CN108587960A

CN108587960A - 一种产香放线菌菌株及其应用

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Publication number: CN108587960A
Application number: CN201810404540.4A
Authority: CN
Inventors: 李文均; 段焰青; 陈微; 储晓; 田野; 刘瑞瑞; 符玉松; 肖敏
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明公开了一种产香放线菌菌株，所述菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）SYSUZL‑4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年11月02日，保藏号为CGMCC NO：14848。该放线菌能够合成榄香烯、土味素、榄香醇、β‑桉叶醇、α‑桉叶醇等挥发性物质，在香精香料的生产上具有较大的开发潜力，可用于制备烟用香料，应用于烟草领域。

Description

一种产香放线菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及从香茅草根际土壤中分离获得的一种产香放线菌菌株及其应用。

背景技术

香茅草(Cymbopogon citratus)为多年生草本，是生长在亚热带的一种重要香料作物，本身具有较高的开发价值，但植物香料具有资源有限、栽培时间长、受季节气候限制等缺点，目前仅依靠植物的香料开发已不能满足香料行业的需求。近年来，越来越多的研究者开始关注与产香植物相关的产香微生物的开发，以期找到新的天然香料资源。微生物香料较其他香料具有香气自然柔和、生产周期短、产量收获高、成本低、工艺简单等优点，在微生物代谢过程中产生的复杂低分子化合物，包括醇类、醛类、酯类、萜烯类等香气物质，为天然香料生产提供了一个新的来源，但目前从根际土壤中分离获得产香微生物的报道很少。

榄香醇为一种倍半萜烯，可用作香精原料。桉叶醇包括α-桉叶醇和β-桉叶醇，广泛存在于许多桉树的油中，可用作定香剂，其乙酸酯在澳大利亚作佛手柑油的代用品。迄今能够合成榄香醇、β-桉叶醇、α-桉叶醇等香味物质的微生物仍少有报道。目前，卷烟“降焦减害”已成为全球烟草发展的方向，而“降焦减害”往往会导致烟草产品香气不足、品质降低，利用新型烟用香原料提升烟草品质一直是烟草企业和香料公司香料研究的热点。近年来，国内烟用香精香料技术已取得一些进展，但仍无法满足我国中式低焦油卷烟的发展需要，且香料品质较为单一，因此大力开展新型烟用香料的开发和应用研究，将成为中式低焦油卷烟增香提味的一项重要举措。利用微生物发酵制备生物香料，对于提高烟草的吸食品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能产生挥发性香味物质的放线菌菌株及其应用，该放线菌菌株来源于香茅草根际土壤，易于培养，在改良T5固体培养基上生长3-4天则能嗅闻到浓郁怡人的香气。

为了是实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种产香放线菌菌株，该菌株结合形态特征和基于细菌16S rRNA基因序列的系统发育分析，鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)SYSUZL-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年11月02日，保藏号为CGMCC NO：14848。

将香茅草根际土壤样品进行常规稀释，取10^-3的稀释悬浮液涂布分离培养基，涂布后于28℃培养，待菌落长出后结合划线分离法在固体平板上进行分离纯化，直至获得纯培养。将分离获得的纯培养菌株转接至含有简单碳氮源的改良T5固体培养基平板进行培养，用封口胶将培养皿封口，培养至72h，通过嗅闻培养皿气味进行初筛，并综合发酵液气味特征和香气强度进行复筛，进而获得产香效果最好的菌株SYSUZL-4。

其中，改良T5固体培养基成分为：每1000mL培养基中，葡萄糖5.0g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉2g，碳酸钙2g，微量盐1.0mL，琼脂16g，PH 7.2。

微量盐成分为:CuSO₄·5H₂O 6.4g，FeSO₄·7H₂O 1.1g，MnCl₂·4H₂O 7.9g，ZnSO4·7H2O 1.5g，超纯水定容至1000mL。

本发明为香精香料生产提供了一种新的微生物资源。本发明所提供的产香放线菌菌株SYSUZL-4在改良T5液体培养基28℃培养4d后，取菌株发酵液及其减压旋蒸获得的冷凝水GC-MS上样检测，质谱库比对结果显示：该菌株产生5类主要的挥发性化合物，根据保留时间先后，分别为榄香烯、土味素、榄香醇、β-桉叶醇、α-桉叶醇。其中，除去在链霉菌中常见的土味素外，其他成分鲜有报道能在链霉菌甚至是微生物中出现。该菌的上述特征表明其在香料原材料的生产上具有较大的开发潜力。

因此，本发明还提供了产香放线菌菌株在烟草增香提味中的应用，利用产香放线菌对含有烟叶碎片水提渣的发酵培养基进行发酵，得到烟用香料。

所述烟用香料的制备方法如下：

1)制备如下发酵培养基：每1000mL培养基中含有玉米汁2％、酵母膏2％、MgSO₄0.05％、KH₂PO₄ 0.1％、(NH₄)₂SO₄ 0.5％，烟碎片水提渣0.8-1.2％；

