KR102027427B1 - 무알칼리 무환원제 인디고 염색용 조성물 및 염색방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연염료인 인디고(indigo)를 생산하는 균주를 이용한 인디고 염색용 조성물 또는 염색방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 알칼리제 및 환원제의 사용 없이 피염물, 예를 들면 식물성 섬유를 인디고 염색할 수 있는 염색용 조성물 또는 염색방법을 제공하는 것이다.

Description

무알칼리 무환원제 인디고 염색용 조성물 및 염색방법{Composition and Method for dyeing indigo without alkali and reducing agent}

본 발명은 천연염료인 인디고(indigo)를 생산하는 균주를 이용한 인디고 염색용 조성물 및 염색방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알칼리제 및 환원제의 사용 없이 피염물, 예를 들면 식물성 섬유를 인디고 염색할 수 있는 염색용 조성물 및 염색방법을 제공하는 것이다.

인디고(Indigo)는 가장 광범위하게 사용되어온 청색 염료 가운데 하나로 전통적으로는 폴리고넘 틱토리움 (Polygonum tinctorium), 인디고페라 틱토르(Indigofera tinctor) 및 이사티스 인디고티카(Isatis indigotica) 등의 식물에서 추출하여 사용하였으나, 식물에서 생산되는 인디고는 대량 생산이 어렵고, 추출에 어려움이 있어 주로 화학적인 방법에 의해 대량생산되어 왔다.

하지만, 화학적인 방법으로 인디고를 생산하는 경우 인디고를 생산하는 과정에서 난분해성 환경오염물질을 발생시키고, 인디고 합성 과정에서 고에너지가 요구되는 문제점이 존재한다.

염료란, 실이나 천, 옷감 등을 물들이는 색소이며, 기원전 2000년경부터 인디고 염료에 의한 염색이 행해졌다고 알려져 있다. 우리나라에서는 전통적으로 쪽이라는 이름의 식물을 재배하고 이를 염색에 이용하는 천연염색이 행해지고 있다. 전통적인 쪽 염색은 크게 쪽의 생즙을 내어서 하는 생쪽염색법과 쪽물을 추출하여 잿물을 가한 뒤 발효하는 발효염색법으로 나뉜다.

생쪽염색법은 쪽을 재배한 직 후 쪽잎을 분쇄하여 차가운 물에 추출한 후, 바로 직물을 담가 염색하는 방법으로, 간단하고 견직물 염색에 적합하지만, 견뢰도가 낮고 마, 면 등의 식물성 섬유에는 염색이 되지 않는다. 또한, 생쪽을 구하는 시기가 제한적이라 사용도가 낮다.

발효염색법의 경우, 발효과정을 이용하여 염색하는 방법으로, 3월 파종한 후 꽃이 피기 전인 7~8월경 크기가 1m 정도 자란 쪽을 수확한 후, 1~2일 물에 담가 색소를 추출한 푸른색의 쪽물에 석회가루를 첨가하여 인디고 색소를 석회가루와 염착시킨 후, 침전물을 얻는다. 이 침전물을 니람으로 부르며, 니람에 잿물을 첨가하여 일정시간 발효시킨다. 발효 후, 푸른색의 불용성 인디고가 염색이 가능한 환원된 형태의 루코 인디고로 전환되면 비로소 염색이 가능한 염액이 된다. 피염물을 염액에 담근 후 꺼내어 공기 중에서 산화 건조시키면 피염물에 염료가 염착된다. 니람 형태를 이용하는 발효염색법은 염료를 오랜 기간 보관할 수 있는 장점이 있지만, 발효과정이 까다롭고 고도의 숙련된 기술이 요구된다.

근래에는 시판되는 분말화 된 천연 쪽 염료를 이용하여 보다 손쉽게 인디고 염색을 수행할 수 있다. 또한, 인디고의 환원을 위해 기존의 전통발효법에서 쓰이는 잿물 대신 가성소다(NaOH) 혹은 탄산칼슘을 이용하고, 단시간에 염색이 가능한 환원 상태를 만들기 위해 차아황산나트륨(Sodium hydrosulfite, sodium dithionite, Na₂S₂O₄)과 같은 화학 환원제를 첨가하여 염색하고 있다. 강한 환원력을 가진 차아황산나트륨은 최종적으로 황산나트륨 (Na₂SO₄), 황산이온 (SO₃ ^2-) 및 티오황산염 (S₂O₃ ^2-)과 같은 독성 화합물로 산화되며, 잔존 아질산 이온은 강한 환원력으로 인해 호기성 시스템을 손상시켜 폐수 처리에 문제를 일으킨다. 이에 많은 연구자들은 여러 가지 친환경적인 환원법으로 환원 미생물의 발효에 의한 환원, 전기 화학적인 환원, catalytic hydrogenation에 의한 환원법이 이 알려져 있으나 경제성이 낮아 상용되지 못하고 있다.

이에, 알칼리제 및 환원제를 사용하지 않아 친환경적이고, 생쪽염색법에서 염색되지 않는 식물성 섬유도 염색 가능하며, 간편하게 수행할 수 있는 인디고 염색 방법의 개발이 필요한 상황이다.

이상과 같은 문제점을 해소하기 위해, 본 발명자들은 알칼리뿐만 아니라 환원제 등의 첨가물을 일체 사용하지 않아 인체와 환경에 안전하며, 미생물 배양 시 섬유를 함께 넣어 두기만 하면 염색이 되어 추가 비용이 발생하지 않는 인디고 염색방법을 발명하였다.

본 발명에 따른 인디고 염색용 조성물은, 인디고 생산 활성을 가지는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상, 인돌 및 트립토판으로 이루어지는 군에 선택된 1종 이상의 인디고 생산 기질 및 피염물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 인디고 생산 활성을 가지는 균주는,

1) 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 (기탁번호:KCCM11874P), 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH6 (기탁번호:KCCM11875P), 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 (기탁번호:KCCM12037P), 양기아 속(Yangia sp.) TSPY52 (기탁번호:KCCM12028P), 양기아 속(Yangia sp.) TSMI03 (기탁번호:KCCM12036P), 양기아 속(Yangia sp.) YSBP01 (기탁번호: KCCM12029P), 아조커스 속(Azoarcus sp.) TSNA42 (기탁번호:KCCM11872P), 및 아조커스 속(Azoarcus sp.)TSPY31 (기탁번호:KCCM11873P), 및

