CN113832167B - 一个基因及其在提高苯乙醇和色醇产量中的用途 - Google Patents

一个基因及其在提高苯乙醇和色醇产量中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基因uli1，其来源于酿酒酵母KMLY1‑2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明在酿酒酵母BY4741菌株中对基因uli1进行过表达，在酿酒酵母KMLY1‑2菌株中进行基因敲除，结果显示过表达菌株BY4741‑GPD‑uli1与对照菌株BY4741‑GPD相比，苯乙醇产量提高了33.64%，色醇产量提高了46.62%；敲除菌株KMLY1‑2‑∆uli1与野生型菌株KMLY1‑2相比，苯乙醇产量降低了36.45%，色醇产量降低了25.75%；表明基因uli1能够应用在提高酵母菌生产苯乙醇和色醇中，本发明为苯乙醇和色醇的工业化生产提供了一种新的途径。

Description

一个基因及其在提高苯乙醇和色醇产量中的用途
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，具体涉及一种基因及其在提高苯乙醇和色醇产量中的应用。
背景技术
苯乙醇是一种具有玫瑰气味的芳香醇，作为香料广泛用于食品、日化和轻工业等领域。苯乙醇主要有2条合成路径：1）苯丙氨酸通过转氨酶作用形成苯丙酮酸，苯丙酮酸在苯丙酮酸脱羧酶作用下脱羧形成苯乙醛，苯乙醛再通过醇脱氢酶催化生成苯乙醇，此为艾利希途经；2）葡萄糖通过糖酵解途径产生的磷酸烯醇式丙酮酸，通过磷酸戊糖途径产生的4-磷酸赤藓糖，两者在2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶（DAHP合酶）作用下通过中间体DAHP形成莽草酸。莽草酸再经中间体分支酸和预苯酸在分支酸变位酶和预苯酸脱水酶的作用下形成苯丙酮酸，苯丙酮酸可通过苯乙醛生成苯乙醇，此为从头合成途径。
色醇是一种具有促睡眠、抑菌、诱导酵母菌丝体产生等多种生物活性的吲哚衍生物，广泛存在于葡萄酒和啤酒等饮料中。色醇同样主要有2条合成路径：1）色氨酸→吲哚-3-丙酮酸→吲哚-3-乙醛→吲哚-3-乙醇（色醇），此即吲哚丙酮酸途径；2）以磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖为起始底物，经莽草酸途径生成分支酸，分支酸经几步酶促反应生成色氨酸，色氨酸经吲哚丙酮酸途径合成色醇，此为从头合成途径。
目前，为了提高苯乙醇和色醇产量，较多的研究分别集中于从头合成途径-艾利希途经（苯乙醇）和从头合成途径-吲哚丙酮酸途径（色醇）的代谢改造，合成调控研究较少。本发明以酿酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae）为研究对象，利用比较转录组学分析和功能基因注释挖掘了一个未知功能基因（ uli1），并运用基因克隆、基因表达和基因敲除等技术研究了基因 uli1及其表达产物（ULI1）的生物学功能，发现基因 uli1及ULI1在酵母菌苯乙醇和色醇合成过程中发挥了重要作用，该研究在苯乙醇和色醇的生物和酶学合成领域具有重大意义。经文献检索，未见与本发明相同的文献报道。
发明内容
本发明提供一种基因 uli1，其来源于酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）KMLY1-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
本发明另一目的是将上述基因 uli1应用在提高酵母菌苯乙醇和色醇产量中。
本发明另一目的是将基因 uli1的表达产物ULI1应用在合成并提高苯乙醇和色醇产量中。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
以分离于馒头酵子的酿酒酵母KMLY1-2菌株（保藏号为CCTCC M2018457，该保藏菌株在本申请日之前已经在其它专利申请中公开过）为研究对象，分析其转录组数据，发现一个差异表达基因 uli1，其基因表达水平如表1所示；该基因注释为未知功能基因，可能参与内质网未折叠蛋白反应并由其诱导。克隆基因 uli1全长cDNA序列，对其进行序列分析、过表达和基因敲除研究；结果发现，基因 uli1的cDNA序列长度为462bp，序列如SEQ ID NO: 1所示，将其翻译为氨基酸序列，为153个氨基酸，序列如SEQ ID NO: 2所示。
