CN111117923B - 一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌新菌株Gj-4 - Google Patents

一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌新菌株Gj-4 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌新菌株Gj‑4，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20191035，保藏日期为2019年12月11日。该菌株在以胰蛋白胨为最优氮源并在C/N比值为3.2、pH为6.0~7.0、培养条件为35℃、180 rpm下好氧培养时，4天的果胶降解率可达85.85%。Gj‑4是从腐烂的柑橘皮中分离得到，经过扩大培养后可用于处理果胶废水，制备成本低廉，且具有生物降解技术的常见优势，即具有对环境影响程度轻、无二次污染、工艺简单、方式灵活等优点，具有良好的开发应用前景。

Description

一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌新菌株Gj-4
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌新菌株Gj-4。
背景技术
果胶是一种天然的高分子化合物，其组分是多缩半乳糖醛酸甲酯和半乳糖醛酸，本质是由酯化度不同的半乳糖醛酸以糖苷键聚合而成的多糖有机物，广泛存在于植物细胞壁中，果胶相对分子质量在1万~40万之间。由于果胶具有良好的胶凝增稠作用，在处理加工果蔬产品过程中产生的含果胶废水时，果胶往往会堵塞污水管道，影响处理设施的正常运行，降低处理效率，增大维护成本。
目前，常用的果胶废水处理方法主要包括复合絮凝剂处理、混凝-吸附法处理和果胶酶处理等，利用复合絮凝剂和混凝-吸附法处理果胶废水是当前最快捷的果胶去除策略，主要通过絮凝剂与果胶分子形成絮体而去除果胶，但此类方法容易产生二次污染，且后续脱色程序较繁琐。果胶酶处理果胶废水可以达到很好的效果，但处理费用过高。因此，急需寻找一种更为高效、低廉、且可解决果蔬加工过程中产生的污染问题的果胶废水处理方法。
生物处理技术因具有对环境影响程度轻、无二次污染、工艺简单、处理能力强、方式灵活等优点，已成为污水处理领域的热点之一。菌种是生物处理技术的关键，筛选分离出一株具有高效降解果胶功能的细菌，将成为解决含果胶废水生物处理问题的核心所在。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）新菌株Gj-4，为处理加工果蔬过程中产生的含果胶废水提供一种良好的微生物材料，对污水处理领域具有较大实际意义。
本发明的技术方案为：本发明所述的水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株Gj-4 已经于2019年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20191035。
该水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株Gj-4分离自腐烂的柑橘皮中。
该水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株Gj-4在马丁氏培养基上恒温培养，菌落表面光滑，不透明，呈现圆形，淡黄色，边缘整齐，细胞杆状。
该水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)新菌株Gj-4在以胰蛋白胨为最优氮源并在C/N比值为3.2、pH为6.0～7.0、培养条件为35℃、180 rpm下好氧培养时，该菌株降解果胶效果最强，4天果胶的降解率达到85.85%。
本发明的有益效果是：
1. 分离的水生拉恩氏菌Gj-4具有高效的降解果胶的功能，在最优培养条件下，4天的果胶降解率可达85.85%；
2. 本发明中公开的水生拉恩氏菌Gj-4是从腐烂的柑橘皮中分离得到，经过扩大培养后可用于处理果胶废水，制备成本低廉，且具有生物降解技术的常见优势，即具有对环境影响程度轻、无二次污染、工艺简单、方式灵活等优点，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1是初筛细菌降解果胶效果图；
图2是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4的纯培养菌落图；
图3是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4的形态和生理生化特征结果统计图；
图4是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4的16S rDNA序列图；
图5是基于16S rDNA 基因序列的水生拉恩氏菌Gj-4的系统发育树；
