CN113462595B - 一株通过artp诱变得到的高效聚磷菌株 - Google Patents

一株通过artp诱变得到的高效聚磷菌株 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株通过ARTP诱变得到的高效聚磷菌株，涉及环境微生物技术应用领域。已于2021年4月2日保藏于广东省微生物保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC NO:61593，建议的分类名为Acinetobacter lwoffii。在含有0.25‰(m/v)K2HPO4·3H2O的培养基中，对有效磷的去除率达到90％以上，且当菌株传代10次后，有效磷的去除率仍能达到90％以上；在磷含量18mg/L的模拟废水中，发酵48h后磷含量去除率为55.3％，该菌株在处理含磷废水的应用中有着广阔的应用前景。

Description

一株通过ARTP诱变得到的高效聚磷菌株
技术领域
本发明涉及了一株通过ARTP诱变得到的高效聚磷菌株，涉及环境微生物技术应用领域。
背景技术
磷，是第15号化学元素，符号P。处于元素周期表的第三周期、第VI族。磷存在于人体所有细胞中，是维持骨骼和牙齿的必要物质，几乎参与所有生理上的化学反应。
植物的生长也需要磷元素的参与。合理施用磷肥，可增加作物产量，改善作物品质。但是过量磷肥的使用会提高周边水体中的含磷量，并导致水体富营养化，引发周边湖泊、河流产生水华、赤潮等环境问题。此外，城市生活污水的大量排放也加剧了这一问题。为此，国内外相关学者自20世纪60年代初开始，逐渐重视污水处理厂中除磷的相关工艺。
近年来，使用微生物除磷的方法越来越受到相关产业的关注，筛选高效的除磷菌株成为了提高污水除磷效果的一个重要途径。尤其是随着细菌分离培养技术以及微生物种群表征技术的发展，各国学者对生物除磷的主角——聚磷菌(Poly-phosphateAccumulating Organisms， PAOs)做了大量深入的研究。
目前国内外相关研究中已经筛选到许多不同的具有聚磷效果的菌株，并对其代谢过程进行了分析，如不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、俊片菌属(Lam propediaa spp.)和产碱杆菌属(Alcaligenes spp.)等。其中对产碱杆菌属除磷特性和代谢机理的研究最为广泛，而不动杆菌属具有典型聚磷菌的好氧/厌氧代谢途径。
典型聚磷菌在好氧条件与厌氧条件下具有不同的代谢途径。在厌氧条件下，聚磷菌吸收水体中的乙酸和其他脂肪酸，并将细胞内储存的多磷酸盐(poly-phosphate，poly-P)(也称异染颗粒)水解，释放出能量，能量的一部分用于聚磷菌在厌氧条件下生存，而另一部分则用于聚磷菌主动吸收可溶性脂肪酸，在菌体内通常以聚β-羟基丁酸(Poly-Hydroxybutyrate，PHB) 的形式储存，分解后的无机磷酸盐则被释放到菌体外，即聚磷菌的厌氧释磷。而好氧条件下，聚磷菌将储存的PHB分解，产生的能量一部分供聚磷菌生产繁殖，另一部分供其过量吸收环境中的磷，并合成聚磷从而达到好氧除磷的目的。研究表明，聚磷的厌氧分解是好氧超量吸磷的必要条件，而提高厌氧释磷量的核心环节是刺激聚磷菌合成更多的PHB。因此，在筛选过程中，使用厌氧-好氧交替发酵，以强化聚磷菌对磷的吸收。
此外，为了鉴别聚磷菌在除磷过程中形成的异染颗粒，通过亚甲基蓝对细胞进行染色。此种染料带正电荷，而异染颗粒带负电荷，因此二者具有很高的亲和力。结合后染料的光吸收性发生变化，产生不同的颜色能够区分异染颗粒与细胞。
发明内容
本发明提供了一株高效聚磷的菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4，分类学命名为Acinetobacter lwoffii，保藏号为GDMCC NO:61593，已于2021年4月2日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明提供一种菌剂，所述菌剂含有上述菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4。
在一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为挑取上述菌株Acinetobacterlwoffii LBBE-M4 接种于培养基中，35～38℃培养10～15h。
本发明还保护所述菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4在除磷中的应用。
在一种实施方式中，所述应用为将菌株LBBE-M4厌氧发酵后，将菌体加入含磷的培养基或废水中有氧发酵。
在一种实施方式中，所述厌氧发酵为将菌株LBBE-M4的湿菌泥加入无磷培养基中培养。
在一种实施方式中，所述培养的条件为28～32℃密封静置培养20～30h。
在一种实施方式中，所述无磷培养基为CH3OONa·3H2O 5～10‰，NH4Cl 1～3‰，MgSO4·7H2O 0.25～0.75‰，CaCl20.15～0.3‰，葡萄糖3～8‰，L-半胱氨酸0.25～0.75‰。
在一种实施方式中，所述湿菌泥的制备方法为将菌株LBBE-M4接种至培养基中28～32℃静置培养20～30h获得种子液，将种子液离心并重悬菌体获得湿菌泥。
