CN110669094B - 罗汉果新苷及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种罗汉果新苷及其制备方法，具体为:罗汉果新苷A(Neomogroside A)、罗汉果新苷B(Neomogroside B)，其化学结构为:
Figure DDA0002232469870000011
本发明能够用于降糖药物的制备。该方法具有简便、快速、纯度高、生产成本低等优点。

Description

罗汉果新苷及其制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物医药领域的技术，具体涉及一种罗汉果新苷A、罗汉果新苷B及其制备方法。
背景技术
罗汉果皂苷为罗汉果Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffery ex Lu etZ.Y.Zhang特有的四环三萜皂苷，具有显著的降血糖、降血脂、降血压活性；同时，罗汉果皂苷亦为天然甜味剂，具有安全性好、甜度高等优点，广泛应用于食品、饮料、药物之中。但迄今为止，已有的罗汉果皂苷均以β-罗汉果醇为苷元，尚未见以α-罗汉果醇为苷元的皂苷。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种罗汉果新苷及其制备方法，以罗汉果甜苷为原料，同时制备两种以α-罗汉果醇为苷元的高纯度罗汉果新苷，所得产物具有显著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的特点，能够应用于降糖等领域。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明涉及一类罗汉果新苷类化合物，即α-罗汉果醇为苷元的四环三萜皂苷，具体包括:罗汉果新苷A、罗汉果新苷B，其化学结构为:
Figure BDA0002232469850000011
本发明涉及上述罗汉果新苷类化合物的制备方法，以罗汉果甜苷为原料，经弯孢菌Curvularia lunata和总状毛霉Mucor racemosus组合发酵后制备得到，具体为:将市售罗汉果甜苷提取物经弯孢菌Curvularia lunata、总状毛霉Mucor racemosus组合发酵转化后，依次经萃取层析和HPLC制备分离，得到罗汉果新苷A和罗汉果新苷B精制品。
所述的弯孢菌取自市售真菌新月弯孢菌(Culvularia lunata)，微生物型培养物采集与基因库保藏编号MTCC5109；总状毛霉取自市售真菌总状毛霉(Mucor racemosus)，美国菌株保藏中心保藏编号ATCC42647。
所述的组合发酵，取弯孢菌Curvularia lunata和总状毛霉Mucor racemosus的质量比为1:3～3:1。
所述的发酵转化，取弯孢菌Curvularia lunata和总状毛霉Mucor racemosus的质量为甜苷质量的比例为1:10～3:10，发酵温度为25～30℃，发酵时间为3～5天。
所述的萃取，采用但不限于乙酸乙酯，乙酸乙酯与罗汉果甜苷质量的比例为1mL:8mg，萃取次数为2～3次。
所述的层析是指:将萃取物经硅胶柱层析，先用二氯甲烷洗脱除去杂质；继用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱后TLC法检测，合并主斑点Rf为0.3～0.6的流份，然后回收溶剂得罗汉果新苷粗品。
所述的层析，优选其硅胶粒径为200～300目，样品与硅胶的质量比为1:60～1:100。
所述的梯度洗脱，优选二氯甲烷与甲醇比例为1:0、9:1、17:3、4:1(v/v)，每个梯度洗脱4～6BV，流速1BV/h，0.25BV/流份。收集洗脱液后进行TLC检测，合并主斑点Rf0.3～0.6的流份，减压回收溶剂，得罗汉果新苷粗品。
所述的TLC法检测是指:将样品溶于甲醇，硅胶板上点样，以二氯甲烷-甲醇4:1(v/v)为展开剂，展开后吹干展开剂，以10％硫酸-乙醇为显色剂，加热显色进行检测。
所述的HPLC制备分离是指:采用乙腈-水(1:9～1:0，v/v)梯度洗脱，DAD检测，分别收集两个最大吸收波长为205nm的主峰，回收溶剂即得罗汉果新苷A、罗汉果新苷B精制品。
所述的HPLC制备分离，优选采用的色谱柱为C18柱(250*10mm，5μm)，流动相为乙腈-水，梯度洗脱30min(1:9～1:0，v/v)；流速为4.0mL/min。
本发明涉及上述罗汉果新苷类化合物的应用，将其用于制备降糖类药物，优选为制备抑制α-淀粉酶和/或α-葡萄糖苷酶活性的药物。
