CN114213497B - 筋骨草中甾体类化合物及其提取方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种式(I)所示的化合物，还公开了从筋骨草中分离的6种化合物及其分离方法。式(I)所示的化合物对肺腺癌细胞株(A549)、胃癌细胞株、乳腺癌细胞株(MCF‑7)和宫颈癌细胞株(Hela)具有很强的抑制活性，可用于治疗肿瘤/癌症疾病的候选药物或先导药物。

Description

筋骨草中甾体类化合物及其提取方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及从筋骨草中分离获得的甾体类新化合物及其提取方法和在治疗肿瘤/癌症方面的用途。

背景技术

癌症已成为世界范围内最主要的致死性疾病，癌症可于任何年龄在各种器官及组织中发生。世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)2020年发布了全球最新癌症统计数据。该数据显示：2020年全球新发癌症病例1929万例，其中男性1006万例，女性923万例，2020年全球癌症死亡病例996万例，其中男性553万例，女性443万例。2020年我国新发癌症病例457万例，其中男性248万例，女性209万例，2020年我国癌症死亡300万例，其中男性182万例，女性118万例。2020年中国癌症新发病例前十的癌症分别是：肺癌82万，结直肠癌56万，胃癌48万，乳腺癌42万，肝癌41万，食管癌32万，甲状腺癌22万，胰腺癌12万，前列腺癌12万，宫颈癌11万。这十种癌症占新发癌症数的78％。

通过全球癌症患者新发病例和死亡数据比较，我国癌症新发人数和死亡人数远远超过世界其他国家。因此开发新的抗癌药物是亟待解决的难题。

然而，大部分癌症患者发觉病情时通常已是中期至晚期，临床治疗总体效果较差，尤其是多药耐药性的不断出现，使得癌症的治疗困难重重。虽然部分小分子抗癌化疗药、抗体药已经进入临床。然而大部分临床应用的抗癌的新药基本上都依赖进口，治疗费用高昂。我国自主研发的新抗癌药物甚少。因此，开发出活性高、副作用低的新型抗癌药物来满足临床的需求迫在眉睫。尤其是从传统中药中发现新的抗肿瘤候选化合物，是当今药物研发的主流。

唇形科植物筋骨草(Ajuga decumbens Thunb.)是一年生草本植物，分布于我国长江以南各省区，全草可供用药。我国南方民间将其用于治疗痈疽疗疮、火眼、乳痈、咽喉炎、肠胃炎、急性结膜炎、烫伤、狗咬伤、蛇咬伤以及外伤出血等症状(福建药物志.第一册：福州：福建人民出版社，1979.410)。发明人基于近年来开展的抗肿瘤小分子药物的研究，对福建省平潭岛生长的筋骨草进行了提取分离，以期从中发现具有抗肿瘤活性的新药候选化合物或先导化合物。

发明内容

本发明的目的是从传统中药中发现新的候选药物或先导化合物，发明人从福建平潭岛生长的筋骨草中分离获得了6个新结构的甾体类化合物，并研究了其体外抗肿瘤活性。结果表明该甾体类化合物对肿瘤具有较强的抑制活性。

本发明提供了从传统临床应用的中药材筋骨草中分离获得甾体类新化合物及该甾体化合物在治疗肿瘤/癌症方面的用途。

本发明提供一种式(I)所示的化合物：

其中，R选自

和/>

分别表示存在或不存在的单键和双键；/>

表示连接位点。应当理解，当/>

和/>

表示不存在时，其所连接的基团也不存在。

根据本发明的实施方案，R可以选自

根据本发明的实施方案，式(I)所示的化合物具有式(II)或式(III)所示的结构：

其中，R、

和/>

具有上文所述的定义。

具体地，所述式(I)化合物的结构如下A、B、C、D、E或F所示：

本发明还提供所述式(I)所示化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(1)将筋骨草粉碎，乙醇水溶液提取，提取液浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，用不与水混溶的有机溶剂萃取，萃取液浓缩得到有机溶剂浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的有机溶剂浸膏进行色谱分离得到粗组分；和