在一种实施方式中，所述有氧发酵的条件为28～32℃，200～250rpm培养40～60h。
生物材料保藏
Acinetobacter lwoffii LBBE-M4，分类学命名为Acinetobacter lwoffii，保藏编号为GDMCC NO:61593，已于2021年4月2日保藏于广东省微生物保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：菌株诱变筛选流程图。
图2：菌株平板培养图。
图3：奈瑟氏染色法染色结果示意图。
具体实施方式
下述实施例中涉及的培养基及试剂如下：
(1)富磷筛选培养基：CH3OONa·3H2O 8‰(m/v)，NH4Cl 2‰(m/v)，K2HPO4·3H2O0.25‰ (m/v)，MgSO4·7H2O 0.5‰(m/v)，CaCl20.2‰(m/v)；培养基中磷含量为375mg/L。
(2)无磷筛选培养基：CH3OONa·3H2O 8‰(m/v)，NH4Cl 2‰(m/v)，MgSO4·7H2O0.5‰ (m/v)，CaCl20.2‰(m/v)，葡萄糖5‰(m/v)，L-半胱氨酸0.5‰(m/v)。
(3)LB培养基：酵母粉5‰(m/v)，蛋白胨10‰(m/v)，NaCl 5‰(m/v)(固体添加20‰(m/v)的琼脂粉)。
(4)模拟废水：葡萄糖0.23‰(m/v)，蛋白胨0.06‰(m/v)，无水乙酸钠0.04‰(m/v)，牛肉膏0.02‰(m/v)，NaHCO30.198‰(m/v)，KH2PO40.012‰(m/v)，NH4HCO30.170‰ (m/v)，MgSO4·7H2O 0.0024‰(m/v)，CaCl20.0012‰(m/v)，FeCl3·6H2O 0.001‰(m/v)；模拟废水中磷含量约为18mg/L。
钼锑抗比色法测定有效磷含量测定方法：
(1)试剂配制：准确称取0.5g的固体酒石酸锑钾溶于100mL蒸馏水中，完全溶解后制成溶液a；称取10g的固体钼酸铵溶于450mL蒸馏水中，溶解后缓慢加入153mL浓硫酸，边加边搅拌，待溶液冷却后，制成溶液b。将溶液a和b混合，加蒸馏水并定容为1L，充分摇匀，此为钼锑混合液。将混合液储于棕色试剂瓶中在常温条件下保存；称取0.2147g在110℃条件下烘干2h的固体磷酸二氢钾，少量水溶解后加入5mL硫酸，转移至1000mL容量瓶，加入1mL三氯甲烷，用水稀释至标线，该磷酸盐标准液磷含量为50μg/L。
(2)样品制备：将样品在4000rpm离心20min去除水样中固体，并用0.22μm水系滤膜过滤。
(3)测定步骤：实验使用前量取100mL钼锑混合液，加入1.5g左旋抗坏血酸，充分搅拌溶解后，制成钼锑抗试剂。将稀释后的样品225μL加入圆底浅孔板，并加入25μL的钼锑抗试剂，30℃放置30min，使用酶标仪在波长700nm处检测。
(4)结果表示：将磷酸盐标准液稀释至0.0、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0μg/L测定吸光值绘制标准曲线，将样品吸光值代入标准曲线得到其稀释磷含量C′(mg/L)。样品磷含量表示为C (mg/L)。
C＝C′·m
m——稀释倍数
奈瑟氏染液甲：0.1g美兰、5mL 95％乙醇、5mL冰醋酸和100mL蒸馏水配成的溶液A与3.3mL结晶紫(10％(w/v)溶于95％乙醇)、6.7mL 95％乙醇和100mL蒸馏水配成的溶液B以2:1的比例混合配为染液甲。
奈瑟氏染液乙：33.3mL碱性棕(1％w/v)溶于66.7mL蒸馏水中配为染液乙。
实施例1：高效聚磷菌的诱变选育
诱变选育的流程如图1所示。
1.ARTP诱变
(1)诱变预处理：将菌株Acinetobacter lwoffii接种至LB培养基培养至菌液OD600值0.6～0.8 的菌液，于4000rpm离心10min，弃上清液收集菌体，用含5％(v/v)甘油的生理盐水洗涤菌体两遍，并重悬浮，制成细胞分散均匀的菌悬液，调整细胞的终浓度为107～108CFU·mL-1。
(2)ARTP诱变：取步骤(1)制备好的菌悬液l mL，在5000rpm下离心，取上清，将菌体重新悬浮于0.1mL已灭菌的含5％(v/v)甘油的生理盐水中，取10μL均匀涂于无菌载片上，置于ARTP诱变育种仪中进行诱变处理。设置诱变参数为：功率50～100W、诱变时间 15～120S、气流量为10SLM。
(3)诱变后培养：样品处理完毕分别进行后培养并稀释涂板测定致死率。
2.初筛
(1)将步骤1中获得的菌株在LB固体培养基上划线，30℃培养24h，挑取单菌落接种到 LB液体培养基中，于30℃静置培养24h，获得种子液；
(2)将步骤(1)中获得的种子液4000rpm离心15min，用300μL无菌水低速震荡洗涤菌体两次，然后用300μL无菌水重悬菌体得到湿菌泥，向得到的湿菌泥中加入2mL无磷筛选培养基中，置于30℃密封静置培养(兼性厌氧)24h，获得发酵液；
(3)将步骤(2)中获得的发酵液4000rpm离心15min，用300μL无菌水低速震荡洗涤菌体两次，然后用300μL无菌水重悬菌体得到湿菌泥，，向得到的湿菌泥中加入2mL富磷筛选培养基中，置于30℃、220rpm摇床培养(有氧)48h。培养结束后离心取上清，利用钼锑抗比色法测定有效磷含量。
(4)共得到五株突变株，分别命名为M-1～5，其除磷效率分别为89％、89％、90％、91％、 92％。
3.复筛
