CN108949597B - 一种酿酒酵母菌kmly1-2及其分离方法和应用 - Google Patents

一种酿酒酵母菌kmly1-2及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种酿酒酵母菌KMLY1‑2，其微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1‑2，拉丁文学名：Saccharomyces cerevisiae.KMLY1‑2，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM 2018457。本发明从馒头酵子中分离得到的酿酒酵母菌KMLY1‑2，其发酵提取物具有特殊香气，加入卷烟产品中，具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，适合卷烟和新型烟草制品加香。

Description

一种酿酒酵母菌KMLY1-2及其分离方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母菌KMLY1-2及其分离方法和应用。
背景技术
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前，烟用香料按来源分为三类，即来自非烟草的天然植物香精油、浸膏等；来自非烟草的天然植物香料，如从各种植物的花、果实、根、茎、叶中提取的精油浸膏、酊剂等；人工合成的香料，如醇、醛、酮等单体香料。按香料生产方法的不同主要分为两种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。目前，这两种方法都有其优点，但均存在一定的局限性。如直接从植物中提取天然香料，虽然生产操作简单，但存在改善卷烟抽吸效果不明显等缺点；采用化学合成的香料，虽然生产过程易于控制，但也存在香气单调、不自然等缺点。
近年来，随着微生物技术日新月异的发展，微生物法生产香料的工作已取得了很多进展。微生物种类丰富，长期以来人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调研和开发利用，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性也日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，微生物资源的不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。
色醇(Tryptophol，TOL)，广泛存在于葡萄酒和啤酒等饮料中，是一种具有多种功效的吲哚衍生物。第一，TOL具有促进睡眠作用。动物实验表明，TOL能够促进小鼠睡眠，将注射TOL剂量由200mg/Kg提高至400mg/Kg时，小鼠开始入睡时间由2.8min缩短到1.4min，小鼠睡眠持续时间由4.2min延长至14.4min。第二，TOL具有抑制病原真菌生长作用。植物内生真菌可以通过产生TOL以提高植物对其他病原真菌的抵抗力，且能够促进植物生长。第三，TOL是植物生长素吲哚乙酸(Indole-3-acetateacid，IAA)的重要前体物质，植物通过储备TOL作为合成IAA的原料库，以备植物生长所需。第四，TOL和苯乙醇作为信号分子调控 flo11基因表达，从而实现酵母菌由单细胞向菌丝体转变。
生物体中色醇主要有2条合成路径。其一为：色氨酸→吲哚-3-丙酮酸→吲哚 -3-乙醛→色醇，此即吲哚丙酮酸途径；其二为：以磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖为起始底物，经莽草酸途径生成分枝酸，分枝酸经几步酶促反应生成色氨酸，色氨酸经吲哚丙酮酸途径合成色醇，此为从头合成途径。
利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香原料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。产香微生物，即能够产生具有芳香气味物质的微生物。目前，已经得到应用的产香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)、假丝酵母、乳酸菌、黑曲霉等。但是应用到卷烟和新型烟草制品中的微生物还很少，而且增香效果也不太理想。
发明内容
本发明第一方面涉及一种高产色醇的食源性酿酒酵母菌KMLY1-2，其是从山东菏泽采取馒头酵子样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和利用26SrDNA通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和 NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)扩增该微生物的D1/D2区序列，鉴定结果表明其属于酿酒酵母菌，微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1-2(拉丁文学名：Saccharomycescerevisiae.KMLY1-2)，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCCM)保藏，保藏编号为CCTCCM2018457，地址：中国武汉武汉大学。
