KR101850516B1 - 신규 해양 유래의 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) 인디고 생산 균주 및 이를 이용하여 인디고 색소를 생산하는 방법 - Google Patents

신규 해양 유래의 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) 인디고 생산 균주 및 이를 이용하여 인디고 색소를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인디고 생산능력이 있는 신규한 셀러리박터 속 2종의 균주에 관한 것으로, 구체적으로 이 2종의 균주는 각각 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6 균주이다. 상기 균주들이 인돌을 기질로 인디고를 생합성할 수 있다.

Description

신규 해양 유래의 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) 인디고 생산 균주 및 이를 이용하여 인디고 색소를 생산하는 방법{Celeribacter sp. strain from marine source and method for producing indigo dye by using the same}
본 발명은 천연염료인 인디고(Indigo)를 생산하는 세균 균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 해양 유래의 인디고 생산 능력을 가지는 세균 균주, 상기 균주를 배양하는 것을 포함하는 인디고 색소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
인디고(Indigo)는 가장 광범위하게 사용되어온 청색 염료 가운데 하나로 전통적으로는 폴리고넘 틱토리움(Polygonum tinctorium), 인디고페라 틱토(Indigofera tinctor) 및 이사티스 인디고티카(Isatis indigotica) 등의 식물에서 추출하여 사용하였으나, 식물에서 생산되는 인디고는 대량 생산이 어렵고, 추출에 어려움이 있어 주로 화학적인 방법에 의해 대량생산되고 왔다. 하지만 이 과정에서 난분해성 환경오염물질을 발생시키며 인디고 합성에 고에너지가 요구되는 문제점이 존재한다. 또한, 화학합성 인디고는 가격이 저렴하여 주로 청바지나 값싼 옷감에 이용되었고, 고급 옷감의 경우 쪽과 같은 식물에서 추출한 천연 인디고로 염색하여 왔기 때문에 가격이 비싸다. 한편, 화학합성 인디고는 단일색소로 되어 있는 반면 식물염료의 경우 다양한 색소를 포함하고 있어 염색 후 색감이 다른 것으로 알려져 있다. 따라서 만일 미생물로부터 다양한 색을 나타내는 인디고 혼합물을 대량생산하면 친환경적이면서 저렴한 가격으로 고급 색감을 나타내는 염료로 이용할 수 있다.
미생물에 의한 인디고 생산은 나프탈렌 다이옥시게네이즈(Naphthalene dioxygenase)를 발현하는 재조합 E. coli 균주에서 처음 보고되었으며 (Ensly BD et al., 1983, Science, 222(4620):167-9), 그 이후 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 에시네토박터 속(Acinetobacter sp.) 균주에서도 인디고를 생산한 보고가 존재한다(KEVIN E. O'CONNOR et al., 1997, Applied and Environmental Microbiology, p.4287-4291, Yuanyuan Qu et al., 2010, Bioresource Technology (101)4527-4532) 하지만, 아직도 미생물을 통해 인디고를 산업적으로 대량 생산하는데 생산균주가 제한되어있으며, 생산 수율이 낮은 문제와 더불어 공정의 어려움이 존재한다.
한편, 인디고 생산 균주들은 탄소원과 에너지원으로 방향족 화합물을 이용할 수 있는데 특히, 기질인 트립토판(Tryptophan)과 독성이 있는 인돌(Indole)로부터 옥시게나아제(Oxygenase)를 발현하여 인디고를 생산하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 이러한 문제점이 개선된 새로운 인디고 생산 균주 및 이를 이용한 인디고 색소의 생산방법이 요구되고 있는 상황이다.
이상과 같은 문제점을 해소하기 위해, 본 발명은 환경에 해로운 영향을 미치지 않고, 인디고의 합성과정이 단순한 미생물 및 이러한 미생물을 통해 인디고를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 갯벌에서 다환 방향족 탄화수소(Poly aromatic hydrocarbons, PAHs)를 분해하는 세균으로부터 인디고 생산능력이 있는 새로운 균주를 분리, 동정하고 이들의 인디고 생산능력을 확인하였다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) 의 인디고 생산 균주를 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 호기 배양하여 인디고를 생산하는 방법을 제공한다.
나아가 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주의 배양이 종료된 후, 인디고 및 균체가 포함된 배양액에서 인디고를 정량하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 갯벌에서 PAHs를 분해하는 미생물 중에서 인디고 생산능력이 있는 세균을 선별하였으며, 상기 인디고 생산 세균은 셀레리박터 속으로 동정이 되었다. 이 미생물의 발견은 기존에 밝혀지지 않은 인디고 생산능력이 있는 새로운 균주로 신규성이 있다.
