CN109762774A - 一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)及其应用，所述菌株于2017年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC NO：60246；分类命名号为Acinetobacter rhizosphaerae；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株具有良好的除磷效果，在厌氧培养24h、好氧培养24h后除磷率最高可达95％，将其用于生物除磷工艺将有效提高磷的去除率，提高出水质量，具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域。更具体地，涉及一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌及其应用。
背景技术
近年来，随着城市化进程加快，城市人口急剧增加，城市生活污水的产量的与日俱增。污水中营养物质丰富(尤其是氮磷元素)，处理效果不佳、出水不达标将导致严重的富营养化，表现为藻类的大量繁殖和水质恶化。而磷是控制富营养化的关键因素，近些年磷的去除已经引起国内外广大学者的重视。
现阶段污水处理厂除磷技术主要有生物除磷和化学沉淀除磷，但是化学法往往成本高、污泥产量大，同时可能带来二次污染，所以生物除磷法更受研究者青睐。根据《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)规定，2006年1月1日建成的污水处理厂每日出水总磷浓度一级B标准为1mg/L，一级A标准为0.5mg/L，现有的许多工艺都无法满足如此严格的标准，改善工艺势在必行。但若大规模地更换设备、调整工艺必将带来高昂的成本，在原工艺上通过投加高效除磷的菌剂提高出水质量就成为了方便有效的途，此方法关键是菌种的筛选，需要一种高效的菌株提高工艺的运行效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有污水处理中的生物除磷技术存在的除磷效率不高，污水排放不达标等缺陷和不足。提供一株能高效吸收磷元素的好氧除磷菌株-不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)，所述菌株具有良好的除磷效果，在厌氧培养24h、好氧培养24h后除磷率最高可达88％，将其用于生物除磷工艺将有效提高磷的去除率，提高出水质量，具有较大的应用前景。
本发明的目的是提供一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacterrhizosphaerae)。
本发明的另一目的是提供所述高效除磷的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacterrhizosphaerae)的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌，其特征在于，所述菌株于2017年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC NO：60246；分类命名号为Acinetobacterrhizosphaerae；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)主要生物学特性是革兰氏阳性细菌；V-P试验呈阴性；吲哚试验呈阴性；不能水解淀粉；其16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。
本发明的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)的主要形态学特征是：菌落呈圆形，表面光滑，略微凸起，质地粘稠均匀且容易挑起。
本发明的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)，其活化培养基为：蛋白胨8-12重量份，酵母膏粉4-6重量份，葡萄糖0.5-1.5重量份，氯化钠4-6重量份，无菌水至1000重量份，pH为7.0±1。作为本发明实施例中一种优选的实施方式，所述不动杆菌根瘤菌的活化培养基为：蛋白胨10.0重量份，酵母膏粉5.0重量份，葡萄糖1.0重量份，氯化钠5.0重量份，无菌水至1000重量份，pH为7.0±0.2。
本发明的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)由广州市中山大学东校区小谷河某河段底泥中分离、驯化并筛选得到。该菌株具有良好的除磷效果，在厌氧培养24h、好氧培养24h后除磷率最高可达88％，将其用于生物除磷工艺将有效提高磷的去除率。
因此，本发明所述不动杆菌根瘤菌在污水生物除磷中或在制备高效除磷微生物制剂中的应用均在本发明保护范围内。
另一方面，本发明还提供了一种高效除磷的菌株悬浮液，其包含上述的不动杆菌根瘤菌。
另一方面，本发明还提供了一种高效除磷的菌株发酵液，其包含上述的不动杆菌根瘤菌。
其中，菌株悬浮液是指将离心后的上清液倒掉，加入水或缓冲液等溶剂，震荡或吹吸将下层菌体悬起来形成的均一的悬浊液。菌株发酵液是指将菌种接种与培养基，培养一段时间的液体。
另一方面，本发明还提供了高效除磷微生物制剂，其包含上述的不动杆菌根瘤菌或菌株悬浮液或菌株发酵液。
所述的微生物制剂中，除了含有不动杆菌根瘤菌，还可以含有有助于不动杆菌根瘤菌的生长发育的培养液或培养基或营养液等等。作为可选的实施方式，还可以含有其他有助于除磷的生物或化学类的成分，只要这些成分是不影响不动杆菌根瘤菌的生长发育以及除磷效果即可。
另一方面，本发明还提供了上述的不动杆菌根瘤菌或菌株悬浮液或菌株发酵液或微生物制剂在污水生物除磷中的应用。
具体地，所述应用为将上述不动杆菌根瘤菌接种到污水中以除去磷。