2)将产香放线菌接种于上述发酵培养基中，于30℃恒温发酵72-96h，取500g发酵液加入1000mL 75％乙醇中，加热回流提取1-1.5h，过滤，静置过夜，取上清液并用旋转蒸发仪于60℃蒸馏除去乙醇，所得物料再用1000mL 95％乙醇进行回溶，静置过夜后，取上清液减压浓缩至膏状，制得烟用香料。

进一步，产香放线菌接种量为5％，烟碎片水提渣的水分含量为55-60％。

进一步，所述烟碎片水提渣的制备方法如下：将100g烟叶碎片加入900-1000mL水中，用电热套回流提取2-2.5h，过滤，收集滤渣，即为所述烟碎片水提渣。

所述烟用香料添加于卷烟烟丝中，添加量为烟丝重量的0.01～0.03％。

本发明提供的分离自香茅草根际土壤的产香放线菌，能够合成榄香烯、土味素、榄香醇、β-桉叶醇、α-桉叶醇等挥发性物质，在香精香料的生产上具有较大的开发潜力。产香放线菌菌株SYSUZL-4的代谢物在促进烟叶醇化，增强醇和性方面具有较好的作用，利用产香放线菌对含有烟叶碎片水提渣的发酵培养基进行发酵，制得的烟用香料能够与烟香较好协调，可用于卷烟增香，改善卷烟吸味。

附图说明

图1为本发明菌株SYSUZL-4的进化树图；

图2为本发明菌株SYSUZL-4发酵液GC-MS检测结果；

图3为本发明菌株SYSUZL-4冷凝水GC-MS检测结果。

图4为本发明菌株的菌落形态图。

具体实施方式

以下实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1菌株的分离、筛选

从云南省石林市采集香茅草根际土壤，在无菌条件下称取5g土壤样品置于铺有滤纸的培养皿中，常温风干1星期后，将土壤样品加入45mL带玻璃珠的无菌水中稀释至10^-1的悬浮液，28℃、170rpm震荡40min。然后梯度稀释至10^-3的悬浮液，吸取150μL该悬浮液涂布M5分离培养基上，28℃培养1星期。菌落长出后，挑取单菌落，在改良T5纯化培养基上划线，28℃培养3天，观察菌株是否完全纯化，对纯化的菌株进行冷冻真空干燥保藏，采用20％脱脂牛奶为保护剂。

其中M5分离培养基成分为：每1000mL培养基中，纤维素2.5g，丙酮酸甲酯1.0g，精氨酸0.5g，脯氨酸0.5g，KNO₃ 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄·3H₂O 0.2g，CaCl₂ 0.5g，微量盐1ml，PH 7.2-7.4。

改良T5纯化培养基成分为：每1000mL培养基中，葡萄糖5.0g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉2g，碳酸钙2g，微量盐1.0mL，PH 7.2。

以含有简单碳氮源的改良T5固体培养基(每1000mL培养基中，葡萄糖5.0g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉2g，碳酸钙2g，微量盐1.0mL，琼脂16g，PH 7.2)为初筛基础培养基，挑取纯化的菌株划线培养，在菌株生长到24h时，用封口胶将培养皿封口，同一条件下，继续培养至72h左右。在超净台上直接嗅闻培养皿中的气味，选取香味浓郁的菌株95株进行复筛，分别为菌株SYSUZL-4、X0131，X0183，X0186，C193，X0099-2，X0198，X0206，X0212，C184，X0193，X0209，X0204，C183，X0175，X0134，X0195，X0118，C181，X0145-1，X0199，X0145-2,X0210，C0379，X0230等。该步骤的筛选标准为：选取在培养皿中散发浓郁气味的菌株，因液体发酵后菌株的味道会有不同，所以尽可能留取备用菌株。

以改良T5液体培养基为复筛培养基，挑取初筛培养皿中单菌落制备种子液，转接发酵培养基后将摇瓶用封口膜及灭菌报纸封口，28℃摇床，170rpm培养72h。选择生长良好的菌株嗅闻其发酵液，生长较差的菌株延长其发酵期，选取发酵后无异味、杂味且气息浓郁清甜的菌株。固体培养过程中，发现大部分菌株都具有产生挥发性物质的能力，经液体发酵复筛后，大多数经典细菌(如X0186、X0183、C193等)味道减弱至不可闻，或产生强烈异味、杂味。最终，经筛选获得气味浓郁、似花香的目标菌株SYSUZL-4。

实施例2菌株的鉴定

实施例1获得的目标菌株在改良T5固体培养基上产生白色气丝，少量褐色色素，味道浓郁，具有怡人气息。将上述目标菌株进行16S rRNA检测。根据菌株的基因测序结果与链霉菌具有高度的同源性，故将目标菌株鉴定为Streptomyces sp.。