技术效果
本发明以罗汉果甜苷为原料，通过微生物转化，制备具有降糖作用的、结构新颖的罗汉果新苷；与现有其他领域技术相比，可以同时制备两种新化合物—罗汉果新苷A、罗汉果新苷B精制品，所得产品纯度超过95％。
附图说明
图1为罗汉果新苷A的13C-NMR图(C5D5N,150MHz)；
图2为罗汉果新苷B的13C-NMR图(C5D5N,150MHz)。
具体实施方式
实施例1
本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的:
1.罗汉果甜苷4g，1000mL水溶解，加入市售弯孢菌Curvularia lunata 100mg、总状毛霉Mucor racemosus 300mg，25℃孵育5天，加入500mL乙酸乙酯萃取2次，回收乙酸乙酯得罗汉果皂苷提取物(0.92g)。
2.取上述皂苷提取物进行硅胶柱层析(200～300目，55.2g)，先用二氯甲烷洗脱4BV，回收二氯甲烷，弃去洗脱物；继续用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(1:0、9:1、17:3、4:1，v/v)，每个梯度洗脱4BV，收集洗脱液(0.25BV/流份)。TLC法检测，合并主斑点Rf为0.3～0.6的流份，回收溶剂得罗汉果新苷粗品(148mg)。
3.将罗汉果新苷粗品进行HPLC分离(色谱柱:C18柱，250*10mm，5μm；流动相:乙腈-水，梯度洗脱30min，1:9～1:0，v/v；流速为4.0mL/min)。DAD检测，分别收集两个最大吸收波长为205nm的主峰，回收溶剂即得罗汉果新苷A精制品13mg(纯度95.9％，HPLC法)、罗汉果新苷B精制品21mg(纯度为96.7％，HPLC法)。
实施例2
本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的:
1.罗汉果甜苷4g，1000mL水溶解，加入弯孢菌Curvularia lunata 400mg、总状毛霉Mucor racemosus 400mg 28℃孵育4天，加入500mL乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯得皂苷提取物(1.1g)。
2.取上述皂苷提取物进行硅胶柱层析(200～300目，88g)，先用二氯甲烷洗脱5BV，回收二氯甲烷，弃去洗脱物；然后二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(1:0、9:1、17:3、4:1，v/v；每个梯度洗脱5BV)，收集洗脱液(0.25BV/流份)。TLC法检测，合并主斑点Rf为0.3～0.6的流份，回收溶剂得罗汉果新苷粗品(167mg)。
3.将罗汉果新苷粗品进行HPLC分离(色谱柱:C18柱，250*10mm，5μm；流动相:乙腈-水，梯度洗脱30min，1:9～1:0，v/v；流速为4.0mL/min)。DAD检测，分别收集两个最大吸收波长为205nm的主峰，回收溶剂即得罗汉果新苷A精制品17mg(纯度为95.6％，HPLC法)、罗汉果新苷B精制品24mg(纯度为96.2％，HPLC法)。
实施例3
本实施例是在以下实施条件和技术要求条件下实施的:
1.罗汉果甜苷4g，加入1000mL水溶解，加入弯孢菌Curvularia lunata 900mg、总状毛霉Mucor racemosus 300mg 30℃孵育3天，加入500mL乙酸乙酯萃取3次，回收乙酸乙酯得皂苷提取物(1.26g)。
2.取上述提取物进行硅胶柱层析(200～300目，126g)，用二氯甲烷洗脱6BV，回收二氯甲烷，弃去洗脱物；然后用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(1:0、9:1、17:3、4:1，v/v；每个梯度洗脱6BV)，收集洗脱液。TLC法检测，合并主斑点Rf为0.3～0.6的流份，回收溶剂即得罗汉果新苷粗品(180mg)。
3.将将罗汉果新苷粗品进行HPLC分离(色谱柱:C18柱，250*10mm，5μm；流动相:乙腈-水，梯度洗脱30min，1:9～1:0，v/v；流速为4.0mL/min)。DAD检测，分别收集两个最大吸收波长为205nm的主峰，回收溶剂即得罗汉果新苷A精制品13mg(纯度为95.3％，HPLC法)、罗汉果新苷B精制品19mg(纯度为96.0％，HPLC法)。