优选地，在污水中接种不动杆菌根瘤菌后先厌氧反应处理24小时，再好氧培养24小时。
优选地，所述污水的pH为5～9；优选地，所述污水的pH为6～7。
优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为5～15％；更优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为8～12％；还更优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为10％。
另一方面，本发明还提供了一种污水生物除磷的方法，其包括以下步骤：
(1)将上述的不动杆菌根瘤菌或菌株悬浮液或菌株发酵液或微生物制剂投加到污水中；
(2)厌氧培养18-36h，然后好氧培养18-36h；作为优选的实施方式，厌氧培养24h，然后好氧培养24h。
所述的方法中，污水的pH无特别限制，在pH4～10或者更大的范围内，该不动杆菌根瘤菌均有除磷效果。作为优选的实施方式，所述污水的pH为5～9，如污水的pH不在该范围内，可先在污水内添加pH调节剂，使污水达到合适的pH。作为更优选的实施方式，所述污水的pH为6～7，该pH范围最利于不动杆菌根瘤菌的生长，除磷效果更佳。
所述的方法中，作为优选的实施方式，不动杆菌根瘤菌的接种量为5～15％；更优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为8～12％；还更优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为10％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现了一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌(Acinetobacterrhizosphaerae)，所述菌株于2017年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC NO：60246；该菌株具有良好的除磷效果，除磷率最高可达95％，将其用于生物除磷工艺将有效提高磷的去除率，提高出水质量，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为本发明不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)的系统发育树结果。
图2为本发明不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)除磷率与培养时间的关系图。
图3为本发明不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)厌氧培养24h后的菌液用苏丹黑染色法染色后的结果。
图4为培养环境pH对本发明不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)除磷效率的影响。
图5为接种比例对本发明不动杆菌根瘤菌(Acinetobacter rhizosphaerae)除磷效率的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株的筛选、分离与鉴定
1、菌株来源
广州市中山大学东校区小谷河某河段底泥
2、培养基
(1)富集培养基：无水乙酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2 0.2g、(NH4)2SO42.0g、KH2PO42～20mg、微量元素溶液2mL、无菌水至1000mL、pH7.0～7.2，依次增加培养基中KH2PO4的含量：2、5、10、15、20mg。
(2)LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母膏粉5.0g，葡萄糖1.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，无菌水至1000mL，pH7.0±0.2。
(3)活化培养基：蛋白胨10.0g，酵母膏粉5.0g，葡萄糖1.0g，氯化钠5.0g，无菌水至1000mL，pH7.0±0.2。
(4)检测培养基：CH3COONa 1g，MgSO4 82mg，FeSO4·7H2O 6.76mg，CaCl260mg，(NH4)2SO4 0.2g，牛肉浸膏0.22g，K2HPO4 74mg，微量元素溶液2mL，定容至1000mL，pH7.0～7.2。
(5)微量元素溶液：FeCl3·6H2O 1.498g，硼酸150mg，CuSO4·5H2O 46.875mg，KI30mg，MnCl2·4H2O 94.275mg，ZnSO4·7H2O 214.35mg，CoSO4·7H2O 302.72mg，Na2MoO4·2H2O 70.485mg，定容至1000mL，pH7.0～7.2。
3、聚磷菌的富集
从河道底泥中取若干质量污泥装到100mL无菌水和转子的锥形瓶中，在磁力搅拌器中充分振荡以打碎污泥，待样品搅拌均匀后转移10mL到装有150mL富集培养基的锥形瓶中，在30℃，150r/min的摇床上振荡培养48h后，再转移10mL到新的富集培养基中，同样条件下振荡培养48h，如此重复4次，每次转移量都是10mL。依次增加富集培养基中KH2PO4的含量2、5、10、15、20mg。
4、聚磷菌的分离和初筛
取最终富集培养液1mL，选择合适的稀释梯度(要求平板上菌落分布均匀，即菌落数在30～300)进行梯度稀释，取稀释后菌液1mL涂布在LB培养基上，于30℃培养24h～36h，即有明显菌落出现。选择形态清晰且不同的单菌落进行划线纯化，重复3次以上直至菌落特征一致，无异常菌落出现。最后接种到斜面培养基上保存以备用。
5、聚磷菌的复筛