本发明分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：菌落形态规则、卵圆形、大而厚、乳白色、表面光滑、粘稠、容易挑起，菌落质地均匀；发酵糖试验为阳性。
本发明分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2菌株在酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastextractpeptonedextroseMedium，YPD)培养基固体平板上，菌落颜色为乳白色或者红色，呈卵圆形，较大较厚，表面湿润、粘稠，易被挑起，且酿酒酵母菌 KMLY1-2在葡萄汁固体培养基中长势最好。
本发明所分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2的分子生物学鉴定分析显示， PCR产物长度为622bp，与NCBI数据库中的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有很高的同源性(99～100％)。基于这些结果，将本发明所得到的微生物菌株鉴定为酿酒酵母KMLY1-2。
本发明所分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2的26SrDNA的D1/D2序列如序列表所示。
本发明第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法，包括以下步骤：
a、从山东菏泽采集馒头酵子样品若干份，利用YPD固体培养基筛选出单菌落，单菌落在YPD液体培养基中培养8～16h，保存于-80℃冰箱中；
b、随机选取10株菌落，在葡萄汁固体培养基中划线分离，30℃培养48h；
c、选取1株长势最好菌株，接种于YPD固体培养基，30℃培养48h。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法中，YPD固体培养基(g/L)的组成：蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％，余量为水。配制完成后，于115℃灭菌20min。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法中，葡萄汁固体培养基的配制方法如下：
将新鲜葡萄，用清水洗净，用物理压榨法进行打浆，按0.3～0.5％(复合酶/ 葡萄汁为m/v)比例，在葡萄汁中添加复合酶(复合酶包括果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、糖化酶和脂肪酶，其质量比为3:2:2:2:0.5:0.5)，45℃酶解2h，酶解后用双层纱布过滤去除残渣，将滤液置于85℃下灭菌30min，滤液用等体积蒸馏水稀释，并添加1.5wt％的琼脂，然后置于85℃下灭菌30min后，倒入平板中，备用。
本发明所用到的葡萄产地为云南弥勒东风农场玫瑰蜜葡萄。
本发明第三方面涉及一种酿酒酵母菌KMLY1-2制剂及其制备方法，包括如下步骤：
将酿酒酵母菌KMLY1-2在YPD液体培养基中活化12h，按体积比1％接种于100mL的YPD液体培养基中，30℃静止培养24h，将2，5，10和100mL培养物在8000～10000rpm下离心10min，沉淀用无菌去离子水洗涤2次，再用 100mL发酵用葡萄汁重悬菌体，即可得到接菌量体积比为2％，5％，10％和100％的酿酒酵母菌KMLY1-2制剂。
上述酿酒酵母菌制剂及其制备方法，YPD液体培养基的组成为：蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，余量为水。配制完成后，于115℃灭菌20min。
本发明第四方面涉及一种利用本发明第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2 发酵制备色醇的方法，包括如下步骤：
将本发明第三方面所制备的2％，5％，10％和100％酿酒酵母菌KMLY1-2 制剂，于30℃恒温培养箱中发酵12h，4～5℃的冷库中发酵12h，发酵液在 8000～10000rpm条件下离心10min，去除菌体，得到上清液，上清液用0.45μm 滤膜过滤，采用HPLC仪测定样品中色醇的含量，并以未发酵葡萄汁作为对照。
上述利用本发明第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2发酵制备色醇的方法中，优选的发酵条件为：接菌量5％、发酵温度30℃、转速200rpm、pH3、发酵时间12h，冷库(4～5℃)发酵12h。
本发明第五方面涉及一种测定本发明第四方面所得到的发酵上清液中挥发性成分相对含量的方法，包括如下步骤：
离心收集发酵上清液，用1倍体积的二氯甲烷分别萃取2次，有机相放入三角瓶中并加入过量无水Na2SO4过夜，以彻底除去水分，将过夜后的有机相转移至蒸馏瓶中，然后将蒸馏瓶中的二氯甲烷50℃下减压蒸干，以彻底除去溶剂，然后用4mL二氯甲烷溶解样品，将溶解的样品用0.22μm的有机滤膜过滤后，采用GC-MS技术分析样品中挥发性成分，并以未发酵葡萄汁作为对照。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次从山东菏泽馒头酵子样品中分离得到的试验菌种，经形态学、生理生化性质和26SrDNA分析表明该菌株属于酿酒酵母菌，微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1-2(拉丁文学名：Saccharomycescerevisiae.KMLY1-2)。