通过上述实施例制备得到的罗汉果新苷具有显著的具有显著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性，其活性优于阿卡波糖，具体检测过程如下:(1)α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定:以4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，反应体系为2mL 0.1M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中加入待测样品100μL(0.5mg/mL)，还原谷胱甘肽50μL(1mg/mL)，α-葡萄糖苷酶10μL(5.7U/mL)，摇匀后37℃温浴10min；然后加入37℃温浴好的底物PNPG 200μL(20mM)37℃水浴反应20min后，加入0.1M Na2CO3溶液10mL终止反应，在波长400nm处测定吸光度。按下式计算α-葡萄糖苷酶抑制剂活性:抑制率(％)＝A空白-(A样品-A背景)/A空白*100％。式中:A空白:不加样品反应后的吸收值；A样品:加入样品反应后的吸收值；A背景:只加样品的吸收值。(2)α-淀粉酶抑制剂活性测定反应体系为:待测样品200μL(0.2mg/mL，50％DMSO溶解)，淀粉天青1mL(用0.05M Tris-HCl缓冲液，含CaCl2 0.01M，配制成2mg/mL悬液，沸水浴煮沸5min即得)，PPA 100μL(2.3U/mL)，37℃水浴反应5min，加入2mL 50％冰醋酸终止反应，4℃条件下6000r/min离心5min，595nm处测定吸光度。按下式计算α-淀粉酶抑制活性:抑制率(％)＝Ac+-Ac-)-(As-Ab)/(Ac+-Ac-)*100％。式中:Ac+100％酶活性的吸收值(仅溶剂中加酶)；Ac-0％酶活性的吸收值(仅溶剂未加酶)；As待测样品的吸收值(待测样品加酶)；Ab空白的吸收值(待测样品未加酶)。具体结果见表1。
表1罗汉果新苷对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶抑制率(％)
Figure BDA0002232469850000041
与现有技术相比，本方法以市售罗汉果甜苷为原料，同时制备两种以α-罗汉果醇为苷元的高纯度罗汉果新苷，所得产物具有显著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的特点，能够应用于降糖等领域。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (1)

1.一类罗汉果新苷类化合物的制备方法，其特征在于，所述罗汉果新苷类化合物为罗汉果新苷A、罗汉果新苷B，其化学结构为:
Figure FDA0003189720290000011
所述的制备方法，以罗汉果甜苷为原料，通过将弯孢菌Curvularia lunata和总状毛霉Mucor racemosus组合发酵转化后，依次经萃取层析和HPLC制备分离，得到罗汉果新苷A和罗汉果新苷B精制品；
所述的组合发酵，弯孢菌Curvularia lunata和总状毛霉Mucorracemosus的质量比为1:3～3:1；
所述的发酵转化，弯孢菌Curvularia lunata和总状毛霉Mucorracemosus的质量与甜苷质量的比例为1:10～3:10，发酵温度为25～30℃，发酵时间为3～5天；
所述的萃取，采用乙酸乙酯，其用量与罗汉果甜苷质量比为1mL:8mg，萃取次数为2～3次；
所述的层析是指:将萃取物经硅胶柱层析，其硅胶粒径为200～300目，样品与硅胶的质量比为1:60～1:100，先用二氯甲烷洗脱除去杂质，继用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱后TLC法检测，合并主斑点Rf为0.3～0.6的流份，然后回收溶剂得罗汉果新苷粗品；
所述的梯度洗脱，采用二氯甲烷-甲醇体积比例为1:0、9:1、17:3、4:1，每个梯度洗脱4～6BV，流速1BV/h，0.25BV/流份；收集洗脱液后进行TLC检测，合并主斑点Rf0.3～0.6的流份，减压回收溶剂，得罗汉果新苷粗品；
所述的HPLC制备分离是指:采用乙腈-水体积比为1:9～1:0梯度洗脱，DAD检测，分别收集两个最大吸收波长为205nm的主峰，回收溶剂即得罗汉果新苷A、罗汉果新苷B精制品，采用的色谱柱为C18柱，250*10mm，5μm，流动相为乙腈-水，梯度洗脱30min，流速为4.0mL/min。
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