(4)将步骤(3)中所得的粗组分进行纯化，得到式(I)所示化合物。

根据本发明的实施方案中，步骤(1)中的乙醇水溶液中乙醇的质量分数可以为50-80％。

根据本发明的实施方案中，步骤(1)中的乙醇水溶液提取可以为浸泡或回流提取。

根据本发明的实施方案中，步骤(2)中所用的不与水混溶的有机溶剂可以为石油醚、乙酸乙酯、氯仿。

根据本发明的实施方案中，步骤(3)中的色谱分离包括但不限于硅胶柱分离、制备型液相色谱分离以及它们的任意组合。

根据本发明的实施方案中，步骤(4)中的纯化可以通过制备型液相色谱或者重结晶以及它们的任意组合进行。

根据本发明的实施方案中，所述式(I)所示化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(1)将筋骨草粉碎，用乙醇水溶液浸泡，过滤浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取3-5次，将不同极性的萃取液分别浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和氯仿浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的粗组分；

(4)通过HPLC分析不同极性的粗组分，再通过硅胶柱分离、制备液相色谱分离及重结晶，得到所述式(I)所示的化合物。

根据本发明的实施方案，所述步骤(1)中，乙醇水溶液中乙醇的质量分数可以为50-80％，例如50％、60％、70％或80％。

根据本发明的实施方案，当步骤(1)采用浸泡提取方式时，浸泡温度为15-30℃，优选为室温；浸泡时间为20-40天，优选为25-35天，例如为28天，29天，30天，31天，32天。当步骤(1)采用回流提取方式时，回流时间可以为10-24h，例如为12-15h。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比(g/mL)为(0.2-3):1，例如(0.5-2):1，示例性为1:1。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，每次萃取使用的有机溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)，例如1:(0.5-2)，示例性为1:2。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中展开剂为石油醚和/或乙酸乙酯，从纯的石油醚开始，逐渐增加乙酸乙酯的量同时减少石油醚的量，最终变成纯的乙酸乙酯。优选地，石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:0、0.9:0.1、0.8:0.2、0.7:0.3、0.6:0.4、0.5:0.5、0.4:0.6、0.3:0.7、0.2:0.8、0.1:0.9、0:1。

根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，所述HPLC分析条件优选如下：流动相：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}＝7:3，柱温为室温，检测波长为200-400nm整合波长；所述柱分离选取极性差值较大的组分进行(例如选取Rf差值为0.5-1的3-5个组分)；所述柱分离可以重复进行一次。

根据本发明的实施方案，步骤(4)所述重结晶的溶剂为四氢呋喃和甲醇的混合溶剂，四氢呋喃和甲醇体积比为(1-3):1，例如2:1；

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，可以在显微镜下分离不同的晶体，得到所述甾体类化合物A、B；所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、颜色；所述形状可以为针状、片状、块状；可以通过制备液相色谱分离得到化合物C、D、E和/或F。

所述显微镜下的分离步骤为，根据晶体外观状态不同，用挑晶体的针，将不同晶形的晶体挑选出来。

本发明还提供一种通过在显微镜下分离式(I)化合物的晶体以提纯化合物的方法。

根据本发明的实施方案，所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、颜色。

本发明还提供所述式(I)化合物在制备治疗癌症的药物中的应用。

根据本发明的实施方案，所述癌症为肺癌、胃癌、乳腺癌或宫颈癌。

本发明采用CCK8方法对优选的新甾体化合物B进行了体外抗肿瘤测试，主要研究了该单体化合物对胃癌细胞株、肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MCF-7及宫颈癌细胞株的抑制活性。结果表明化合物B其对上述肿瘤细胞株均具有很强的抑制活性。在1.75mg/mL浓度下，对胃癌细胞株、乳腺癌细胞株MCF-7、肺癌细胞株A549及宫颈癌细胞株的体外抑制率分别为：58.812％、77.097％、41.789％和94.776％。

有益效果

本发明从筋骨草中分离获得的6个甾体类化合物对多种癌细胞(如胃癌细胞株、大肠癌细胞株、乳腺癌细胞株和宫颈癌细胞株)均具有很强的抑制活性。

本发明的提取方法通过对植物提取液进行初步纯化(如柱分离、制备板分离、制备液相色谱分离等)后，然后重结晶，并快速准确的获取高纯度的目标化合物(纯度可高达98％)，对含有复杂成分的植物提取液中具体化合物的快速分离和鉴定具有重要意义。