取斜面保存的菌株，先在活化培养基中进行预培养，培养物在摇床上30℃、150r/min培养12h后，按10％的比例将菌悬液转接到200mL检测培养基中，在30℃、150r/min下培养36h，培养完成后取培养液在10000r/min下离心10min，取上清液按照钼锑抗分光光度法测定总磷浓度，对比接种前后总磷的变化。筛选获得一株除磷性能较好的菌株。
6、菌株鉴定
对步骤5分离得到的菌株进行生理生化特性试验，生理生化特性试验步骤参考王兰主编的《环境微生物学实验方法与技术》。其主要生物学特性是革兰氏阳性细菌；V-P试验呈阴性；吲哚试验呈阴性；不能水解淀粉。再将分离得到的菌株的16S rDNA基因序列进行分析，结果显示其16S rDNA基因序列和Acinetobacter rhizosphaerae同源性达100％，系统发育树如图1所示，结合生理生化特性试验将其鉴定为不动杆菌属根瘤菌(Acinetobacterrhizosphaerae)。并于2017年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC NO：60246，分类命名号为Acinetobacter rhizosphaerae；保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2聚磷菌的应用
1、聚磷菌的除磷效率
将实施例1获得的除磷菌挑取一环接入活化培养基中，在摇床上30℃、150r/min培养12h后，按10％的比例将菌悬液转接到200mL检测培养基中。培养过程包括厌氧和好氧两个过程，故先对用橡皮塞将盛有混合液的锥形瓶密封，再通入过滤除菌的高纯氮气，以提供厌氧的环境；厌氧静置培养24h后转移到30℃、150r/min摇床中好氧培养24h；培养完成后取培养液在10000r/min下离心10min，取上清液按照钼锑抗分光光度法测定总磷浓度，考察菌株对总磷(TP)的去除率，其结果见图2所示，聚磷菌在36h左右去除效果达到最大值，去除率接近90％。
2、聚磷菌胞内聚合物的PHB染色和异染颗粒染色
对筛得的高效菌株进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色。前者取的是厌氧培养24h后的菌液，后者取的是好氧培养24h后的菌液，染色方法分别是苏丹黑染色法和Albert染色法。
PHB苏丹黑染色法：按常规方法制片，用苏丹黑染10min；用水冲去染液，吸干；用二甲苯冲洗涂片至无色素脱落；用0.5％番红复染1～2min；水洗，吸干，备油镜镜检。若有PHB颗粒，则颗粒呈黑色，菌体其它部分呈红色。染色结果图3所示。
Albert染色法：所需试剂有甲液和乙液，甲液成分：甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.20g，冰醋酸1mL，95％酒精2mL，蒸馏水100mL；乙液成分：碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300mL。按常规方法制片，用甲液染5min，倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1min，水洗；吸干，备油镜镜检；异染颗粒呈黑色，菌体其它部分呈绿色。
实施例3 pH对菌株除磷效率的影响
调节检测培养基pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，将实施例1筛选获得的菌株按10％的比例接种量接种到装有200mL不同pH值的培养基的250mL锥形瓶中，往瓶内通氮气以维持厌氧条件，24h静置培养过后，在30℃、150r/min下好氧培养24h，测定最终上清液中总磷的浓度，得到除磷率。结果如图4所示，根瘤菌在不同pH培养液中生长情况也不相同，随着pH值升高，生物量先升高后降低，在PH＝6和PH＝7时OD600值最高，生物量最大。在培养液生物量最大时磷的去除达到最大值90％，由上图可以看出，pH是通过影响生物量间接的影响磷的去除率。
实施例4接种比例对菌株除磷效率的影响
准备5个装有200mL检测培养基的250mL锥形瓶，分别按1％，5％，10％，15％和20％的比例将扩培后的菌液投加到检测培养基中，往瓶内通氮气以维持厌氧条件，24h静置培养过后，在30℃、150r/min下好氧培养24h，测定最终上清液中总磷的浓度，得到除磷率。结果如图5所示，随着接种菌液比例的升高，细菌的OD600值先升高后降低，磷的去除效果同样呈现先升高后降低趋势，在接种比例为10％时去除率达到最大值87.6％，后期接种比例升高后OD600值反而降低，是因为锥形瓶中的营养元素固定，菌剂接种量大，营养消耗快，细菌很快进入衰亡期，生物量和去除效果都降低。因此，最优的细菌接种比例为10％。
序列表
<110> 广州中大环境治理工程有限公司
中山大学
<120> 一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
aagtcgagcg gagagaggta gcttgctact gatttagcgg cggacgggtg agtaatgctt 60
aggaatctgc ctattagtgg gggacaacat ttcgaaagga atgctaatac cgcatacgtc 120
ctacgggaga aagcagggga tcttcggacc ttgcgctaat agatgagcct aagtcggatt 180
agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc tgagaggatg 240
atccgccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggccttatgg 360
ttgtaaagca ctttaagcga ggaggaggct actttagtta atacctagag atagtggacg 420