2) 상기 1)의 균주에서 유래된 인디고 생산 효소 또는 상기 인디고 생산 효소의 변이 효소를 암호화하는 유전자를 재조합한 재조합 균주

로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 인디고 염색용 조성물은, 알칼리제 및 환원제를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 인디고 염색용 조성물은, 피염물로서 인견섬유, 매쉬, 자가드, 실크, 울, 아크릴, 폴리, 나일론, 마, 면, 아세테이트 섬유로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것을 염색하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 인디고 염색용 조성물이 포함하는 인디고 생산 활성을 가지는 균주는, 인디고 생산 기질을 포함하는 배지에서 피염물과 함께 배양되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 인디고 염색용 조성물이 포함하는 인디고 생산 활성을 가지는 균주는, 서열번호 4 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 생산할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명에서 인디고 생산 활성을 가지는 균주가 생산하는 인디고 생산 효소는, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 인디고 생산 활성을 가지는 균주가 포함하는 인디고 생산 효소를 암호화하는 유전자는, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 피염물의 인디고 염색 방법은, 인돌 및 트립토판으로 이루어지는 군에 선택된 1종 이상의 인디고 생산 기질을 함유하는 배지에서, 인디고 생산 활성을 가지는 균주를 피염물과 함께 배양하여, 상기 피염물을 인디고 염색하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 피염물의 인디고 염색 방법에서, 피염물은 식물성 섬유인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 피염물의 인디고 염색 방법에서, 인디고 생산 활성을 가지는 균주를 피염물과 함께 배양하는 시간은, 24 내지 72시간인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 피염물의 인디고 염색 방법은, 알칼리제 및 환원제를 사용하지 않는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일예는, 알칼리, 환원제 등의 첨가물을 일체 사용하지 않아, 인체에 안전하고 환경 친화적인, 인디고 염색 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또다른 일 예는, 알칼리 및 환원제 등의 첨가물을 사용하지 않아, 인체에 안전하고 환경 친화적인, 인디고 염색 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명에 따른 염색 조성물은 인디고를 생산하는 능력을 가지는 균주를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 인디고 활성 능력을 가지는 균주, 및 상기 균주의 배양액을 포함하는, 염색용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 인디고 활성 능력을 가지는 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 염색용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물에서, 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량% 로 포함될 수 있다. 또는, 0.001 중량% 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명에서 인디고 활성 능력을 가지는 균주는, 인디고를 생산할 수 있는 균주를 모두 포함하는 것으로, 예를 들면 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 (기탁번호:KCCM11874P), 셀러리박터 속 TSPH6 (기탁번호:KCCM11875P), 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 (기탁번호:KCCM12037P), 양기아 속 TSPY52 (기탁번호:KCCM12028P), 양기아 속 TSMI03 (기탁번호:KCCM12036P), 양기아 속 YSBP01 (기탁번호: KCCM12029P), 아조커스 속(Azoarcus sp.) TSNA42 (기탁번호:KCCM11872P), 및 아조커스 속 TSPY31 (기탁번호:KCCM11873P)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

또는, 본 발명에서 인디고 활성 능력을 가지는 균주는, 상기 미생물들이 포함하고 있는 인디고 생산 효소를 암호화하는 유전자를 재조합한 재조합 균주일 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물들이 포함하고 있는 인디고 생산 야생 효소(서열번호 4)를 암호화하는 유전자를 재조합한 재조합 균주일 수 있다. 또는, 본 발명에서 인디고 활성 능력을 가지는 균주는, 상기 미생물들이 포함하고 있는 인디고 생산 효소의 변이효소를 암호화하는 유전자를 재조합한 재조합 균주일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FMO*4, 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FMO*12로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

구체적으로, 상기 변이 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질일 수 있다. 본 발명에서 셀러리박터 속 TSPH2 유래의 FMO의 서열번호 1을 가지는 변이 단백질은 기존의 셀러리박터 속 TSPH2 유래의 FMO(예컨대, 서열번호 4)의 424번 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환되어 있는 것이다(T424A).

구체적으로, 상기 유전자는, 셀러리박터 속 TSPH2 유래의 FMO 변이 효소의 암호화 핵산 분자에 관한 것으로서, 예를 들면 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자이며, 구체적으로 424번 아미노산을 지정하는 뉴클레오타이드 서열이 GCT, GCC, GCA, 또는 GCG일 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 FMO 변이 효소의 암호화 유전자일 수 있다. 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열은 T424A을 포함하는 변이 효소의 암호화 유전자, 예를 들면 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열에 더하여 3'말단 쪽의 제한효소 PstI의 제한효소 인식부위 이후 T-vector의 일부인 34bp가 포함된 핵산 분자이다.

셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 및 TSPH6 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 7월 26일자로 각각 KCCM11874P 및 KCCM11875P 로 기탁하였다(대한민국 특허공개공보 제10-2018-0014637호).

아조커스 속(Azoarcus sp.) TSNA42와 TSPY31 균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 7월 26일자로 각각 KCCM11872P 및 KCCM11873P 로 기탁하였다(대한민국 등록특허공보 제10-1818706호).

양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 및 YSBP01은 여수의 갯벌에서 분리된 PAHs를 각각 분해할 수 있는 세균이다. 또한, 양기아 속(Yangia sp.) TSPY52 및 TSMI03은 태안의 갯벌에서 분리된 PAHs를 분해할 수 있는 세균이다. 상기 양기아 속(Yangia sp.) 균주 YSPY11 및 TSMI03은 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 6월 15일자로 KCCM12037P 및 KCCM12036P로 각각 기탁하였으며, 양기아 속(Yangia sp.) 균주 TSPY52 및 YSBP01는 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 5월 23일자로 KCCM12028P와 KCCM12029P 로 각각 기탁하였다. 구체적인 양태에서 상기 YSPY11, TSPY52, TSMI03 및 YSBP01 균주는 각각 서열번호 8 내지 11의 16s rRNA 서열을 갖는다.

본 발명에서 야생형 FMO 효소는, 셀러리박터 속 TSPH2 (기탁번호: KCCM11874P) 또는 TSPH6 (기탁번호: KCCM11875P)에서 분리된 것이다. 상기 셀러리박터 속 균주는 트립토판 분해효소가 존재하지 않아서 인돌을 기질로 사용하여 인디고를 생산할 수 있지만, 재조합 대장균으로 사용한 균주에서는 대장균이 트립토판 분해효소(Tryptophanase)를 가지고 있어서 트립토판을 분해하여 인돌을 만들고 상기 인돌은 상기 FMO 효소에 의해서 인독실로 변환되어 인디고가 합성된다.