对步骤2初筛获得的菌株分别加入无菌水重悬并适当稀释，使菌液OD在0.2～0.3之间。取25μL菌液滴加在载玻片上，自然风干后滴加奈瑟氏染液甲液初染30s，自来水冲洗，滴加奈瑟氏染液乙液复染1min，自来水冲洗，自然风干后镜检。若观察到菌体中存在异染颗粒，则可确定该菌株为聚磷菌。选取同批菌株中含有异染颗粒，且除磷效果最好的菌株作为高效聚磷菌株，最终筛选到高效聚磷菌株LBBE-M4(图3)。
4.鉴定
将步骤3经复筛获得的高效聚磷菌株LBBE-M4在LB固体培养基上划线(图2)，30℃培养24h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，于30℃、220rpm摇床培养24h，获得菌悬液。取1mL菌悬液用上海生工的细菌基因组提取试剂盒提取聚磷菌的基因组。使用通用引物27F、1492R PCR扩增16S保守序列，送上海生工测序；测序结果在NCBI数据库中Blast 比对，确定菌株的属种为Acinetobacter lwoffii。
实施例2高效聚磷菌株AcinetobacterlwoffiiLBBE-M4的遗传稳定性
对实施例1中复筛验证获得的高效聚磷菌株LBBE-M4连续传代10次，每代菌株均依照实施例1中的培养方法培养并每三代菌株验证除磷效果，每代菌株均以平板划线方式保存在 -4℃条件下。结果显示，LBBE-M4菌株传代10次后，其在富磷筛选培养基中的有效磷的去除率达到90％以上，具有较好的遗传稳定性。
表1高效聚磷菌突变株的遗传稳定性
Figure GDA0003748669880000051
实施例3高效聚磷菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4的应用
在含磷废水中的应用：
(1)将菌株LBBE-M4在LB固体培养基上划线，30℃培养24h，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，于30℃静置培养24h，获得种子液；
(2)将步骤(1)中获得的种子液4000rpm离心15min，用300μL无菌水低速震荡洗涤菌体两次，然后用300μL无菌水重悬菌体得到湿菌泥，向得到的湿菌泥中加入2mL无磷筛选培养基中，置于30℃密封静置培养(兼性厌氧)24h，获得发酵液；
(3)将步骤(2)中获得的发酵液4000rpm离心15min，用300μL无菌水低速震荡洗涤菌体两次，然后用300μL无菌水重悬菌体得到湿菌泥，向得到的湿菌泥中加入2mL模拟废水培养基中，置于30℃、220rpm摇床培养(有氧)48h。培养结束后离心取上清，利用钼锑抗比色法测定有效磷含量。
(4)模拟废水中的磷含量约为18mg/L，发酵结束后的磷含量去除率为55.30％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株通过ARTP诱变获得的高效聚磷菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4，保藏编号为GDMCC NO:61593，已于2021年4月2日保藏于广东省微生物保藏中心。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4。
3.制备权利要求2所述菌剂的方法，其特征在于，挑取菌株Acinetobacter lwoffiiLBBE-M4接种于培养基中，28～32℃培养10～15h。
4.权利要求1所述菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4在除磷中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述菌株Acinetobacterlwoffii LBBE-M4厌氧发酵后，将菌体加入含磷的培养基或废水中有氧发酵。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述厌氧发酵为将权利要求1所述菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4的湿菌泥加入无磷培养基中培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述培养的条件为28～32℃密封静置培养20～30h。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述无磷培养基以质量体积比计，组成为CH3OONa·3H2O 5～10‰，NH4Cl 1～3‰，MgSO4·7H2O 0.25～0.75‰，CaCl2 0.15～0.3‰，葡萄糖3～8‰，L-半胱氨酸0.25～0.75‰。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述湿菌泥的制备方法为将权利要求1所述菌株Acinetobacter lwoffii LBBE-M4接种至培养基中28～32℃静置培养20～30h后，离心并重悬菌体获得湿菌泥。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述有氧发酵的条件为28～32℃，200～250rpm培养40～60h。
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