的鼻腔、咽喉、粪便分别分离到非解乳链球菌、猪链球菌和多动物链球菌，从患牙周炎大熊猫口腔中也分离到停乳链球菌。
链球菌感染初期，机体临床症状不明显，不易被发现。当临床症状明显时，已对机体造成严重危害。链球菌传统的检测方法是分离培养后结合形态学特征、生理生化特征等进行鉴定，不仅费时费力，而且敏感性不高。贾玉萍等建立巢氏PCR方法检测无乳链球菌16S rRNA，可简便、快速检测到奶样中的无乳链球菌，马保臣等跟军16S rRNA与23S rRNA之间序列和18S rRNA序列建立多重PCR方法检测奶牛金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌。因此建立简便、快速方法来检测致病性链球菌对于链球菌病诊断、预防和监测具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一株大熊猫链球菌SDX-1株及其PCR非诊断性检测方法
本发明的技术方案如下：
大熊猫链球菌SDX-1株(Streptococcus ailuropoda sp.novel，SDX-1 strain)，于2012年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2012249。
本发明建立的快速检测大熊猫链球菌的PCR方法具有较强的特异性和敏感性。
附图说明
图1为SDX-1株与16SrDNA序列同源性高的链球菌进化发育树；
图2为SDX-1株16-23SrRNA序列PCR扩增结果，M：DNA Marker D2000，1：PCR产物；
图3为特异性试验结果，M：DNA Marker D2000；1：大熊猫链球菌SDX-1；2：化脓性链球菌JCM5764；3：S.ictaluri ATCC BAA1300；4：停乳链球菌；5：非解乳链球菌；6：多动物链球菌；
图4为敏感性试验结果，M：DNA Marker D2000；1：5.28ng×10；2：5.28ng；3：5.28ng×10-1；4：5.28ng×10-2；5：5.28ng×10-3；6：5.28ng×10-4；7：5.28ng×10-5；7：5.28ng×10-6；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1：大熊猫链球菌SDX-1的分离培养
1)将从患子宫内膜炎大熊猫无菌采取的子宫内分泌物分别接种于TSA培养基和含10％血清的TSA固体培养基上，37℃培养24h，观察生长情况。
2)观察TSA固体培养基上细菌生长情况，其在不加血清的TSA培养基上细菌生长贫瘠，在加血清的TSA培养基上的优势菌落为乳白色不透明小菌落。挑取其中单个优势菌落接种于加血清的TSA培养上置于恒温培养箱中，37℃，培养24h，进行纯化。
3)纯化培养后，挑取单个菌落接种于含10％血清的TSB培养基中37℃、120r/min培养24h后保存。
4)将纯化细菌接种于含5％新鲜兔血的TSA培养基上，37℃，培养24h，观察其溶血性。
5)经分离培养后获得一株大熊猫链球菌SDX-1株。
所述的TSB(Tryptone Soya Broth)培养基为胰蛋白胨大豆肉汤，其组成及配比为：酪蛋白胰酶消化物15.0g，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5.0g，氯化钠5.0g，溶于1000mL蒸馏水，加热搅拌至完全溶解，用2mol/L NaOH调节pH至7.0-7.2，121高压灭菌15后备用。
所述的TSA(Tryptone Soya Agar)培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基，其制备方法为：100mL TSB培养基中加入1.5g琼脂，用2mol/L NaOH调节pH值至7.0-7.2，121℃高压灭菌15min。
所述的含10％血清的TSA培养基的配制方法为：灭菌的TSA培养基冷却至55℃左右后，100mL TSA中加入10mL胎牛血清，倒入90mm的平板中约2mm高，凝固后备用。
所述的含5％新鲜兔血的TSA培养基的配制方法为：灭菌的TSA培养基冷却至55℃左右后，向100mL TSA中加入5mL新鲜兔血，倒入90mm的平板中约2mm高，凝固后备用。
实施例2：大熊猫链球菌SDX-1的鉴定
1.形态学特征鉴定
在加血清和加新鲜兔血的TSA培养基上生长为乳白色圆形小菌落，表面光滑、湿润，隆起，边缘整齐，不透明；在血平板上不发生溶血。革兰氏染色后在显微镜下观察为G+菌，成球形或卵圆形，直径0.6～1.0um，单个、双个或短链排列，无芽孢、不运动，在加血清的TSB培养基中呈链状排列。
2.生理生化特征鉴定
将分离菌株划线接种在哥伦比亚鲜血琼脂培养基上，使其培养成单个菌落。用棉签蘸取菌落，用0.45％Sodium Chlaride Inhalation Solution稀释呈0.5麦氏比浊度的菌悬液，让革兰氏阳性细菌鉴定卡吸收菌悬液，放入VITEK2COMPACT仪器中进行鉴定，培养过夜后记录结果。
生化鉴定结果