ttactcgcag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg 480
caagcgttaa tcggatttac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggctaatt aagtcaaatg 540
tgaaatcccc gagcttaact tgggaattgc attcgatact ggttagctag agtgtgggag 600
aggatggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg aataccgatg 660
gcgaaggcag ccatctggcc taacactgac gctgaggtgc gaaagcatgg ggagcaaaca 720
ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgtct actagccgtt ggggcctttg 780
aggctttagt ggcgcagcta acgcgataag tagaccgcct ggggagtacg gtcgcaagac 840
taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900
tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catagtaaga actttccaga gatggattgg 960
tgccttcggg aacttacata caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttttccttat ttgccagcga gtaatgtcgg 1080
gaactttaag gatactgcca gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg tcaagtcatc 1140
atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgctacc 1200
tagcgatagg atgctaatct caaaaagccg atcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg 1260
actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg aatacgttcc 1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga agtagctagc 1380
ctaactgcaa agagg 1395
Claims (10)
1.一株高效除磷的不动杆菌根瘤菌，其特征在于，其分类命名为Acinetobacterrhizosphaerae，该菌株于2017年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC NO：60246。
2.根据权利要求1所述不动杆菌根瘤菌，其特征在于，所述不动杆菌根瘤菌的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述不动杆菌根瘤菌的生物学特性是革兰氏阳性细菌；V-P试验呈阴性；吲哚试验呈阴性；不能水解淀粉；
优选地，所述不动杆菌根瘤菌的形态学特征是：菌落呈圆形，表面光滑，略微凸起，质地粘稠均匀且容易挑起。
3.根据权利要求1所述不动杆菌根瘤菌，其特征在于，所述不动杆菌根瘤菌的活化培养基为：蛋白胨8-12重量份，酵母膏粉4-6重量份，葡萄糖0.5-1.5重量份，氯化钠4-6重量份，无菌水至1000重量份，pH为7.0±1；
优选地，所述不动杆菌根瘤菌的活化培养基为：蛋白胨10.0重量份，酵母膏粉5.0重量份，葡萄糖1.0重量份，氯化钠5.0重量份，无菌水至1000重量份，pH为7.0±0.2。
4.权利要求1-3任一所述不动杆菌根瘤菌在制备高效除磷微生物制剂中的应用。
5.一种高效除磷的菌株悬浮液，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述不动杆菌根瘤菌。
6.一种高效除磷的菌株发酵液，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述不动杆菌根瘤菌。
7.一种高效除磷微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述不动杆菌根瘤菌或权利要求5所述的菌株悬浮液或权利要求6所述的菌株发酵液。
8.权利要求1-3任一所述的不动杆菌根瘤菌或权利要求5所述的菌株悬浮液或权利要求6所述的菌株发酵液或权利要求7所述的微生物制剂在污水生物除磷中的应用。
9.一种污水生物除磷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1-3任一所述的不动杆菌根瘤菌或权利要求5所述的菌株悬浮液或权利要求6所述的菌株发酵液或权利要求7所述的微生物制剂投加到污水中；
(2)厌氧培养18-36h，然后好氧培养18-36h；优选地，厌氧培养24h，然后好氧培养24h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述污水的pH为5～9；优选地，所述污水的pH为6～7；
优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为5～15％；更优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为8～12％；还更优选地，所述不动杆菌根瘤菌的接种量为10％。
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