상기 유전자는 그 자체로, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 목적한 유전자 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 상기 유전자 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 적정 핵산 서열은 전사 및 번역 종결인자(terminator), 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터일 수 있다. 상기 벡터 시스템은 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다

예를 들어, 셀러리박터 속 TSPH2 균주 유래의 FMO 변이 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.

상기 재조합 벡터에 삽입되는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자로서, 예를 들면 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 상기 셀러리박터 속 TSPH2 유래의 FMO 변이 단백질을 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자와 상기 유전자 부분의 말단에 다른 벡터의 서열 일부가 추가로 삽입된 구성일 수 있다. 상기 다른 벡터는 T-vector일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 재조합 벡터에 삽입되는 유전자의 돌연변이는 당 업계에 공지된 다양한 방법을 통해 도입될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당 업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 벡터를 안정적이며 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 형질전환 대상 미생물로는 활성형의 상기 효소를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 세포는 예를 들면 대장균(E. coli) 또는 효모일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110 등의 다양한 대장균을 이용할 수 있다.

본 발명에서 재조합 세포 또는 재조합 균주는 FMO 변이 효소를 발현하며, 인돌 또는 트립토판을 기질로 하여 인디고를 생산하며, 예를 들면 2mM 농도의 인돌을 첨가한 NY 배지에서 30˚C에서 24시간 배양하여 얻어진 인디고 생산량이 100 내지 200 mg/L을 생산할 수 있어, 인디고 생산능이 야생형 균주 및 야생형 효소의 재조합 균주에 비해 증가된 특성을 갖는다.

본 발명에서 변이 효소를 발현하는 재조합 세포는 야생형 효소를 발현하는 재조합 세포의 인디고 생산량(mg/L) 100%를 기준으로, 100 내지 400%, 바람직하게는 150 내지 400%, 더욱 바람직하게는 200 내지 400% 인디고 생산량을 갖는 것으로서 증가된 인디고 생산량을 갖는다.

본 발명에서 재조합 세포는 저온 조건 (예, 25˚C)에서 인디고 생산량이 거의 없던 야생형 FMO 효소를 발현하는 재조합 세포에 비해, 변이형 FMO 효소를 발현하는 재조합 세포는 상기 저온 조건에서 인디고를 생산할 수 있다. 상기 저온 조건은 20˚C 내지 28˚C, 바람직하게는 23 내지 27˚C일 수 있다.

본 발명에서 변이 효소를 발현하는 재조합 세포는 고온 조건, 예를 들면 28 내지 40˚C, 바람직하게는 29 내지 38˚C, 또는 30 내지 37˚C, 예를 들면 30˚C 또는 37˚C에서, 야생형 효소를 발현하는 재조합 세포의 인디고 생산량(mg/L) 100%를 기준으로, 100 내지 800%, 100 내지 750%, 100 내지 650%, 200 내지 800%, 200 내지 750%, 또는 200 내지 650%의 인디고 생산량을 갖는 것으로서 증가된 인디고 생산량을 갖는다.

본 발명에서 변이 효소를 발현하는 재조합 세포는 접종 후 20시간 내지 60시간, 바람직하게는 24 내지 48시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 변이 효소를 발현하는 재조합 세포는 인돌 또는 트립토판을 함유하는 배지에서 배양함으로써 인디고를 생산할 수 있으며, 배지 내에 존재하는 트립토판에서 유리한 인돌 혹은 배지 내 인돌을 인독실로 전환시킴으로써 인디고를 제조할 수 있다. 트립토판은 E. coli의 트립토판 분해효소(Tryptophanase)에 의해 인돌로 분해되고 인돌은 FMO에 의해 인독실로 산화된 후, 자연적인 산화반응에 의해 인디고가 생성된다. 상기 배양은 당 업계에 공지된 배지에서 이루어질 수 있다.

상기 배지는 NaCl 0.5 내지 1.5%(w/v) 및 효모 추출물(Yeast extract) 0.2 내지 0.8%(w/v)를 포함할 수 있다. 상기 배지에 포함된 트립토판 농도는 배지 조성물 100중량%를 기준으로 0.1 내지 1.0%(w/v), 또는 0.1 내지 0.4%(w/v)일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 인디고 활성 능력을 가지는 균주의 배양액을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 염화나트륨(NaCl), 인돌, 트립토판, 및 효모추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 염화나트륨은 0.1 내지 5, 0.1 내지 4, 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 1.5, 0.1 내지 1, 0.5 내지 5, 0.5 내지 4, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2, 0.5 내지 1.5, 0.5 내지 1.0, 0.5 내지 0.8, 0.8 내지 1.5, 1.0 내지 1.5, 1.2 내지 1.5, 또는 0.8 내지 1.0%(w/v)로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 염화나트륨은 0.5 내지 1.5%(w/v)로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 염화나트륨은 0.8 내지 1.2%(w/v)로 포함될 수 있다.

예를 들어, 상기 인돌은, 0.1 내지 3, 0.1 내지 2.5, 0.1 내지 2.0, 0.1 내지 1.5, 0.1 내지 1.2, 0.1 내지 1.0, 0.2 내지 3, 0.2 내지 2.5, 0.2 내지 2.0, 0.2 내지 1.5, 0.2 내지 1.2, 0.2 내지 1.0, 0.5 내지 3, 0.5 내지 2.5, 0.5 내지 2.0, 0.5 내지 1.5, 0.5 내지 1.0, 0.8 내지 3, 0.8 내지 2.5, 0.8 내지 2.0, 0.8 내지 1.5, 0.8 내지 1.2, 0.8 내지 1.0, 1 내지 3, 1 내지 2.5, 1 내지 2, 1 내지 1.5, 1.5 내지 3, 1.5 내지 2.5, 1.5 내지 2, 2 내지 3, 또는 2 내지 2.5 mM 로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 인돌은 0.1 내지 3 mM로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 인돌은 1.5 내지 2.5 mM로 포함될 수 있다.

예를 들어, 상기 트립토판은 0.1 내지 2.5, 0.1 내지 2.0, 0.1 내지 1.5, 0.1 내지 1.2, 0.1 내지 1.0, 0.1 내지 0.8, 0.1 내지 0.6, 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 0.4, 0.2 내지 2.5, 0.2 내지 2.0, 0.2 내지 1.5, 0.2 내지 1.2, 0.2 내지 1.0, 0.2 내지 0.8, 0.2 내지 0.6, 0.2 내지 0.5, 0.2 내지 0.4, 0.5 내지 2.0, 0.5 내지 1.5, 0.5 내지 1.0, 0.5 내지 0.8, 0.5 내지 0.6, 0.8 내지 2.0, 0.8 내지 1.5, 0.8 내지 1.2, 또는 0.8 내지 1.0%(w/v)로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 트립토판은 0.1 내지 1.0%(w/v)로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 트립토판은 0.1 내지 0.4%(w/v)로 포함될 수 있다.