图6是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4的生长曲线图；
图7是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4在不同温度下的细菌生长曲线图；
图8是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4在不同pH下的细菌生长曲线图；
图9是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4在不同氮源下的降解果胶效果图；
图10是水生拉恩氏菌新菌株Gj-4在不同C/N下的降解果胶效果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）Gj-4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M20191035，保藏日期为2019年12月11日。
实施例一、水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）Gj-4的采集、分离和鉴定
实验设备主要包括摇床、pH计及分光光度计等，均为市售
测定项目涉及pH、果胶浓度测定等，根据标准的测定方法，需要使用到的药剂主要有：果胶，浓硫酸，半乳糖醛酸，乙醇，咔唑，葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氢钾，七水合硫酸镁等，各药剂均为市售。
测定项目中pH测定采用玻璃电极法，果胶测定采用咔唑比色法，相应的分析步骤均按国家标准分析方法执行。
筛菌样品来源：从水果店选取腐烂的柑橘，装袋后带回实验室，4℃保存备用。
主要培养基配方：
果胶固体选择培养基：果胶1~1.5 g，胰蛋白胨10~15 g，KH2PO4 1~1.5 g，MgSO4•7H2O 0.5~1 g，蒸馏水1000 mL，琼脂15~20 g，pH自然，经121℃、20min高压灭菌备用；
马丁氏液体培养基：葡萄糖10~15 g，胰蛋白胨10~15 g，KH2PO4 1~1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5~1 g，蒸馏水1000 mL，pH自然，经115℃、30 min高压灭菌备用；
模拟果胶废水：果胶1.2 g，胰蛋白胨10~15 g，KH2PO4 1~1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5~1 g，蒸馏水1000 mL，pH自然，经121℃、20 min高压灭菌后模拟果胶废水进行降解实验。
1. 降解菌的筛选
称取10 g腐烂的柑橘皮（含有大量果胶），加入装有90 mL PBST缓冲溶液的三角瓶中，35℃恒温摇床中充分震荡30 min，制成10-1悬浊液。静置后取上层清液，移入装有9 mL无菌水的试管中，制成10-2菌悬液，以此类推，制成10-3、10-4、10-5的菌悬液。选择10-2、10-3、10-4、10-5四个浓度的菌悬液各50 μL，涂布于果胶固体选择培养基上，在35℃恒温培养箱中倒置培养24 h。挑取菌落形态不同的单菌接种至果胶固体选择培养基上，反复划线分离纯化得到纯菌株。菌株在马丁氏液体培养基中扩培后，加入30%甘油保存于-80℃冰箱中备用。
划线分离共得到四株菌株，四株菌株在马丁氏液体培养基中扩培后以3%的接种浓度接种于果胶浓度为1200 mg/L的模拟果胶废水中进行果胶降解实验。降解初筛效果如图1所示，从图中可知，菌株Gj-4的降解效果最好，6天降解率达67.08%。
2. 降解菌的鉴定
（1）降解菌形态特征鉴定
菌株Gj-4经马丁氏液体培养基培养24 h后，在马丁氏固体培养基板上均匀涂布，得到均匀的单个菌落，观察菌落的形状、大小、质地、颜色、透光度、隆起状、边缘形状以及色素等特征。
（2）降解菌生理生化特性鉴定
菌株Gj-4经马丁氏液体培养基培养24 h后，进行葡萄糖、甲基红反应、V-P实验、柠檬酸盐、淀粉水解、明胶液化、接触酶、氧化酶、需氧性、产生H2S等生理生化实验。
实验结果表明：菌株Gj-4在马丁氏培养基上呈圆形，淡黄色，表面光滑，不透明，边缘整齐，细胞杆状，革兰氏阴性。具体结果见图2-3。
（3）降解菌基因序列的测定