또한, 본 발명의 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2와 TSPH6은 인디고 생산능력을 가지므로, 친환경적이며 안전하게 인디고를 생산하는데 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 인돌 기질로 인디고 생산 경로이다.
도 2는 2종의 분리된 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2와 TSPH6에 대한 계통발생학적 관계를 분석한 계통수이다. 계통수에 함께 나타낸 균주들은 PAHs를 분해하는 세균으로 알려진 균주들이다.
도 3, 4, 5는 배지 조건, 인돌 농도, 산소 공급에 따른 생육 및 인디고 생성 결과이다.
도 6, 7은 최적 조건에서 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH와 TSPH6의 시간에 따른 생육 및 인디고 형성 정도를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하며, 인디고(indigo) 생산 능력을 가지는 세균 균주를 제공한다. 상기 세균 균주는 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6이다.
상기 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6는 태안의 갯벌에서 다환방향수소족 (Poly aromatic hydrocarbons)의 하나인 페난트렌(phenanthrene)을 분해할 수 있는 세균을 분리한 것이다. 상기 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 7월 26일자로 각각 KCCM11874P 및 KCCM11875P 로 기탁하였다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 인디고 제조용 미생물 제제를 제공한다. 본 발명의 인디고 환원용 미생물 제제는 유효성분으로서 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6 균주를 단독으로, 또는 서로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 균주를 혼합하여 제조할 경우, 인디고 제조 효과는 증진될 수 있다. 본 발명에 따른 인디고 제조용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 인디고 제조용 미생물 제제는 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 미생물 제제의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 혼합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 인디고 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 호기 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 예를 들면 이들 미생물은 Zobell 배지 또는 NY 배지에서 배양하며, 25, 중성의 pH(6.5~7.5)에서 호기적인 조건에서 배양하되, 이때 NY 배지의 조성은 0.5% Yeast extract, 1% NaCl 이나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생산 방법에서 기질은 인돌을 사용할 수 있고, 예를 들어 1 내지 5mM, 바람직하게는 2.5 mM의 인돌을 사용할 수 있다.
실시예 1: 재료 및 방법
1) 인디고 생산 미생물 선별
인디고 생산 미생물을 선발하기 위하여 2011년 5월 4일 태안의 갯벌에서 샘플을 채취하였다. 상기 채취한 갯벌 시료 10mg은 Mineral Salt Medium(MSM) 10ml 에 4종류의 PAHs인 Naphthalene, Phenanthrene, Pylene, Benzopyrene를 각각 50ppm의 농도로 첨가하여 50일간 호기 배양하였다. MSM의 배지 조성은 4.0g NaNO3 (KNO3), 1.5g KH2PO4, 0.005g FeCl36H2O, 0.2g MgSO47H2O, 0.01g CaCl22H2O, 0.5g Na2HPO4 ; pH 7.2 (1L 기준)이다.
상기 배양에 의해 생육이 가능한 균주들을 Marine Broth(MB) agar배지에서 순수분리 하였다. MB 배지의 조성은 5.0 g Peptone, 1.0 g Yeast extract, 0.1 g C6H5FeO7 19.45 g NaCl, 5.9 g MgCl2, 3.24 g MgSO4, 1.8 g CaCl2, 0.55 g KCl, 0.16 g NaHCO3, 0.08 g KBr, 34.0 mg SrCl2, 22.0 mg H3BO3, 4.0 mg Na2(SiO2)nO, 2.4 mg NaF, 1.6mg NH4NO3 , 8.0 mg Na2HPO4 (1L 기준) 이다. 이후, 결정상의 인돌이 증기상으로 제공된 평판 배지에서 파란색 혹은 고동색을 나타내는 균주를 스크리닝 하고, 이후 평판배지에서 보다 진하게 파란색 혹은 고동색을 나타내는 균주를 2차 스크리닝 하였다. 이후 인돌을 2mM 농도로 첨가한 액체배양에서 파란색을 진하게 나타내는 균주들을 최종적으로 선별하였다.
2) 16s rDNA 서열에 따른 미생물 계통 발생 분석
16s rDNA 서열에 따라 인디고 생산균주를 계통발생학적으로 분류, 동정하였다.
계통수에 포함된 균주는 PAHs를 분해한다고 알려진 세균들이다.
3) 인디고 생산 균주의 배양조건 최적화
