CN105969701B - 一种降解pva的鞘脂单胞菌 - Google Patents

一种降解pva的鞘脂单胞菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解PVA的鞘脂单胞菌，属于微生物领域。该菌株于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016302，保藏地址为中国武汉、武汉大学。该菌株能够在不需要添加PQQ的情况下有效降低培养基和印染污水中PVA的含量，既能够减少环境污染又能降低污水处理成本。该菌株培养72h后，能够快速高效地利用浓度为1g/L的PVA，PVA降解率可达80％以上；培养96h后，菌株能将PVA完全降解。

Description

一种降解PVA的鞘脂单胞菌
技术领域
本发明涉及一种降解PVA的鞘脂单胞菌，属于微生物领域。
背景技术
聚乙烯醇(poly vinyl alcohol，简称PVA)是一种人工合成的、无味、粉末状的高分子化合物，主要以1,3-二醇键的化学结构存在(结构式如下)。
由于PVA具有许多优良特性，如乳化性、成膜性、高粘度等，它被广泛应用于纺织、造纸等行业。尤其在纺织工业，PVA作为浆料给织物上浆，能够使织物粘合力高，成膜力大，坚韧柔软，不易发生腐蚀和化学变化。但上浆的织物在成品前必须经过退浆处理以去除PVA，加强棉织物对水的吸收。目前，工厂多采用高温碱法进行退浆，加工过程需消耗大量水、化学助剂和热能，同时排放残留大量PVA的废水。PVA又是退浆废水中一种很难生物降解的物质，如果不能得到有效去除，将对环境造成严重的污染。
目前降解废水中PVA的方法主要有：化学法和生物法。传统的化学法是在退浆过程中采用高温加酸、碱或是用氧化剂来破坏PVA的长链结构使其降解，但是与此同时也对棉纤维造成了较大的损伤，而且十分浪费能源。生物法将微生物或PVA降解酶应用于纺织退浆工艺或下游的废水处理中，具有织物损伤小、能耗低、设备要求低、排污少、废水处理简单等优势，是一种“绿色环保”的处理技术。因此，筛选并研究具有降解PVA能力的微生物及PVA降解酶对于纺织工业污水处理等方面具有重大意义。
发明内容
本发明提供了一株不需要添加PQQ即可单独、高效降解溶液中PVA的鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis sp)菌株鞘脂单胞菌F2Sphingopyxis sp.F2，命名为鞘脂单胞菌F2，于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016302，保藏地址为中国武汉、武汉大学。
所述鞘脂单胞菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
所述鞘脂单胞菌能够降解溶解态的PVA1799。
所述鞘脂单胞菌来源于曝气池活性污泥，其分离方法如下：取少量活性污泥与无菌水混合，制备污泥悬液，在筛选培养基上涂布稀释后的污泥悬液，30℃培养3天，观察生长出的菌落形态，选取菌落周围透明圈最大的菌落进行进一步分离纯化。
所述筛选培养基配方为：(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 2.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.02g，NaCl 0.02g，CaCl2·2H2O 0.01g，PVA1799 1g，琼脂20g，1000mL水，调节pH至7.5
所述固体分离培养基是以PVA为唯一碳源的筛选培养基。
所述鞘脂单胞菌的保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入种子培养基中，在30℃培养24h，取500μL培养液移入含有500μL 30％甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。
所述鞘脂单胞菌的降解PVA的方法包括如下步骤：将所述鞘脂单胞菌接种于种子培养基中，在30℃，200rpm的回转式摇床上培养24h，再以3％～5％的接种量接种至含有PVA的溶液中；所述种子培养基配方为：(NH4)2SO4 1g，KH2PO4 0.2g，K2HPO4·3H2O 2.1g，酵母粉2g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.02g，NaCl 0.02g，CaCl2·2H2O 0.01g，PVA1799 1g，调节pH为7.5。
在本发明的一个具体实施方式中，所述接种是按3％的接种量将鞘脂单胞菌F2接种至含PVA的溶液中。
所述接种于种子培养基是指将鞘脂单胞菌在固体种子培养基上划线，于30℃培养3天，挑取单菌落接入种子培养基中；所述固体种子培养基是添加2％琼脂粉的种子培养基。
本发明的有益效果：本发明的鞘脂单胞菌属菌株Sphingopyxis sp F2可以单独、高效地降解培养基中的PVA 1799，并且在培养过程中不需要添加PQQ这种昂贵的辅酶。有别于混菌复杂的共生体系和混菌之间的协同作用机制。本发明提供的鞘脂单胞菌能快速高效地利用溶液中1g/L PVA，72h后，PVA降解率可以达到80％以上；96h后，PVA基本完全降解。
生物材料保藏
鞘脂单胞菌F2Sphingopyxis sp.F2，已于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016302，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1为纯化所得的鞘脂单胞菌F2在以PVA为唯一碳源的平板上经改良的Finley法显色后所形成的透明圈图；
图2为将鞘脂单胞菌F2接入发酵培养基的PVA降解特性图；
图3为鞘脂单胞菌F2的系统进化树图。
具体实施方式
鞘脂单胞菌的筛选培养基(g·L-1)：
(NH4)2SO4 1，KH2PO4 0.2，K2HPO4·3H2O 2.1，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O0.02，NaCl 0.02，CaCl2·2H2O 0.01，PVA17991，琼脂20，pH 7.5