菌株Gj-4送至南京擎科生物技术有限公司进行测序，降解菌基因组DNA采用（快速提取盒）试剂盒提取菌株的总DNA，用16S rDNA通用引物27 F（正向引物）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492 R（反向引物）：5’-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3’，以分离降解菌的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：DNA模板1 μL，10×PCR Buffer5 μL，dNTP（2.5mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，Tap酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 37.5μL。扩增程序：95℃ 5 min，94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min 15 s；32次循环，72℃ 10min；反应完成后，经1%琼脂糖电泳，检测扩增片段的大小和特异性。PCR产物经过16S rDNA基因测序，将得到的序列与GenBank中已知序列进行比对，根据16S rDNA序列同源性比对表明，降解菌Gj-4与水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis同源性最近，序列相似性高达99.9%。16S rDNA序列：SEQ ID NO.1如图4所示，构建的系统发育树如图5所示。
从发育树结果结合形态观察和生理生化实验，确定该菌属于变形菌门Proteobacteria，γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，肠杆菌目Enterobacterales，耶尔森菌科Yersiniaceae，拉恩氏菌属Rahnella。
实施例二、环境因子对降解菌生长的影响
（1）生长曲线的绘制：
将Gj-4的菌悬液接种于马丁氏液体培养基中，35℃，180 r/min摇震培养24 h，每隔2 h取一次样，在紫外可见分光光度计600 nm波长下测定其光密度值（OD600），并绘制培养试剂与OD600的关系曲线，结果如图6所示。
（2）温度对降解菌生长的影响：
将Gj-4的菌悬液接种于马丁氏液体培养基中，在不同温度下（20、25、30、35、40℃），180 r/min摇震培养24 h后，测定OD600，结果如图7所示，从图中可知，35℃为Gj-4生长的最佳温度。
（3）pH对降解菌生长的影响：
用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调节马丁氏液体培养基的pH，使初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，35℃、180 r/min摇震培养24 h后，测定OD600，结果如图8所示，从图中可知，Gj-4生长的最佳pH为6.0～7.0。
实施例三、不同氮源对降解果胶效果的影响
将Gj-4的菌悬液接种于果胶浓度为1200 mg/L的模拟果胶废水中，保持C/N为0.4，以测试氮源——硫酸铵、尿素、硝酸钠、亚硝酸钠分别代替原有的胰蛋白胨，35℃、180 r/min摇震培养，测定降解率，降解效果如图9所示，由图示结果可知Gj-4降解果胶最适合的氮源为胰蛋白胨，（硝酸钠以及亚硝酸钠为氮源的果胶溶液因会与测定果胶所用的试剂发生反应，没有统计在内）。
实施例四、不同C/N对降解果胶效果的影响
在果胶浓度为1200 mg/L的模拟果胶废水中，调整氮源，使C/N分别为0.4、0.8、1.6、3.2，将菌悬液接入培养基中，35℃、180 r/min摇震培养，测定降解率，降解效果如图10所示，由图示结果可知Gj-4降解果胶最适合的C/N为3.2。
综上可知，Gj-4在以胰蛋白胨为最优氮源并在C/N比值为3.2、pH为6.0～7.0、培养条件为35℃、180 rpm下好氧培养时，该菌株降解果胶效果最强。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (4)

1.一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌( Rahnellaaquatilis) 新菌株Gj-4 ，其特征在于，该菌株于2019年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20191035。
2.如权利要求1所述的一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis新菌株Gj-4，其特征在于，该水生拉恩氏菌新菌株Gj-4分离自腐烂的柑橘皮中。
3.如权利要求1所述的一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis新菌株Gj-4，其特征在于，该菌株接种在马丁氏培养基上恒温培养，菌落表面光滑，不透明，呈现圆形，淡黄色，边缘整齐，细胞杆状。
4.如权利要求1所述的一株具有降解果胶功能的水生拉恩氏菌Rahnella aquatilis新菌株Gj-4，其特征在于，该菌株在以胰蛋白胨为最优氮源并在C/N比值为3.2、pH为6.0～7.0、培养条件为35℃、180 rpm下好氧培养时，该菌株降解果胶效果最强，4天果胶的降解率达到85.85%。
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