发明人惊奇的发现，通过本发明的方法，可以得到待分离化合物的不同结晶形式，从而易于进一步分离，尤其是可以通过显微镜观察实现分离。

附图说明

图1为化合物A的HPLC色谱图；

图2为化合物B的HPLC色谱图；

图3为化合物C的HPLC色谱图；

图4为化合物D的HPLC色谱图；

图5为化合物E的HPLC色谱图；

图6为化合物F的HPLC色谱图；

图7为化合物A的球棍模型图；

图8为化合物C的球棍模型图；

图9为化合物D的球棍模型图；

图10为化合物A的HMBC相关图；

图11为化合物B的HMBC相关图；

图12为化合物C的HMBC相关图；

图13为化合物E的HMBC相关图；

图14为化合物F的HMBC相关图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

仪器与试剂：

筋骨草(2018年采自福建省平潭岛)，其它化学试剂均为国产化学纯试剂；CCK8(上海贝博生物科技有限公司)；日立L2000高效液相色谱仪(日立HITACHI)；DMEM高糖培养基(赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司)；EDTA(胰酶)(gibco)；Foetal Bovine Serum(Biological Industries)；磷酸缓冲盐溶液；96孔细胞培养板；多功能酶标仪。

实施例1：甾体类化合物A、B、C、D、E及F的提取分离及结构鉴定

化合物A、B及C的提取分离按照如下过程进行：

(a)将20公斤干燥的筋骨草(2018年采自福建省平潭岛)粉碎，分别装入2个20L的塑料桶中，加入10L 70％的乙醇/水溶液室温浸泡1个月，过滤浓缩即得浸膏。两桶药材分别重复上述浸泡、过滤、浓缩提取3次，将获得的浸膏合并。

(b)将步骤a所得的1公斤浸膏分散在1000mL水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取5次，每次石油醚、乙酸乙酯和氯仿用量为500毫升。将不同极性的萃取液分别浓缩即得不同极性的浸膏。

(c)将步骤b中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用V_石油醚/V_乙酸乙酯：1:0至0:1进行梯度洗脱，得到了30个不同极性的部位(Fr₁-Fr₃₀)。

(d)将步骤(c)中获得的30个组分分别通过HPLC(V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}，7:3，柱温为室温，检测波长是200-400nm)分析不同极性的组分，选取极性差值较大(HPLC保留时间差值大约为0.5-5分钟)的5个组分进行后续的硅胶柱分离，这5个组分是通过将步骤(c)中30个组分进行硅胶柱分离(洗脱剂PE/EA比例为2:1、1:1、0:1)洗脱下来的馏分进行HPLC检测，与前述HPLC分析对照确认并得到的。将得到的5个组分进行一次硅胶柱分离，将得到的组分进行TLC分析后，选择极性差值较大(Rf差值大约为0.5-1)的组分进行二次硅胶柱分离，然后将二次柱分离后的组分进行制备高效液相色谱分离，将制备色谱分离获得的组分进行重结晶(V_四氢呋喃：V_甲醇＝2：1)，在显微镜下挑选出片状和针状的晶体获得了两个新甾体类化合物A和化合物B。

发明人发现，仅通过柱分离，制备板分离或中压制备色谱分离只能获得化合物A和B的混合物(经TLC检测是一个点，HPLC分析也是保留时间相同，但¹H NMR分析为混合物)，而惊奇地发现，该混合物在四氢呋喃和甲醇混合溶剂中，A很容易形成大量晶体，而B在该溶液中形成微量的晶体，且两种晶体(A及B)外观状态不同，因此可以采取在显微镜下挑选不同晶体形式，实现化合物A及B的分离。化合物C、D、E和F的极性相差比较大，可以通过制备液相色谱分离制备。