图1为本发明菌株SYSUZL-4的进化树图。

实施例3菌株SYSUZL-4产挥发性香味物质分析

(1)样品制备

a.发酵液的制备：以改良T5液体培养基为发酵培养基，28℃摇床，170rpm培养制备发酵液。

b.冷凝水样的制备：取200mL发酵完成的培养液进行减压旋蒸，待系统中出现冷凝水后，收集冷凝水样。

(2)固相微萃取上样

萃取头：SAAB-57318、75μm CAR/PDMS SPEM

吸附条件：65℃加热，萃取1h

(3)检测条件

气质联用仪：Agilent 7890GC/5975MSD

色谱柱型号：HP-5MS 0.25mm

载气：He(1.0ml/min)

进样口温度：250℃

条件：起始温度50℃，保持2min，以6℃/min升温至180℃，再以8℃/min升温至280℃，保持5min；分流进样，分流比10:1

检测时间：40分钟

离子源：EI

(4)检测结果：菌株SYSUZL-4发酵液及冷凝水样经GC-MS上样检测，均可见明显化合物峰，质谱库比对后，显示其可能产生5类主要挥发性化合物，根据保留时间先后，分别是榄香烯、土味素、榄香醇、β-桉叶醇、α-桉叶醇。

菌株SYSUZL-4发酵液GC-MS检测结果如图2所示，菌株SYSUZL-4冷凝水GC-MS检测结果如图3所示，菌株SYSUZL-4发酵液中挥发性组分详细信息如表1所示，菌株SYSUZL-4冷凝水中挥发性组分详细信息如表2所示。

表1菌株SYSUZL-4发酵液中挥发性组分详细信息

表2菌株SYSUZL-4冷凝水中挥发性组分详细信息

实施例4产香放线菌的应用

一种烟用香料，由产香菌放线菌菌株SYSUZL-4对含有烟叶碎片水提渣的发酵培养基进行发酵得到。所述发酵培养基组成为：每1000mL培养基中含有玉米汁2％、酵母膏2％、MgSO₄ 0.05％、KH₂PO₄ 0.1％、(NH₄)₂SO₄ 0.5％，石林烟叶碎片水提渣0.8-1.2％；(水：固体原料＝3:2)。

上述石林烟叶碎片水提渣的制备方法如下：所述烟碎片水提渣的制备方法如下：将100g烟叶碎片加入1000mL水中，用电热套回流提取2h，过滤，收集滤渣，即为所述烟碎片水提渣。

将产香放线菌接种于上述发酵培养基中，接种后置于30℃恒温发酵96h，取500g发酵液加入1000mL 75％乙醇，加热回流提取1h，过滤。静置过夜，取上清液，用旋转蒸发仪于60℃蒸馏除去乙醇，所得物料再用1000mL 95％乙醇进行回溶，静置过夜后，取上清液减压浓缩至膏状，制得烟用香料。

发酵最佳条件为：发酵温度30℃，接种量5％，烟叶碎片颗粒大小2-5mm，烟叶碎片含水量60％，发酵原料碎片间有一定的间隙，具有较好的通气性。

本发明制备的烟用香料能够与烟香较好协调，可用于卷烟增香，改善卷烟吸味，可将烟用香料添加于卷烟烟丝中，添加量为烟丝重量的0.01～0.03％。

Claims

1.一种产香放线菌菌株，其特征在于：所述菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）SYSUZL-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017年11月02日，保藏号为CGMCC NO：14848。

2.如权利要求1所述的一种产香放线菌菌株在制备烟用香料中的应用。

3.根据权利要求1所述的一种产香放线菌菌株在制备烟用香料中的应用，其特征在于：利用产香放线菌对含有烟叶碎片水提渣的发酵培养基进行发酵，得到烟用香料。

4.根据权利要求3所述的一种产香放线菌菌株在制备烟用香料中的应用，其特征在于：所述烟用香料的制备方法如下：

1）制备如下发酵培养基：每1000mL培养基中含有玉米汁2%、酵母膏2%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.1%、(NH₄)₂SO₄ 0.5%，烟碎片水提渣0.8-1.2%；

2）将产香放线菌接种于上述发酵培养基中，于30℃恒温发酵72-96 h，取发酵液加入75%乙醇中，加热回流提取1-1.5h，过滤，静置过夜，取上清液并用旋转蒸发仪蒸馏除去乙醇，所得物料再用95%乙醇进行回溶，静置过夜后，取上清液减压浓缩至膏状，制得烟用香料。

5.根据权利要求4所述的一种产香放线菌菌株在制备烟用香料中的应用，其特征在于：产香放线菌接种量为5%，烟碎片水提渣的水分含量为55-60%。

6.根据权利要求4所述的一种产香放线菌菌株在制备烟用香料中的应用，其特征在于：所述烟碎片水提渣的制备方法如下：将100g烟叶碎片加入900-1000mL水中，用电热套回流提取2-2.5h，过滤，收集滤渣，即为所述烟碎片水提渣。

7.根据权利要求4所述的一种产香放线菌菌株在制备烟用香料中的应用，其特征在于：将烟用香料添加于卷烟烟丝中，添加量为烟丝重量的0.01～0.03%。