鞘脂单胞菌的种子培养基(g·L-1)：
(NH4)2SO4 1，KH2PO4 0.2，K2HPO4·3H2O 2.1，酵母粉2，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，CaCl2·2H2O 0.01，PVA1799 1，pH 7.5
鞘脂单胞菌的发酵培养基(g·L-1)：
(NH4)2SO4 1，KH2PO4 0.2，K2HPO4·3H2O 2.1，酵母粉1，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02，NaCl 0.02，CaCl2·2H2O 0.01，PVA 1799 1，pH 7.5
实施例1鞘脂单胞菌筛选方法
1.污泥样品来源：无锡太平洋印染厂的曝气池活性污泥。
2.制备菌悬液：将适量采集所得的样品置于生理盐水中溶解培养，在30℃，200rpm的回转式摇床上，培养10h。
3.筛选：将菌悬液稀释成不同的倍数，涂布在以PVA为唯一碳源的分离培养基上，30℃培养3天，用Finley法显色后，选择可以产生透明圈的菌株，在平板上反复进行3次分离纯化，最终获得纯目的菌株。将纯培养物接种到种子培养基中培养24h，收集菌体并提取菌体的基因组DNA。通过16S rDNA扩增，并将扩增后的序列进行测序，其16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果与Genbank数据库比对并利用MEGA6.06软件进行多重序列同源性比对分析(分析结果如图1所示)，最终确定筛选获得的菌株是鞘脂单胞菌。
该菌已于2016年6月1日保藏于中国典型微生物菌种保藏管理中心，武汉市武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC NO:M 2016302。
实施例2鞘脂单胞菌F2的培养和保藏
鞘脂单胞菌F2的保藏条件如下：从生长良好的平板上挑取单菌落转接入种子培养基中，在30℃培养24h，取500μL培养液移入含有500μL 30％甘油的保藏管中，置于-80℃冰箱保存。
鞘脂单胞菌F2的培养方法如下：将保藏的鞘脂单胞菌F2在固体种子培养基上划线，于30℃培养3天，挑取单菌落接入种子培养基中，在30℃，200rpm的回转式摇床上培养。
实施例3鞘脂单胞菌F2中PVA降解酶总酶活的测定
PVA浓度的测定(改良的Finley法)：即在10mL比色管中分别加入待测样品400μL，25g·L-1的硼酸3mL和0.1mol·L-1I2-KI 0.3mL，用去离子水定容到10mL，混匀后放于室温下避光静置10min，在690nm处测定其吸光值。(对照：以水替换待测样品进行同样处理)
PVA降解酶总酶活的测定方法：将发酵液在4℃下超声破碎15min，经微孔滤膜(孔径0.45μm，直径50mm)过滤，然后用0.1mol/L pH 7.5的磷酸钾缓冲液透析过夜，获得粗酶液。取1mL粗酶液加入到1mL PVA底物(1g/L的PVA溶于0.1mol/L pH 7.5的磷酸钾缓冲液)中。将此反应体系于30℃，反应6h。参照改良的Finley法测定反应前后体系所对应PVA含量的吸光值。在690nm处，每分钟吸光值下降0.001所需的酶量定义为一个酶活单位。
实施例4鞘脂单胞菌F2对溶液中1g/L PVA1799的降解
挑取平板上活化好的鞘脂单胞菌F2单菌落接种于种子培养基中，在30℃，200rpm的回转式摇床上，培养24h后按3％的接种量接入发酵培养基中，在30℃，200rpm的回转式摇床上培养，每隔24h取样并测定样品中剩余PVA的含量。结果显示，鞘脂单胞菌F2能快速高效地利用培养基中1g/L PVA，72h后，PVA降解率可达80％以上；96h后，PVA基本完全降解。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)，其特征在于，于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016302，保藏地址为中国武汉、武汉大学。
2.一种降解PVA的方法，其特征在于，将权利要求1所述鞘脂单胞菌接种至含有PVA的溶液中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接种是以3％～5％的接种量将鞘脂单胞菌接种至含有PVA的溶液中。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是将鞘脂单胞菌接种至种子培养基中进行培养，再接种至含有PVA的溶液中；所述种子培养基配方为：(NH4)2SO4 1g、KH2PO40.2g、K2HPO4·3H2O 2.1g、酵母粉2g、MgSO4·7H2O 0.05g、FeSO4·7H2O 0.02g、NaCl0.02g、CaCl2·2H2O 0.01g、PVA1799 1g和1000mL水，调节pH为7.5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种至种子培养基是指将鞘脂单胞菌在固体种子培养基上划线，于30℃培养3天，再挑取单菌落接入种子培养基中；所述固体种子培养基是每100mL添加2g琼脂粉的种子培养基。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养是在30℃，200-250rpm条件下培养24h。
7.权利要求1所述鞘脂单胞菌在降解PVA中的应用。
8.权利要求1所述鞘脂单胞菌在污水处理中的应用。
9.一种PVA降解剂，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)。
10.一种织物整理剂，其特征在于，活性成分包括权利要求1所述的鞘脂单胞菌(Sphingopyxis sp.)。
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