(2)本发明从馒头酵子中分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2，其发酵提取物具有特殊香气，加入卷烟产品中，具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，适合卷烟和新型烟草制品加香。
(3)本发明从馒头酵子中分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2，工艺简单，操作容易，成本低，适用于推广应用。
附图说明
图1为本发明酿酒酵母菌KMLY1-2的生长和产酸曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所述实验结果，如无特殊说明，均为三次重复的平均值。
实施例1
酿酒酵母菌KMLY1-2的分离、培养与鉴定
1.酿酒酵母菌KMLY1-2的分离
a、从山东菏泽采集馒头酵子样品若干份，利用YPD固体培养基筛选出单菌落，单菌落在YPD液体培养基中培养16h，保存于-80℃冰箱中；
b、随机选取10株菌落，在葡萄汁固体培养基中划线分离，30℃培养48h；
c、选取1株长势最好菌株，接种于YPD固体培养基，30℃培养48h。
2.酿酒酵母菌KMLY1-2的鉴定
对分离纯化的菌株进行形态学、生理生化性质和利用真菌基因组提取试剂盒提取KMLY1-2基因组DNA，用26SrDNA通用引物NL1 (5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)扩增该微生物的D1/D2区序列，并送往昆明硕擎生物技术公司进行测序。PCR扩增条件为：94℃4min；94℃30s，50℃ 30s，72℃60s，35个循环；72℃10min。序列信息提交至NCBI数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线比对分析。
鉴定结果表明属于酿酒酵母菌，其微生物学分类命名为酿酒酵母菌 KMLY1-2(拉丁文学名：Saccharomycescerevisiae.KMLY1-2)。
本发明分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：菌落形态规则、卵圆形、大而厚、乳白色、表面光滑、粘稠、容易挑起，菌落质地均匀；发酵糖试验为阳性。
本发明分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2菌株在YPD固体平板上，菌落颜色为乳白色或者红色，呈卵圆形，较大较厚，表面湿润、粘稠，易被挑起，且酿酒酵母菌KMLY1-2在葡萄汁固体培养基中长势最好。
本发明所分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2的分子生物学鉴定分析显示， PCR产物长度为622bp，与NCBI数据库中的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有很高的同源性(99～100％)。基于这些结果，将本发明所得到的微生物菌株鉴定为酿酒酵母KMLY1-2。
本发明所分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2的26SrDNA的D1/D2序列如序列表所示。
实施例2
酿酒酵母KMLY1-2的生长和产酸曲线
从-80℃冰箱中取出酿酒酵母菌KMLY1-2保藏液，按体积比为4‰的接种量接种至5mLYPD液体培养基中，活化，活化好的菌液按体积比为4‰接种于100 mLYPD液体培养基中，30℃静止培养48h。每隔2h取样3mL，测定其OD600和pH值。
实验结果如图1所示，酿酒酵母菌KMLY1-2从第6h进入指数生长期，在第18h进入稳定生长期。酿酒酵母菌KMLY1-2的产酸结果为：pH值从5.5一直缓慢下降到稳定期初期的4.4，随后培养基中的pH值不再改变(如图1所示)，这说明酿酒酵母菌KMLY1-2具有一定产酸能力，推测其在代谢培养中的葡萄糖或蛋白质时，能产生一些酸性化合物。
实施例3
酿酒酵母菌KMLY1-2发酵葡萄汁产生色醇的实验，包括如下步骤：
按体积比1％的接菌量，将在YPD液体培养基中活化12h的酿酒酵母菌 KMLY1-2接种于100mLYPD液体培养基中，30℃静止培养24h。将100mL培养物在10000rpm下离心10min，沉淀用无菌去离子水洗涤2次，菌体用100mL 发酵用葡萄汁重悬，于30℃恒温培养箱中发酵12h，冷库(4℃)后发酵12h。将发酵液在10000rpm条件下离心10min，去除菌体，得到上清液。上清液用 0.45μm滤膜过滤，采用HPLC测定样品中色醇绝对含量，并以未发酵葡萄汁作为对照组。HPLC分析结果显示，样品中含有10.29μg/mL色醇，而对照组中未检测到色醇。
实施例4
酿酒酵母菌KMLY1-2发酵葡萄汁制备色醇的实验条件优化
基于HPLC分析，对酿酒酵母菌KMLY1-2发酵条件进行优化。选取接菌量、发酵温度、转速和pH4个因素进行正交实验。正交试验结果如表1所示。
表1接菌量、发酵温度、转速和pH4个因素的正交试验
Figure BDA0001780724050000071
由表1可知，接菌量为5％、发酵温度为30℃、转速为200rpm和pH为3时，色醇产量最高，为15.01μg/mL，均比未优化的10.29μg/mL和对照的0μg/mL产量高，表明此为KMLY1-2的最优发酵条件。
实施例5
葡萄汁经酿酒酵母菌KMLY1-2发酵后的致香成分分析