예를 들어, 상기 효모추출물은 0.01 내지 3, 0.01 내지 2, 0.01 내지 1.5, 0.01 내지 1, 0.01 내지 0.8, 0.01 내지 0.5, 0.1 내지 3, 0.1 내지 2, 0.1 내지 1.5, 0.1 내지 1, 0.1 내지 0.8, 0.1 내지 0.5, 0.2 내지 1.2, 0.2 내지 1.0, 0.2 내지 0.8, 0.2 내지 0.6, 0.3 내지 1.2, 0.3 내지 1.0, 0.5 내지 1.5, 또는 0.5 내지 1.0 %(w/v)로 포함될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 효모추출물은 0.1 내지 1.0%(w/v)로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 효모추출물은 0.4 내지 0.6%(w/v)로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 pH는, 염색 목적을 달성하기에 적절한 범위로 선택될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 조성물의 pH는, 1 내지 14, 2 내지 12, 4 내지 10, 6 내지 8, 또는 6.5 내지 7.5일 수 있다. 보다 바람직하게는, 6 내지 8일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 6.5 내지 7.5일 수 있다.

상기 조성물의 유효성분인 인디고 활성 능력을 가지는 균주의 균체, 상기 균주 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량% 내지 100 중량%, 0.001 중량% 내지 99.9 중량 %, 0.1 중량% 내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량% 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

상기 인디고 활성 능력을 가지는 균주는 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 인디고 활성 능력을 가지는 균주를 파쇄한 파쇄물을 의미하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 인디고 활성 능력을 가지는 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명에서 염색되는 대상인 피염물은, 동물성 섬유 및 식물성 섬유 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들면, 상기 피염물은 인견섬유, 매쉬, 자가드, 실크, 울, 아크릴, 폴리, 나일론, 마, 면, 아세테이트 섬유 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특히, 본 발명에 따른 염색 조성물은, 생쪽염색방법으로 기존에는 염색이 불가능했던 마, 면 등의 식물성 섬유도 염색 가능한 효과가 존재한다.

본 발명에 따른 염색 조성물은, 피염물과 함께 보관하는 것만으로 피염물이 염색되어, 간편하게 염색을 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 피염물을 상기 염색 조성물에 상온에서 6 내지 72시간, 12 내지 72시간, 18 내지 72시간, 24 내지 72시간, 24내지 60시간, 24 내지 48시간, 또는 24 내지 36시간 담가두어 염색을 할 수 있다.

본 발명에 따른 염색 조성물은, 환원제 또는 알칼리제를 포함하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 염색 조성물은, 차아황산 나트륨(sodium hydrosulfite) 또는 수산화나트륨(NaOH)를 포함하지 않는 것일 수 있다. 보다 바람직하게, 차아황산 나트륨 및 수산화나트륨을 포함하지 않는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 염색 방법은, 본 발명에 따른 염색 조성물을 이용해서 피염물을 염색하는 방법일 수 있다. 본 발명에 따른 염색 조성물은 상기 기재한 바와 같다. 예를 들어, 본 발명에 따른 염색 조성물 및 피염물을 함께 보관하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 인디고 활성 능력을 가지는 균주, 상기 균주의 배양액, 및 피염물을 함께 보관하는 단계는, 상기 배양액에 상기 균주 및 상기 피염물을 함께 보관한 상태로 상기 균주를 배양하는 것을 뜻한다. 균주가 배양됨에 따라 피염물이 염색되어 간편하게 염색을 수행할 수 있다.

본 발명에서 인디고 활성 능력을 가지는 균주, 상기 균주의 배양액, 및 피염물을 함께 보관하는 단계는, 알칼리제 및 환원제를 첨가하지 않은 채로 수행될 수 있다. 알칼리제 및 환원제를 포함하지 않아, 본 발명에 따른 염색방법은 친환경적으로 피염물을 염색할 수 있는 효과가 존재한다.

본 발명에 따른 염색 방법은, 피염물과 함께 보관하는 것만으로 피염물이 염색되어, 간편하게 염색을 수행할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 염색 방법은, 기존에는 생쪽염색으로 염색이 불가능했던 마, 면 등의 식물성 섬유도 염색 가능한 효과가 존재한다.

본 발명에서 인디고를 생산하는 능력을 가지는 균주가 피염물과 함께 보관 또는 배양되는 시간은, 염색 목적을 달성하기에 적절한 범위로 선택될 수 있다.

예를 들면, 상기 균주의 보관 또는 배양 시간은 6 내지 72시간, 12 내지 72시간, 18 내지 72시간, 24 내지 72시간, 24내지 60시간, 24 내지 48시간, 또는 24 내지 36시간일 수 있다. 바람직하게는, 12 내지 72시간일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 24 내지 72시간일 수 있다.

본 발명에서 인디고를 생산하는 능력을 가지는 균주가 피염물과 함께 보관 또는 배양되는 온도는, 염색 목적을 달성하기에 적절한 범위로 선택될 수 있다.

예를 들면, 상기 보관 또는 배양 온도는, 10 내지 40, 10 내지 35, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 40, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 20 내지 40, 20 내지 35, 20 내지 30, 20 내지 25, 18 내지 40, 18 내지 38, 18 내지 36, 18 내지 34, 18 내지 32, 18 내지 30, 18 내지 28, 18 내지 26, 20 내지 40, 20 내지 38, 20 내지 36, 20 내지 35, 20 내지 30, 20 내지 25, 25 내지 40, 25 내지 38, 25 내지 35, 25 내지 32, 또는 25 내지 30℃일 수 있다. 보다 바람직하게, 20 내지 35℃일 수 있다. 더욱 바람직하게, 25 내지 30℃일 수 있다.

인디고를 생성할 수 있는 미생물을 배양할 때, 피염물을 함께 넣어 두는 것만으로 인디고 염색이 가능함을 알 수 있다. 이는 생쪽을 구할 수 있는 시기는 제한적인 전통적인 생쪽 염색법과 달리, 365일 미생물 배양이 가능하므로 시간 및 계절에 관계없이 언제든지 염색이 가능한 효과가 있다. 또한, 생쪽 염색은 식물성 섬유는 염색시키지 못하는 단점이 있으나, 본 발명은 실크(울)와 같은 동물성 섬유뿐만 아니라, 인견 등의 식물성 섬유 또한 염색할 수 있음을 확인하였다.