对分离得到的新甾体化合物(A、B、C、D、E及F)，通过HPLC测定了其纯度：A的纯度98.70％,Rt＝11.887min；B的纯度98.809％,Rt＝16.673；C的纯度99.641％，Rt＝6.987min，D的纯度99.613％,Rt＝7.100min；E的纯度99.388％,Rt＝10.240min，F的纯度99.710％,Rt＝8.273min；(色谱条件：色谱条件：C₁₈柱；流动相：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}，7:3；检测波长:254nm。其化合物A的HPLC色谱图见附图1，B的HPLC色谱图见附图2，C的HPLC色谱图见附图3，D的HPLC色谱图见附图4，E的HPLC色谱图见附图5，F的HPLC色谱图见附图6)。

通过NMR和高分辨质谱分析，确定了其结构，通过XRD分析确定其晶型。

A：无色针状晶体，熔点：176-177℃，单斜晶系，空间群为P1₂1₁，a＝13.621(4),b＝7.735(2),c＝15.556(5),α＝90.0,β＝92.496(13),γ＝90.0,Z＝2,

d＝0.700g/cm³，(通过XRD确定的晶体球棍模型结构见附图7)；HR-MS for C₂₉H₄₄O₈+Na:计算值：543.6630,实验值：543.2928；¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ5.81(1H,d,J＝2.5Hz,H-7),5.04(1H,s,H-30),4.89(1H,s,H-26α),4.79(1H,s,H-26β),3.95(1H,d,J＝3.0Hz,H-2),3.84(1H,dt,J＝11.6,4.4Hz,H-3),3.66(1H,d,J＝10.0Hz,H-22),3.62(1H,m,H-28),3.57(2H,m,H2-33),3.14(1H,m,H-9),2.38(1H,dd,J＝7.2,5.1Hz,H-5),2.29(1H,m,H-7),2.20(1H,m,H-24),2.07(1H,m,H-12α),1.82(1H,m,H-12β),2.03(1H,m,H-23α),1.39(1H,m,H-23β),2.02m(2H,m,H2-15),1.79(1H,m,H-1α),1.42(1H,m,H-1β),1.72(2H,m,H2-31),1.70(2H,m,H2-4),1.66(3H,s,H-27),1.64(2H,s,H-32),1.15(3H,s,H3-21),1.13(3H,d,J＝6.2Hz,H3-29),0.96(3H,s,H3-19).

B：无色固体，熔点：136-137℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ5.81(1H,d,J＝2.6Hz,H-7),4.94(1H,s,H-28),4.08(1H,m,H-11),4.01(1H,dt,J＝4.5,3.9Hz,H-2),3.97(1H,m,H-3),3.64(1H,m,H-22),3.58(2H,m,H₂-31),3.14(1H,dd,J＝6.3,2.8Hz,H-9),2.58(1H,dd,J＝8.8,4.2Hz,H-1α),1.37(1H,m,H-1β),2.36(1H,m,H-17),2.32(1H,d,J＝4.2Hz,H-5),2.15(2H,m,H₂-12),1.94(1H,m,H-15α),1.58(1H,m,H-15β),1.74(2H,m,H₂-4),1.63(2H,m,H₂-29),1.62(2H,m,H₂-30),1.59(1H,m,H-25),1.48(2H,m,H₂-23),1.16(3H,s,H₃-21),1.06(3H,s,H₃-19),0.93(3H,d,J＝1.8Hz,H₃-26),0.92(3H,d,J＝1.8Hz,H₃-27),0.84(3H,s,H₃-18).

C：无色柱状晶体，熔点：160-162℃,三斜晶系，空间群为P1，a＝8.16(4),b＝13.90(6),c＝15.99(7)，α＝64.58(8)°,β＝88.89(11)°,γ＝88.39(10)°；Z＝4,