按实施例4中制备色醇最优条件发酵，离心收集发酵上清液，用1倍体积的二氯甲烷分别萃取2次，有机相放入三角瓶中并加入过量无水Na2SO4过夜以彻底除去水分，将过夜后的有机相转移至蒸馏瓶中，并用适量二氯甲烷冲洗三角瓶，然后将蒸馏瓶中的二氯甲烷50℃下减压蒸干，以彻底除去溶剂，然后用4mL 二氯甲烷溶解样品，将溶解的样品用0.22μm的有机滤膜过滤后，采用GC-MS 分析样品中挥发性成分，并以未发酵葡萄汁样品作为对照。
气相色谱条件：色谱柱为毛细管柱DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气(纯度≥99.999％)，柱流速1.0mL/min；进样方式为分流进样，进样量为2μL，分流比30：1；程序升温为初始温度50℃，保持5min，然后2℃/min升至150℃，再4℃/min升至250℃，保持10min，最后3℃/min升至280℃，保持10min。
质谱条件：电离方式为EI+；离子化电压为70eV；扫描范围35-450amu；离子源温度230℃；传输线温度260℃。
对采集到的质谱图利用Wiley和NIST08谱库进行串联检索，确定化合物身份，并利用峰面积归一化法计算各化学成分在样品中的相对含量。
表2酿酒酵母菌KMLY1-2发酵葡萄汁的致香成分
Figure BDA0001780724050000081
Figure BDA0001780724050000091
备注：相对含量指一种样品中单一化合物峰面积占总化合物峰面积的比例；—：未检测到。
由表2可知，葡萄汁经酿酒酵母菌KMLY1-2发酵后，发酵上清液中的致香成分主要是醇类，含量为45.36％，而其中色醇的含量高达39.99％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
巩效伟，罗义勇，朱东来，赵伟，韩熠，刀娅，李寿波，李廷华，洪鎏，张霞，陈永宽，吴俊
<120> 一种酿酒酵母菌及其分离方法和应用
<130> RIB180299
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 622
<212> DNA
<213> 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
ttgccatttt ccattagcgg aggaaaagaa accaaccggg attgccttag taacggcgag 60
tgaagcggca aaagctcaaa tttgaaatct ggtaccttcg gtgcccgagt tgtaatttgg 120
agagggcaac tttggggccg ttccttgtct atgttccttg gaacaggacg tcatagaggg 180
tgagaatccc gtgtggcgag gagtgcggtt ctttgtaaag tgccttcgaa gagtcgagtt 240
gtttgggaat gcagctctaa gtgggtggta aattccatct aaagctaaat attggcgaga 300
gaccgatagc gaacaagtac agtgatggaa agatgaaaag aactttgaaa agagagtgaa 360
aaagtacgtg aaattgttga aagggaaggg catttgatca gacatggtgt tttgtgccct 420
ctgctccttg tgggtagggg aatctcgcat ttcactgggc cagcatcagt tttggtggca 480
ggataaatcc ataggaatgt agcttgcctc ggtaagtatt atagcctgtg ggaatactgc 540
cagctgggac tgaggactgc gacgtaagtc aaggatgctg gcataatggt tatatgccgc 600
cgtcttgaac accggacccc ca 622

Claims (3)

1.一种酿酒酵母菌KMLY1-2，其特征在于，其微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1-2，拉丁文学名：Saccharomyces cerevisiae.KMLY1-2，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM 2018457。
2.一种根据权利要求1所述的酿酒酵母菌KMLY1-2制剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将酿酒酵母菌KMLY1-2在YPD液体培养基中活化12 h，按体积比1%接种于100 mL的YPD液体培养基中，30℃静止培养24 h，将2，5，10和100mL培养物在8000~10000 rpm下离心10min，沉淀用无菌去离子水洗涤2次，再用100mL发酵用葡萄汁重悬菌体，即可得到接菌量体积比为2%，5%，10%和100%的酿酒酵母菌KMLY1-2制剂。
3.一种利用酿酒酵母菌KMLY1-2发酵制备色醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求2所制备的体积比为2%，5%，10%和100%酿酒酵母菌KMLY1-2制剂，于30℃恒温培养箱中发酵12h，4~5℃的冷库中发酵12h，发酵液在8000~10000 rpm条件下离心10min，去除菌体，得到上清液，上清液用0.45 μm滤膜过滤，即得含有色醇的发酵液。
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