전통적인 발효염색법은 니람 형태로 염료를 보관할 수 있으나, 이를 환원하여 염색이 가능한 상태를 만드는데 고숙련 기술이 필요하거나, 혹은 단시간에 염색이 가능한 환원상태를 만들기 위해 화학 환원제를 사용하였다. 하지만 본 발명은 환원제뿐만 아니라 어떠한 첨가물도 사용하지 않고 단순히 인디고 생성 미생물의 배양과 함께 염색이 가능하여 안전하기 때문에, 차별성과 경제성을 가진다.

도 1은 T424A로 점 돌연변이된 변이 fmo 유전자가 삽입된 재조합 벡터의 제작 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 변이 효소의 일예로서 야생형 효소의 아미노산 서열에서 424위치의 트레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환되어 있음을 나타낸다.
도 3은 각 균주를 30˚C에서 24시간 배양한 결과 인디고 생산량을 보여주는 그래프이다. FMOori 균주보다 FMO*4, FMO*12 균주는 각각 57% 및 40%의 생산능이 향상되었다.
도 4는 인디고 활성 능력을 가지는 균주를 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진에 관한 것으로, 4a는 TSPH2 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진이고, 4b는 YSBP01 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타내는 사진이며, 4c는 TSPY31 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진이고, 4d는 FMO*12 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진이다.
도 5는 인디고 활성 능력을 가지는 균주와 함께 배양하여 인디고 염색된 피염색물을 나타낸 사진에 관한 것으로, 5a는 TSPH2 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 2종의 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이고, 5b는 YSBP01 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이며, 5c는 TSPY31 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이고, 5d는 재조합된 FMO*12 균주와 함께 24시간 배양하여 인디고 염색된 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이며, 5e는 재조합된 FMO*12 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이고, 5f는 염색하지 않은 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이다.
도 6은 FMO*12 균주와 함께 배양한, 실크(울), 아크릴, 폴리, 나일론, 면및아세테이트의 섬유샘플 6종을 나타낸 사진이다.
도 7a는 FMO*4 균주 배양액에 면 손수건을 함께 배양한 후 60시간이 경과한 배양액의 모습을 나타낸 사진이다.
도 7b는 FMO*4 균주 배양과 함께 염색된 면 손수건의 사진이다.
도 7c는 FMO*4 균주 배양과 함께 염색된 인견(민평) 스카프의 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 야생형 균주를 이용한 인디고 염색

1-1: 인디고를 생산하는 야생형 균주 선별

인디고 생산 미생물을 선발하기 위하여 2011년 5월 2일 여수의 갯벌과 2011년 5월 4일 태안의 갯벌에서 샘플을 채취하였다. 상기 채취한 갯벌 시료 10mg은 Mineral Salt Medium(MSM) 10ml 에 4종류의 PAHs인 Naphthalene, phenanthrene, pylene, benzopyrene를 각각 50ppm의 농도로 첨가하여 50일간 호기 배양하였다. MSM의 배지 조성은 4.0g NaNO₃(KNO₃), 1.5g KH₂PO₄, 0.005g FeCl₃·6H₂O, 0.2g MgSO₄·7H₂O, 0.01g CaCl₂·2H₂O, 0.5g Na₂HPO₄; pH 7.2 (1L 기준)이다.

상기 배양에 의해 생육이 가능한 균주들을 Marine Broth(MB) agar배지에서 순수분리 하였다. 이후, 결정상의 인돌이 증기상으로 제공된 평판 배지에서 파란색 혹은 고동색을 나타내는 균주를 스크리닝 하고, 이후 평판배지에서 보다 진하게 파란색 혹은 고동색을 나타내는 균주를 2차 스크리닝 하였다. 이후 인돌을 2mM 농도로 첨가한 액체배양에서 파란색을 진하게 나타내는 균주들을 최종적으로 선별하였다. 각 균주들의 16s rRNA 서열을 분석하였다. 이 서열을 바탕으로 인디고 생산균주를 계통발생학적으로 분류, 동정하였다.

갯벌에서 분리한 PAHs를 분해하는 세균들 중 인돌을 공기중으로 공급한 고체배지에서 파란색 혹은 고동색을 진하게 나타내는 균주들을 선별하고, 이후 인돌이 첨가된 액체배양에서 파란색을 나타내는 균주들 중에서 셀러리박터 속(Celeribacter sp.) TSPH2 (기탁번호:KCCM11874P), 셀러리박터 속 TSPH6 (기탁번호:KCCM11875P), 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 (기탁번호:KCCM12037P), 양기아 속 TSPY52 (기탁번호:KCCM12028P), 양기아 속 TSMI03 (기탁번호:KCCM12036P), 양기아 속 YSBP01 (기탁번호:KCCM12029P), 아조커스 속(Azoarcus sp.) TSNA42 (기탁번호:KCCM11872P), 아조커스 속 TSPY31 (기탁번호:KCCM11873P)이 진한 청색을 나타내었다.

1-2: 야생형 균주를 이용한 인디고 염색

상기 실시예 1-1에서 얻어진 인디고 능력이 있는 Celeribacter sp. TSPH2, Azoarcus sp. TSPY31, Yangia sp. YSBP01 3종의 균주를 배양하면서 인견섬유 샘플의 염색 여부를 확인하였다.

종 배양으로 TSPH2, YSBP01 균주는 Zobell 배지에서 하룻밤 동안 배양하였고, TSPY31 균주는 NaCl 1%, Yeast extract 0.5% 배지에서 40시간 배양하였다.

세 균주의 인디고 능력을 확인하기 위해, NaCl 1%, Yeast extract 0.1% 배지에 각각 1.5mM(YSBP01), 2mM(TSPH2, TSPY31)의 인돌을 첨가하였다. 각 배지에 종 배양액 10%(10ml)를 접종한 뒤, 멸균된 3X3cm 크기의 2종의 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 함께 첨가하여 48시간 배양한 후 섬유의 염색정도를 확인하였다. 알칼리제 및 환원제를 첨가하지 않고 배양을 하였다.

도 4는 인디고 활성 능력을 가지는 균주를 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진에 관한 것으로, 4a는 Celeribacter sp TSPH2 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진이고, 4b는 Yangia sp. YSBP01 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타내는 사진이며, 4c는 Azoarcus sp. TSPY31 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진이다.