d＝1.176g/cm³，(通过XRD确定的晶体球棍模型结构见附图8)；HR-MS forC₂₉H₄₄O₈+Na:计算值：543.6630,实验值：543.2928；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ5.63(1H,d,J＝2.6,H-7),4.66(1H,s,14-OH),4.45(1H,d,J＝5.8Hz,2-OH),4.39(1H,d,J＝5.16Hz,22-OH),4.37(1H,d,J＝3.0Hz,3-OH),4.15(1H,m,H-27),3.76(1H,s,20-OH),3.75(1H,s,H-2),3.60(1H,m,H-3),3.32(1H,dd,J＝5.6,5.0Hz,H-22),3.00(1H,m,H-9),2.44(1H,m,H-25),2.21(1H,m,H-5),2.19(1H,m,H-17),2.01(1H,m,H-15α),1.71(1H,m,H-15β),1.89(1H,m,H-24),1.86(2H,m,H₂-26),1.82(1H,m,H-12α),1.75(1H,m,H-12β),1.84(2H,m,H₂-23),1.57(1H,m,H-4α),1.45(1H,m,H-4β),1.55(1H,m,H-1α),1.22(1H,m,H-1β),1.32(3H,d,J＝6.1Hz,H₃-28),1.17(3H,d,J＝7.1Hz,H₃-29),1.07(3H,s,H₃-21),0.83(3H,s,H₃-19),0.76(3H,s,H₃-18).

D:无色柱状晶体，熔点：160-163℃,三斜晶系，空间群为P1，a＝8.16(4),b＝13.90(6),c＝15.99(7)，α＝64.58(8)°,β＝88.89(11)°,γ＝88.39(10)°；Z＝4,

d＝1.176g/cm³，(通过XRD确定的晶体球棍模型结构见附图9)；HR-MS forC₂₉H₄₄O₈+Na:计算值：543.6630,实验值：543.2927；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ5.63(1H,d,J＝2.6Hz,H-7),4.15(1H,m,H-27),3.75(1H,s,H-2),3.60(1H,m,H-3),3.32(1H,dd,J＝5.6,5.0Hz,H-22),3.00(1H,m,H-9),2.44(1H,m,H-25),2.21(1H,m,H-5),2.19(1H,m,H-17),2.01(1H,m,H-15α),1.71(1H,m,H-15β),1.89(1H,m,H-24),1.86(2H,m,H₂-26),1.82(1H,m,H-12α),1.75(1H,m,H-12β),1.84(2H,m,H₂-23),1.57(1H,m,H-4α),1.45(1H,m,H-4β),1.55(1H,m,H-1α),1.22(1H,m,H-1β),1.32(3H,d,J＝6.1Hz,H₃-28),1.17(3H,d,J＝7.1Hz,H₃-29),1.07(3H,s,H₃-21),0.83(3H,s,H₃-19),0.76(3H,s,H₃-18).

E:白色固体，熔点：146-147℃,¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ5.82(1H,d,J＝2.6Hz,H-7),4.17(1H,d,J＝3.8Hz,H-22),3.96(1H,d,J＝3.0Hz,H-3),3.84(1H,m,H-2),3.16(1H,m,H-9),2.46(1H,m,H-23α),2.34(1H,m,H-23β),2.40(1H,m,H-17),2.36(1H,m,H-5),2.32(2H,m,H₂-29),2.16(2H,m,H₂-15),2.00(1H,m,H-16α),1.74(1H,m,H-16β),1.96(1H,s,H-12α)，1.59(1H,s,H-12β),1.86(3H,s,H3-27),1.76(1H,m,H-1α),1.40(1H,s,H-1β),1.75(2H,m,H₂-4),1.31(3H,d,J＝11.9Hz,H₃-3),1.25(2H,m,H₂-28),1.12(3H,t,J＝7.6Hz,H₃-30),0.96(3H,s,H₃-18),0.89(3H,s,H₃-19).

F:白色固体，熔点：186-187℃,¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ5.60(1H,d,J＝2.5Hz,H-7),3.87(1H,m,H-11),3.78(1H,m,H-3),3.75(1H,s,H-2),2.96(1H,dd,J＝6.1,2.6Hz,H-9),2.44(1H,m,H-1α),1.11(1H,m,H-1β),2.24(1H,t,J＝9.2Hz,H-17),2.12(1H,dd,J＝9.2,3.8Hz,H-5),2.04(1H,m,H-12α)1.95(1H,m,H-12β),1.76(1H,m,H-15α),1.44(1H,m,H-15β),1.85(2H,m,H₂-16),1.59(1H,m,H-4α),1.42(1H,m,H-4β),1.36(1H,m,H-22α),1.09(1H,m,H-22β),1.34(1H,m,H-24α),1.07(1H,m,H-24β),1.06(3H,s,H₃-21),0.90(3H,s,H-19),0.86(3H,d,J＝2.0Hz,H₃-27),0.85(3H,d,J＝2.0Hz,H₃-28),0.72(3H,s,H₃-18).