把基因 uli1克隆至pY26TEF-GPD载体（淼灵质粒平台，武汉）中，并在商品化酿酒酵母菌BY4741中进行过表达，同时利用CRISPR/Cas9技术敲除酿酒酵母KMLY1-2的基因 uli1。以含有空质粒pY26TEF-GPD的BY4741菌株（即BY4741-GPD）、过表达菌株BY4741- uli1、野生型酿酒酵母菌株KMLY1-2、敲除型菌株KMLY1-2-∆ uli1为研究对象，利用高效液相色谱法（HPLC）测定苯乙醇和色醇含量，结果表明，与对照菌株BY4741-GPD相比，过表达菌株BY4741- uli1苯乙醇和色醇产量显著增加；与野生型菌株KMLY1-2相比，敲除 uli1基因后苯乙醇和色醇产量显著下降。上述结果说明基因 uli1及其表达产物（ULI1）是调控酵母菌合成苯乙醇和色醇的关键因素。
表1：基因 uli1的转录水平
注：TM-0T、TM-0.6T、TM-1.5T和TM-7P分别表示酿酒酵母KMLY1-2在含0、0.6、1.5g/L色氨酸和1.75g/L苯丙氨酸的TM培养基中培养18h后得到的菌体样品；FPKM表示每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数。
因此，针对基因 uli1及其表达产物（ULI1）的上述功能，提供该基因或其表达产物在生物和酶法合成苯乙醇和色醇中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
①本发明研究了基因（ uli1）及其表达产物（ULI1）的生物学功能，即基因 uli1和ULI1是控制酵母菌合成苯乙醇和色醇的关键因素，能显著提高苯乙醇和色醇产量，在苯乙醇和色醇生物和酶学合成领域具有重要应用前景；
②本发明基因（ uli1）及其表达产物（ULI1）是从食源性酵母菌KMLY1-2（来源于馒头酵子）中克隆得到，若将该基因及其表达产物（ULI1）用于食品、药品、化妆品等领域，保证了基因和蛋白来源的安全性。
附图说明
图1为过表达菌株BY4741- uli1和含空载体菌株BY4741-GPD的苯乙醇和色醇含量；图中***表示极显著差异（ P < 0.001）；
图2为野生型菌株KMLY1-2和敲除型菌株KMLY1-2-∆ uli1的苯乙醇和色醇含量；图中**和***分别表示显著差异（ P < 0.05）和极显著差异（ P < 0.001）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂，使用常规方法；
实施例中SC-URA培养基配方为：1.34g YNB（Yeast Nitrogen Base，无氨基酸，含硫酸铵）溶解于88mL无菌水中，用氢氧化钠溶液调节pH至5.8，121℃灭菌20min；待温度降至55℃时，加入1mL 100×dropout solution、10mL 20%单独灭菌的葡萄糖溶液、1mL 1 μmol/L过滤除菌的Fe(NH4)2(SO4)2溶液、0.2mL 0.02%过滤除菌的D-Biotin；100×dropoutsolution配方为：0.2g L-Histidine HCl、1.0g L-Leucine、0.2g L-Methionine、0.3g L-Tyrosine、0.5g L-Glutamine 和 0.2g L-Arginine，用蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20min。
实施例中高效液相色谱法（HPLC）条件为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×250μm，5μm）；流动相：70%甲醇溶液+30%水溶液；每个样品检测时间为15min；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：210nm。
酿酒酵母感受态细胞的制备：
1、挑取酿酒酵母BY4741或KMLY1-2单菌落于5mL的液体YPD中，30℃、200rpm下培养过夜；
2、将上述培养菌液按照1%的接种量转接到新的YPD液体培养基中，30℃、200 rpm下培养8h，直至OD600值达到0.6；
3、把培养的菌液分装至50mL灭菌离心管中，置于冰上30min后，8000rpm离心5min，弃去上清液，收集菌体；
4、使用提前灭菌并冷却的等体积的超纯水洗涤菌体两次；
5、弃掉上清液，利用灭菌的等体积的1mol/L的山梨醇再洗涤菌体两次；
6、通过8000rpm离心5min收集菌体，加入2~5mL的1mol/L的山梨醇重悬菌体，每个1.5mL离心管分装100μL重悬菌液，并放置于-80℃保存备用。
实施例1：酿酒酵母KMLY1-2菌株  uli1基因的克隆与序列分析