도 5는 인디고 활성 능력을 가지는 균주와 함께 배양하여 인디고 염색된 피염색물을 나타낸 사진에 관한 것으로, 5a는 TSPH2 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 2종의 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이고, 5b는 YSBP01 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이며, 5c는 TSPY31 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이고, 5f는 염색하지 않은 인견섬유샘플(매쉬, 자가드)을 나타낸 사진이다.

그 결과, 야생형 균주와 함께 배양함에 따라, 식물성 섬유인 인겸섬유샘플 2종(매쉬, 자가드) 모두 염색이 잘 된 것을 알 수 있었다. 또한, 환원제 및 알칼리제 없이도 염색이 잘 된 것을 확인할 수 있어, 환원제 및 알칼리제의 첨가 없이 친환경적인 염색이 가능한 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 야생형 효소를 가지는 재조합 균주(FMOori) 제작

셀러리박터 속 균주 유래의 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 (flavin containing monooxygenase, fmo) 유전자를 클로닝하여 E. coli에서 발현시키기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

셀러리박터 속 균주 유래의 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 (flavin containing monooxygenase, fmo) 유전자를 클로닝하기 위해서 공지된 phenol/chloroform법을 이용하여 셀러리박터 속 TSPH2 균주의 유전체 DNA를 추출하고, 상기 추출한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 하기 표 1에 기재된 프라이머 및 Pfu polymerase (바이오니아)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 변성(denaturation) 95˚C 5분/변성 95˚C 20초, 어닐링(annealing) 55˚C 30초, 신장(elongation) 72˚C 1분 30초 (30 cycle 반복)/신장 72˚C 5분 이었다.

명 명	서 열	서열번호
Cfmo-F(HindⅢ)	5' atgcaagcttaacacacgctcaaccaac 3'	6
Cfmo-R(PstⅠ)	5' atgcctgcagggacgcgaagatcggtta 3'	7

상기 증폭한 셀러리박터 속 균주 유래의 fmo 유전자 및 pBluescriptⅡKS(+) (Agilent Technologies) 각각에 대하여 HindⅢ 효소를 37˚C, 2~3hr 반응시키고, PstⅠ 효소를 37˚C, 2~3hr 반응시켰다. 상기 효소 반응 후, 벡터와 인서트의 몰 비율이 1:3이 되도록 섞은 후, T4 ligase(Promega)를 이용하여 ligation 한 후, E. coli DH5α로 형질전환하고100 ug/mL 앰피실린 (Ampicillin)이 포함된 LB (Luria-Bertani) 고체 배지에 40ul의 X-gal (20mg/ml)을 스프레딩(spreading) 한 뒤, 밤새 배양하여 blue 혹은 white colony 중에서 white colony 만을 선별하였다.

선별한 형질전환된 균주가 인디고를 생성하는지 확인하기 위해서, 선별한 형질전환된 균주 콜로니와 벡터만 형질전환된 균주 콜로니를 기질로써 0.2%(w/v) 트립토판을 첨가한 NY배지 (0.5% Yeast extract, 1% NaCl)에서 배양하여, 셀러리박터 속 (Celeribacter sp.) 유래의 플라빈 함유 모노옥시게네이즈 (flavin containing monooxygenase) 유전자 재조합 균주 배양액에서만 푸른색의 물질이 다량 생산된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. FMO 변이 효소를 가지는 재조합 균주의 제작

FMO 변이 효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작 방법은 도 1에 나타낸 것과 같다. 사용된 균주는 E. coli DH5a 이며 pBluescriptⅡKS(+) (3.0kb) 벡터가 이용되었다.

실시예 1에서 얻어진 셀러리박터 속 TSPH2 유래의 fmo 유전자(1344bp, 서열번호 5)를 포함한 1410bp의 insert를 Taq polymerase를 이용하여 PCR(TAKARA, ExTaq)하였다. 상기 PCR 증폭 방법은 상기 실시예 2와 동일한 프라이머쌍을 이용하였고, PCR 조건 또한 실시예 2와 동일하나 elongation 시간은 45초 수행하였다. 이후 pGEMTeasy(Promega) 벡터에 subcloning 하였다. HindⅢ와 PstⅠ 제한효소를 이용하여 insert를 절단하고 동일한 제한효소로 pBluescriptⅡKS(+)를 절단하여 연결하였다. E. coli DH5a로 형질전환하여 FMO 변이(FMO*4, FMO*12)가 포함된 재조합 벡터 및 재조합 균주를 제작하였다.

상기 인서트 사이즈가 확인된 clone의 정확한 서열을 확인하기 위해 (주)제노텍에 인서트 염기서열을 확인한 결과, 야생형 효소의 유전자 서열인 서열번호 5의 1344bp의 fmo 유전자 내 1270번 위치의 아데닌(a)이 구아닌(g)으로 치환된 FMO*4와 FMO*12를 확인하였다. 이를 통해 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 FMO 효소의 424 번째 트레오닌이 알라닌으로 치환되었다(T424A). 또한, FMO*12의 경우 종결코돈 이후 T-vector의 일부인 34bp가 삽입되었다. 이는 fmo의 발현에 있어 Terminator의 역할을 할 것으로 추정되며, 37˚C 온도에서 변이 FMO 효소가 안정적으로 발현되어 인디고 생산을 가능하게 할 것으로 추정된다.

FMOori 재조합 균주: E. coli DH5a/pBluescriptⅡKS(+)::fmo from Celeribacter sp. TSPH2 (실시예 2에 따른 야생형 효소를 발현하는 재조합 대장균 균주)

FMO*4 재조합 균주: E. coli DH5a/pBluescriptⅡKS(+)::fmo*(T424A) Celeribacter sp. TSPH2 (실시예 3에 따른 변이형 효소를 발현하는 재조합 대장균 균주)

FMO*12 재조합 균주: E. coli DH5a/pBluescriptⅡKS(+)::fmo*(T424A) Celeribacter sp. TSPH2 및 3'-말단 쪽 T-vector의 일부 34bp 추가 삽입(실시예 3에 따른 변이형 효소를 발현하는 재조합 대장균 균주)

실시예 4: 재조합 균주의 인디고 생산

4-1: 인디고 정량방법

균주 배양액 0.3 내지 1mL 채취하여 13,000rpm 5분간 원심분리하여 파란색의 침전물을 얻고, 멸균된 3차 증류수를 1mL 분주하여 세척한 뒤, 13,000rpm 5분간 다시 원심분리하였다. 파란색의 침전물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 녹지 않는 균체-인디고 덩어리들은 초음파를 조사하여 녹였다. 이후 균체를 제거하기 위해 13,000rpm, 20˚C, 10분간 원심분리한 후 순수하게 인디고만 녹은 상등액을 자외선/가시광선 분광기 (V630-Bio UV-Vis Spectrophotometer, JASCO)를 사용하여 620nm값을 측정하였다. 필요할 경우, DMSO를 이용하여 샘플을 희석하여 620nm 값을 측정하였고, 이후 희석배수를 곱해주었다. DMSO에 녹인 합성 인디고(Synthetic indigo, sigma-aldrich, 229296, 95%)를 표준농도 그래프로 이용하여 인디고를 정량하였다.