实施例2：体外抗肿瘤活性测试

优选了化合物A进行了体外抗肿瘤活性测试，主要研究了其对肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MCF-7、胃癌细胞株(由宁夏医科大学保存提供)和宫颈癌细胞株的体外抑制活性。具体的测试过程以乳腺癌MCF-7细胞株的测试过程为例进行阐述：具体流程如下：

1.测试样品浓度配制

称取化合物A 3.5mg，加入5mL的塑料离心管中，用DMSO稀释至2mL。即得浓度为1.75mg/mL的初始浓度。然后将初始浓度用DMSO进行倍比稀释，依次获得1.75mg/mL、0.875mg/mL、0.4375mg/mL、0.21875mg/mL、0.109375mg/mL和0.0546875mg/mL 6个不同的浓度梯度，置于4℃冰箱保存待用。

2.乳腺癌细胞株(MCF-7)的培养及抑制活性测试

将乳腺癌细胞株MCF-7置于37℃，饱和湿度，含有5％的CO₂培养箱中培养24小时，当细胞处于对数生长期时，吸弃上清培养液，并用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，使用高糖培养基终止消化。并将细胞接种于96孔板中，使得细胞密度为5000个/孔。将96孔板置于培养箱中培养24小时。随之吸弃96孔板中的细胞培养液。并向96孔板中补加100μL的高糖培养基，然后每孔加入不同浓度的测试样品1μL(每个浓度设置5个复孔)，接着置于37℃，饱和湿度，5％CO₂的培养箱中继续培养48h后，每个孔加入10μL CCK8，继续在37℃培养箱中孵育1-4h后。在多功能酶标仪上测定450nm波长下每孔的吸光度值。阴性对照为V_{高糖培养基}/V_DMSO:10:1的混合溶液，实验组和对照组均设六个复孔，按照如下公式计算抑制率。

化合物A对胃癌细胞株、宫颈癌细胞株和肺癌细胞株的测试过程同上。化合物A对胃癌细胞株、肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MFC-7和宫颈癌细胞株的体外抑制率如下表。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种式(I)所示的化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

所述式(I)化合物的结构如下A、B、C、D、E或F所示：

(1)将筋骨草粉碎，用乙醇水溶液浸泡，过滤浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取3-5次，将不同极性的萃取液分别浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和氯仿浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的粗组分；

(4)通过HPLC分析不同极性的粗组分，再通过硅胶柱分离、制备液相色谱分离及重结晶，得到所述式(I)所示的化合物；

所述步骤(1)中，乙醇水溶液中乙醇的质量分数为50-80％；

所述步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比为(0.2-3):1g/mL；

所述步骤(2)中，每次萃取使用的有机溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)；

所述步骤(4)中，所述HPLC分析条件为流动相：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}＝7:3，柱温为室温，检测波长是200-400nm整合波长；所述柱分离选取Rf差值为0.5-1的组分进行；所述柱分离重复进行一次；

步骤(4)所述重结晶的溶剂为四氢呋喃和甲醇的混合溶剂，四氢呋喃和甲醇体积比为(1-3):1；

步骤(4)中，在显微镜下分离不同的晶体，得到所述甾体类化合物A和B；所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、颜色；所述形状为针状、片状、块状；通过制备液相色谱分离得到化合物C、D、E和/或F；

所述显微镜下的分离步骤为，根据晶体外观状态不同，用挑晶体的针，将不同晶形的晶体挑选出来。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比为(0.5-2):1g/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每次萃取使用的有机溶剂与水的体积比为1:(0.5-2)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中展开剂为石油醚和/或乙酸乙酯，从纯的石油醚开始，逐渐增加乙酸乙酯的量同时减少石油醚的量，最终变成纯的乙酸乙酯。

5.式(I)所示的化合物在制备治疗宫颈癌的药物中的应用；

所述式(I)所示的化合物为化合物A；

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