D-半乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露醇、D-甘露糖、甲基-β-D葡萄糖吡喃苷、水杨素、蔗糖和D-海藻糖产酸，D-山梨醇、D-核糖、D-棉籽糖和D-木糖不产酸，能分解环式糊精，不利用苦杏仁苷，不水解支链淀粉，6.5％NaCl中生长，对多粘菌素B和杆菌肽不耐受，对新生霉素和奥普托欣耐受，磷脂酰磷脂酶C、β-D-半乳糖苷酶、L-天冬氨酸芳胺酶、β-半乳糖吡喃糖苷酶、亮氨酸芳胺酶、焦谷氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶和酪氨酸芳胺酶和尿素酶为阴性，精氨酸双水解酶、α-葡萄糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、焦谷氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶和尿素酶为阳性。
与大熊猫链球菌SDX-1的16SrDNA序列同源性高的链球菌的生理生化差异如表1。
表1熊猫链球菌SDX-1与16SrDNA序列同源性高的链球菌的生理生化差异
3.SDX-1菌株的16SrDNA序列分析
采用16S rDNA的通用引物，上、下游引物序列分别为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，利用PCR方法，获得SDX-1菌株的16SrDNA序列，测序并注册登录入GenBank中(NO：HM050401)(SEQ IDNO：1)，用NCBI中的Blast进行比对，发现与其同源性高的均为链球菌属细菌，选取与其同源性较高16SrDNA序列，用于DNAStar中MegAlign软件进行多序列比对获得各个序列间同源性差异，结果HM050401与Streptococcus halichoeri16SrDNA序列(AJ606046)的同源性为98％、与Streptococcus canis(DQ303184)、Streptococcus ictaluri(DQ462421)和Streptococcus pyogenes(AB023575)的同源性分别为97.6％和97.5％和97.3％，与其他菌株的16SrDNA同源性均低于97％。用MEGA4.0软件采用邻近法(neighbor-joining，NI)构建系统发育树(图1)，SDX-1菌株的16SrDNA序列遗传进化距离与其他菌株存在差异。根据同源性在系统发育中的分类原则SDX-1菌株为不同于其他的菌株。
4.SDX-1菌株的G+Cmol％含量的测定
参照《常见细菌系统鉴定手册》中溶解温度(Tm)法测定G+Cmol％的含量。
1)菌株培养和收集
将SDX-1菌株接种于含血清的TSA斜面上37℃培养24h，将斜面细菌接种于装有含10％血清的的TSB培养基的三角瓶中，置200r/min的摇床中，37℃培养24h。
2)DNA提取和纯化
利用CTAB/NaCl法提取SDX-1株的基因组DNA，检测纯度。
3)Tm测定
仪器：带加温装置的紫外分光光度计
步骤：将波长固定于260nm；将SDX-1株的DNA用1×SSC稀释至OD260值于0.3～0.6间；在波长260nm首先记录25℃的吸光值(A25)然后温度迅速上升至50℃；每隔3～5℃记录一次；OD值开始上升表示变性开始，每隔1℃稳定5min，记录杯内温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕。
热变性稳定测定完成后，将记录的温度和相应光密度整理成表。各光密度乘相应温度的相对膨胀系数(Vt)与25℃时光密度相比Vt/V25，求得相对光密度。在以温度为横坐标，以相对光密度为纵坐标，绘制热变性曲线。热变性曲线中点相对应的稳定为熔链温度(Tm值)。
实验结果，测得SDX-1菌株的Tm值为70.9。
4)G+Cmol％的计算
根据G+Cmol％＝2.08Tm-106.4计算，以大肠埃希氏菌(E.coli K12)为参比操作对照，以核实实验误差。
实验结果，利用热变性温度法测得SDX-1株G+Cmol(％)含量为40.6％。与SDX-1菌株同源性高的菌株S.halichoeri、S.ictaluri、S.canis、S.pyogenes、S.iniae、S.uberis和S.dysgalactiae的G+Cmol％含量分别为39mol％、38.5mol％、38.5％、38.5mol％、33mol％、37.5mol％、40mol％，可见SDX-1菌株G+Cmol％含量与16SrDNA同源性高的菌株间存在差异。
5.SDX-1菌株与S.ictaluri、S.canis、S.pyogenes的DNA-DNA杂交
参照参照《常见细菌系统鉴定手册》中介绍的复性速率液相分子杂交法，与S.pyogenes同源性为51.4％，与S.ictaluri和S.canis同源性低于41％。
实验结果，SDX-1菌株与16SrDNA亲缘关系近的菌株间存在遗传学差异，SDX-1菌株为一新种。
根据形态学特征、生理生化试验、16SrDNA序列测定、G+Cmol％含量的测定和DNA-DNA杂交证实，SDX-1菌株为链球菌属新种，命名为大熊猫链球菌Streptococcusailuropoda sp.novel。
实施例3：大熊猫链球菌SDX-1PCR方法建立