4-2: 재조합 균주의 플라스크 배양

종배양으로서, 실시예 2에서 얻은 FMOori 균주와, 실시예 3의 FMO*4 및 FMO*12 균주를, 50ml conical tube에 10ml의 LB(BD) 배지에 앰피실린 100ug/ml을 첨가한 후, single colony를 접종하여 37˚C 혹은 30˚C에서 Overnight(O/N) 배양하였다.

본 배양으로서, 125ml 삼각플라스크에 30ml의 배지를 분주하고, 상기 얻어진 종 배양액의 1%인 0.3ml을 접종하여 25˚C, 30˚*C, 37˚?에 각각 배양하였다. 트립토판을 첨가한 NY 배지에서 30˚C, 180rpm의 조건에서 aeration 공급이 원활하도록 baffled flask를 사용하여 24시간 동안 배양하였다. 상기 본 배양을 위한 배지 조성은 이스트 추출물(Yeast extract (ACCUMEDIA)) 0.5%(w/v), 염화나트륨(NaCl (삼전화학)) 1%(w/v), 트립토판(Tryptophan (대정화금)) 0.2%(w/v)을 포함하였다.

상기 3가지 균주의 배양물에서 정량한 인디고 생산량을 도 3에 나타냈다. 도 3은 각 균주를 30˚C에서 24시간 배양한 결과 얻어지는 인디고 생산량을 보여주는 그래프이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 재조합 균주의 인디고 생산량을 측정한 결과, 실시예 2의 FMOori 균주는 303.1(mg/L)이고, 실시예 3의 FMO*4 재조합 균주는 475.5 mg/L이고, 실시예 3의 FMO*12 재조합 균주는 425.7 mg/L이었다. 즉, 야생형 효소를 생산하는 FMOori 균주의 인디고 생산량(mg/L)을 100%로 기준을 설정했을 때, 변이 효소를 생산하는 FMO*4 및 FMO*12 균주가 각각 157% 및 140%의 인디고 생산능을 나타냈다.

실시예 5: 변이FMO효소를 생산하는 재조합 균주(FMO*12)를 이용한 인디고 염색

5-1: 재조합 균주(FMO*12)를 이용한 인디고 염색

실시예 3에서 제조한 FMO*12의 배양과 동시에 인견 섬유샘플이 염색되는지를 확인하였다. 종 배양으로 앰피실린(Sigma) 100ug/ml을 첨가한 LB 배지(BD)에 FMO*12균주의 single colony를 접종하여 Overnight(O/N) 배양하였다. 이후 본 배양으로 250ml 플라스크에 NaCl (삼전화학) 1%, Yeast extract (ACUMEDIA) 0.5%, Tryptophan (대정화금) 0.2%가 포함된 배지 100ml에 종배양액 1%(1ml)를 접종한 뒤, 멸균된 3X3cm의 2종의 인견섬유샘플을 함께 첨가하여 24시간, 48시간 배양한 후 꺼내어 섬유의 염색정도를 확인하였다. 배양과정에서 알칼리제 및 환원제를 첨가하지 않았다.

그 결과, 재조합 균주와 함께 배양함에 따라, 알칼리제, 환원제의 첨가 없이인견섬유샘플이 잘 염색된 것을 알 수 있었다.

도 4의 4d는 FMO*12 균주 배양액에 인견섬유샘플을 첨가하여 0, 24, 및 48시간 배양한 것을 나타낸 사진이며, 도 5의 5d는 FMO*12 균주와 함께 24시간 배양하여 인디고 염색된 2종의 인견섬유샘플을 나타낸 사진이고, 도 5의 5e는 FMO*12 균주와 함께 48시간 배양하여 인디고 염색된 2종의 인견섬유샘플을 나타낸 사진이며, 도 5의 5f는 염색하지 않은 인견섬유샘플을 나타낸 사진이다.

또한, 야생형 균주 배양액에 비해 FMO*12 균주 배양액의 인견섬유샘플의 염색 정도가 높은 것을 알 수 있었다. 예를 들어, 도 5의 5d에서 알 수 있듯이, FMO*12 균주는 24시간동안만 배양하여 염색했음에도 불구하고, 야생형 균주를 48시간 배양하여 염색한 인견섬유샘플보다 더 강하게 염색된 것을 확인할 수 있어, 염색 속도 및 강도에 있어서 야생형 균주보다 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있었다.

5-2: 재조합 균주(FMO*12)를 이용한 6종 섬유의 인디고 염색

FMO*12의 배양과 동시에 다양한 섬유 6종(실크, 아크릴, 폴리, 나일론, 면, 및 아세테이트 섬유)이 염색되는지를 확인하였다

섬유6종 샘플은 실크(울), 아크릴, 폴리, 나일론, 면, 및 아세테이트 섬유가 연결된 것으로 위와 동일한 FMO*12번 균주를 배양할 때 첨가하였으며, 위와 동일한 방법으로 배양한 뒤, 24시간째에 섬유를 꺼내어 염색정도를 확인하였다. 배양과정에서 알칼리제 및 환원제를 첨가하지 않았다.

도 6은 FMO*12 균주와 함께 배양한 섬유샘플 6종을 나타낸 사진이다.

그 결과, 도 6에서 알 수 있듯이, 재조합 균주에 의해 알칼리제 및 환원제의 첨가 없이 6종의 섬유가 모두 잘 염색된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 변이FMO효소를 생산하는 재조합 균주(FMO*4)를 이용한 인디고 염색

실시예 3에서 제조한 FMO*4를 배양하면서 삼각형 모양의 면 손수건(가로 길이 75cm X 수직 길이36cm)과 평행사변형 모양의 인견(민평) (가로 길이 80cm X 수직길이 35cm) 스카프가 염색되는지를 알아보았다.