분리된 세균의 콜로니를 Zobell 배지에서 20시간 종 배양하였고, 자외선/가시광선 분광기(Spectrophotometer, V630-Bio UV-Vis Spectrophotometer)를 이용하여 최초 Optical density(OD) 600nm 값이 0.1이 되도록 본 배양에 접종하였다. Zobell 배지의 조성은 0.5% Peptone, 0.1% Yeast extract, 10mg/L FeSO4·4H2O, 750ml 해양심층수, 250ml 증류수이다. 본 배양은 배지의 종류 및 인돌의 농도, aeration 조건 변화에 따라 최적의 배양 조건을 찾았다. 최종적으로 2.5mM 농도의 인돌을 첨가한 NY 배지에서 25, 180rpm의 조건에서 aeration 공급이 원활하도록 baffled flask를 사용하여 배양하였다.
4) 인디고 생산 능력의 확인
인디고 생산 능력은 배양액을 10ml 채취하여 10,000rpm 15분간 원심분리한 후, 파란색의 침전물을 얻은 뒤, 멸균된 3차 증류수를 동일한 볼륨으로 washing 하여 10,000rpm 15분간 다시 원심분리한다. 파란색의 침전물을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 녹지 않는 균체-인디고 덩어리들은 sonication 한다. 이후 균체만을 제거하기 위해 10,000rpm 15분간 원심분리한 후 상등액을 자외선/가시광선 분광기를 사용하여 620nm 값을 측정하였다. DMSO에 녹인 합성인디고를 표준농도 그래프로 이용하여 인디고량을 정량하였다.
실시예 2: 결과
1) 인디고 생산 미생물 선별
갯벌에서 분리한 PAHs를 분해하는 세균들 중 인돌을 공기중으로 공급한 고체배지에서 진한 파란색을 나타내는 균주들을 선별하고, 이후 인돌이 첨가된 액체배양에서 파란색을 진하게 나타내는 균주들 중에서 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6만이 진한 청색을 나타내었다.
2) 16s rDNA 유전자를 근거로 한 분리된 세균의 동정
2종의 분리된 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6에 대한 계통발생학적 관계를 분석하였다. 그 결과, 도 2와 같이 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6은 모두 셀레리박터 종(Celeribacter sp. NH195)과 99%의 높은 유전적 유사도를 나타내었다.
3) 분리된 세균 셀레리박터 속( Celeribacter sp .) TSPH2 TSPH6에 의한 배양 조건 최적화
분리된 15-PH-2 균주의 인디고 생산 능력을 확인하기 위해 배지는 Zobell, NY, N3Y (0.5% Yeast extract, 3% NaCl)의 3종류에서 배양하였을 때, NY 및 N3Y에서 생육 및 인디고 형성이 우수하였다(도 3). 또한, 기질인 인돌의 농도는 2.5 mM에서 생육의 저해 없이 최대의 인디고를 생산하였다(도 4). 마지막으로 Aeration 공급이 향상된 조건에서 보다 진한 청색을 나타내었다(도 5).
4) 상기 균주에 의한 인디고 생산 능력의 확인
2.5mM이 포함된 NY 배지에서 호기적 조건으로 배양한 결과 13 mg/L의 인디고를 생산함을 확인하였다(도 6).
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11874
수탁일자 : 20160726
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11875
수탁일자 : 20160726

Claims (9)

  1. 인디고를 생산하는 능력을 가지는 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 균주(KCCM11874P).
  2. 인디고를 생산하는 능력을 가지는 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2(KCCM11874P) 균주 또는 TSPH6(KCCM11875P) 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 인디고 제조용 미생물 제제.
  3. 제1항에 따른 셀러리박터 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는 인디고 생산 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양단계에서 사용되는 배지는 Peptone, Yeast extract, FeSO4H2O, 해양심층수, 및 증류수로 이루어진 Zobell 배지, 또는 Yeast extract, 및 NaCl로 이루어진 NY 배지인 것인, 인디고 생산 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 배양단계에서 인돌을 기질로 공급하는 것인, 인디고 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인돌은 1mM 내지 5mM인 것인, 인디고 생산 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 배양은 호기 배양인 것인, 인디고 생산 방법.
  8. 인디고를 생산하는 능력을 가지는 셀레리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH6 균주(KCCM11875P).
  9. 제8항에 따른 셀러리박터 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는 인디고 생산 방법.
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