1.大熊猫链球菌16-23SrRNA序列扩增
从GenBank中下载与大熊猫链球菌SDX-1株同源性高的链球菌的16SrRNA序列、16SrRNA至23SrRNA序列及23SrRNA序列，利用DNAStar软件中MegAlin进行序列分析，设计扩增16-23SrRNA的通用引物，扩增大熊猫链球菌SDX-1株的16-23SrRNA间序列。引物为：
上游引物5′-CTGGATCACCTCCTTTCTAAG-3′，
下游引物5′-CACTGCGTCTTCCTTCTCATA-3′。
PCR反应体系为50μL：
反应程序：反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s、61℃复性30s、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5％凝胶电泳检测为阳性后，将PCR回收、克隆至pMD Simple19-T载体，送至上海英骏生物技术有限公司测序进一步鉴定。
试验结果
扩增出大小为797bp的基因片段(见图2)，将测序结果用NCBI中的Blast进行比对，得出594bp大小16-23SrRNA序列。
2.大熊猫链球菌SDX-1PCR检测方法的建立
2.1检测引物设计
根据大熊猫链球菌SDX-1株的16-23SrRNA间序列设计特异性引物：
上游引物5′-GGATAAGGAACTTTTTGGGATT-3′，
下游引物5′-GACACGAGATGGTTTTGACTTAT-3′；
2.2DNA提取
利用CTAB/NaCl法提取SDX-1菌株的基因组DNA。利用核酸蛋白仪测定基因组DNA浓度。
2.3PCR反应条件
PCR反应体系为50μL，组成如下：
反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、61℃复性30s、72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR反应产物采用常规的琼脂糖凝胶电泳法进行检测，浓度为1.5％。检测结果为阳性，将PCR产物回收后克隆至pMD Simple19-T载体，送至上海英骏生物技术有限公司测序进一步鉴定。
2.4特异性试验
用化脓性链球菌JCM5674、S.ictaluri ATCC BAA1300及停乳链球菌、多动物链球菌基因组DNA作为模板按上述方法同时进行PCR，以鉴定其特异性。
2.5敏感性试验
利用核酸蛋白仪测定2.2提取的大熊猫链球菌SDX-1株基因组DNA浓度，测得浓度为52.8μg/mL，并将其进行十倍梯度稀释，利用梯度稀释后的DNA作为模版，进行PCR扩增，检测其敏感性。
实验结果
从大熊猫链球菌SDX-1株基因组中扩增出378bp的目的条带。同时从化脓性链球菌JCM5674、S.ictaluri ATCC BAA1300及停乳链球菌、非解乳链球菌、多动物链球菌基因组DNA中没有检测到特异性条带，结果为阴性。说明检测引物有较强的特异性及PCR反应的可行性，见图3。PCR产物测序结果与16-23SrRNA间序列(SEQ ID NO：2)同源性为100％。证明该检测引物是特异性的。敏感性试验结果表明PCR最低检测出的DNA量为5.28ng×10-2，见图4。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (2)
1.大熊猫链球菌SDX-1株，保藏编号CCTCC NO：M2012249。
2.根据权利要求1所述的大熊猫链球菌SDX-1株的PCR非诊断性检测方法，其特征在于，引物为：
上游引物5′-GGATAAGGAACTTTTTGGGATT-3′，
下游引物5′-GACACGAGATGGTTTTGACTTAT-3′；
PCR反应体系为50μL，组成如下：
反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s、61℃复性30s、72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min；能从大熊猫链球菌SDX-1株基因组DNA中扩增378bp的目的条带。
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| CN 201310201743 CN103243061A (zh) | 2013-05-27 | 2013-05-27 | 一株大熊猫链球菌sdx-1株及其pcr非诊断性检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN113846038A (zh) * | 2021-08-18 | 2021-12-28 | 上海交通大学 | 一株节杆菌及其在降解马兜铃酸中的应用 |
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- 2013-05-27 CN CN 201310201743 patent/CN103243061A/zh active Pending
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