종 배양으로 앰피실린 100ug/ml을 첨가한 LB 배지에 FMO^*4 균주의 single colony를 접종하여 O/N 배양하였다. 이후 본 배양으로 3L 플라스크에 NaCl 1%, Yeast extract 0.5%, Tryptophan 0.2%가 포함된 배지 1.5L에 종배양액 1%(15ml)를 접종한 뒤, 멸균하지 않고 깨끗이 씻어 말린 삼각형 모양의 손수건을 배양액에 담가 60시간 배양한 후 섬유의 염색정도를 확인하였다. 알칼리제 및 환원제를 첨가하지 않았다.

도 7a는 FMO*4 균주 배양액에 면 손수건을 함께 배양한 후 60시간이 경과한 모습을 나타낸 사진이다.

도 7b는 FMO*4 균주 배양과 함께 염색된 면 손수건의 사진이다.

도 7c는 FMO*4 균주 배양과 함께 염색된 인견(민평) 스카프의 사진이다.

그 결과, 재조합 균주에 의해 면 손수건 및 인견 스카프 모두 알칼리제 및 환원제의 첨가 없이 잘 염색된 것을 확인할 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12036P 20170615 한국미생물보존센터(국외) KCCM12037P 20170615 한국미생물보존센터(국외) KCCM12028P 20170523 한국미생물보존센터(국외) KCCM12029P 20170523

<110> Gyeongbuk Institute for Marine Bioindustry <120> Composition and Method for dyeing indigo without alkali and reducing agent <130> DPP20180801KR <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mutant flavin containing monooxygenase(FMO*) <400> 1 Met Thr Lys Arg Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Pro Ser Gly Leu Ala 1 5 10 15 Gln Leu Arg Ala Phe Gln Ser Ala Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ile Pro 20 25 30 Glu Val Val Cys Phe Glu Lys Gln Ser Asn Trp Gly Gly Leu Trp Asn 35 40 45 Tyr Thr Trp Arg Thr Gly Val Asp Glu Asn Gly Glu Pro Val His Gly 50 55 60 Ser Met Tyr Arg Tyr Leu Trp Ser Asn Gly Pro Lys Glu Gly Leu Glu 65 70 75 80 Phe Ala Asp Tyr Ser Phe Glu Glu His Phe Gly Lys Gln Ile Ala Ser 85 90 95 Tyr Pro Pro Arg Ala Val Leu Phe Asp Tyr Ile Glu Gly Arg Val Ile 100 105 110 Lys Ala Asp Val Arg Lys Trp Ile Arg Phe Ser Ser Val Ile Arg Trp 115 120 125 Val Glu Tyr Asp Ala Glu Lys Gly Asp Phe Glu Val Thr Val His Asp 130 135 140 Met Val 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<220> <223> Yangia sp. strain YSBP01 16S rRNA <400> 11 cccgtcagaa cgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcga gaccttcggg 60 tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg aatagtcccg 120 ggaaactggg tttaataccg tatacgccct tcgggggaaa gatttatcgg agaaggatcg 180 gcccgcgtta gattaggtag ttggtggggt aatggcctac caagcctacg atctatagct 240 ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300 cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc gcgtgagtga 360 tgaaggcctt agggtcgtaa agctctttcg ctggggaaga taatgactgt acccagtaaa 420 gaaaccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggtt agcgttgttc 480 ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggc ggattggaaa gttgggggtg aaatcccggg 540 gctcaacctc ggaactgcct ccaaaactcc cagtcttgag ttcgagagag gtgagtggaa 600 ctccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaagaa caccagtggc gaaggcggct 660 cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagtgtgggg agcaaacagg attagatacc 720 ctggtagtcc acaccgtaaa cgatgaatgc cagtcgtcgg caagcatgct tgtcggtgac 780 acacctaacg gattaagcat tccgcctggg 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Claims (11)

1. (i) 인디고 생산 기질로부터 인디고를 생산하는 인디고 생산용 조성물; (ii) 인돌 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 인디고 생산 기질; 및 (iii) 피염물을 포함하며, pH 6 내지 8 조건이며 알칼리제 및 환원제를 포함하지 않는 인디고 염색용 조성물로서,
   상기 (i) 인디고 생산용 조성물은
   서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 인디고 생산 효소; 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 인디고 생산 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 균주; 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 (기탁번호:KCCM12037P), 양기아 속 TSPY52 (기탁번호:KCCM12028P), 양기아 속 TSMI03 (기탁번호:KCCM12036P), 또는 양기아 속 YSBP01 (기탁번호:KCCM12029P)의 인디고 생산 활성을 가지는 균주; 상기 균주의 배양물; 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며,
   상기 피염물의 염색은 인디고 생산 기질로부터 인디고 생산용 조성물에 의한 인디고 생산과 함께 수행되는 것인, 인디고 염색용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 피염물은 인견섬유, 매쉬, 자가드, 실크, 울, 아크릴, 폴리, 나일론, 마, 면, 및 아세테이트 섬유로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 인디고 생산 활성을 가지는 균주는, 상기 인디고 생산 기질을 포함하는 배지에서 상기 피염물과 함께 배양되는 것인, 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 균주는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 효소를 생산할 수 있는 것인, 조성물.
   
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 인디고 생산 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것인, 조성물
   
9. 알칼리제 및 환원제를 포함하지 않으며 pH 6 내지 8 조건에서, 인돌 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 인디고 생산 기질을 인디고 생산용 조성물과 반응하여 인디고를 생산하는 단계, 및 상기 생산된 인디고로 피염물을 염색하는 단계를 포함하며,
   상기 인디고 생산용 조성물은
   서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 인디고 생산 효소,
   상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 인디고 생산 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 균주, 양기아 속(Yangia sp.) YSPY11 (기탁번호:KCCM12037P), 양기아 속 TSPY52 (기탁번호:KCCM12028P), 양기아 속 TSMI03 (기탁번호:KCCM12036P), 또는 양기아 속 YSBP01 (기탁번호:KCCM12029P)의 인디고 생산 활성을 가지는 균주, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이며,
   상기 인디고를 생산하는 단계와 염색하는 단계를 함께 수행하는 것인,
   피염물의 인디고 염색 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 피염물은 인견섬유, 매쉬, 자가드, 실크, 울, 아크릴, 폴리, 나일론, 마, 면, 및 아세테이트 섬유로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 인디고 생산 활성을 가지는 균주는 상기 인디고 생산 기질을 포함하는 배지에서 상기 피염물과 함께 배양되는 것이며, 상기 배양하는 시간은, 24 내지 72시간인 것인, 방법.

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