根据KMLY1-2转录组数据，选择差异表达基因 uli1为研究对象；利用 Primerpremier 5.0设计扩增基因 uli1序列的特异引物 uli1-F（5’-ATGAATTCATGACGCCCTATGCAGTAG-3’）和 uli1-R（5’-TACTCGAGTTACAGAGAAATAACCCTTGCAAAACC-3’）。
利用Trizol（Invitrogen，美国）提取野生型酿酒酵母菌KMLY1-2的总RNA，使用HiScript® II Reverse Transcriptase试剂盒（诺唯赞，南京）进行逆转录，以逆转录的cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL（2×Phanta Max Buffer 25μL、dNTP Mix（10mM each）1μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1U/ta）1μL、cDNA模板2μL、（上、下游）引物（10μM）各2μL、ddH2O 17μL），扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸5min；将扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，序列分析表明PCR扩增获得的序列正确，翻译成氨基酸序列，为153个氨基酸，分子量为22.24kDa，等电点为9.27。
实施例2：基因 uli1在酿酒酵母菌BY4741中的表达
1、 uli1基因过表达载体构建
以酿酒酵母KMLY1-2总RNA逆转录得到的cDNA为模板，利用引物 uli1-F（5’-ATGAATTCATGACGCCCTATGCAGTAG-3’，下划线为 EcoRⅠ酶切位点）和 uli1-R（5’-TACTCGAGTTACAGAGAAATAACCCTTGCAAAACC-3’，下划线为 XhoⅠ酶切位点）扩增基因 uli1，PCR反应体系和扩增程序同实施例1，PCR产物经电泳检测后，将PCR产物和表达质粒pY26TEF-GPD分别用 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切，回收后，按5:1～2:1的摩尔比，用Solution I连接液（宝生物公司，大连）在16℃连接16h；连接产物经热激转化法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞后，在含有50µg/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基中37℃下培养16h，筛选出的转化子利用引物YF（5’-GGCACAAACAGGCAAAAAA-3’）和YR（5’-GGTTAGAGCGGATGTGGG-3’）进行菌落PCR验证，再利用天根质粒小提试剂盒（北京）提取阳性转化子中的质粒，提取方法参照试剂盒说明书进行，质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，序列正确的质粒即为酿酒酵母表达载体pY26TEF-GPD- uli1。
2、表达载体pY26TEF-GPD- uli1转入酿酒酵母BY4741菌株中
在10kv/cm，200Ω的电转条件下，将表达载体pY26TEF-GPD- uli1用电击转化法转入表达菌株BY4741感受态细胞中，获得 uli1基因过表达菌株BY4741- uli1，利用相同的方法将空质粒pY26TEF-GPD转化至BY4741感受态细胞中，得到菌株BY4741-GPD作为对照。
3、BY4741- uli1和BY4741-GPD的苯乙醇和色醇含量测定
将过表达菌株BY4741- uli1和对照菌株BY4741-GPD分别在SC-URA培养基中培养24h，然后将一定量的菌液转接至分别含0.6g/L色氨酸和1.75g/L苯丙氨酸的TM培养基（葡萄糖 30g/L、磷酸二氢钾 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、NaCl 1g/L）中，调节菌悬液OD600为0.15~0.16，再在30℃、150rpm下震荡培养48h，离心收集上清液，0.45µm滤膜过滤，滤液用HPLC方法分析苯乙醇和色醇浓度，图1结果显示，与对照菌株BY4741-GPD相比，过表达菌株BY4741- uli1在相同培养基中苯乙醇和色醇产量显著增加，对照菌株的苯乙醇产量为268.47mg/L，过表达菌株的苯乙醇产量提高至358.78mg/L，提高了33.64%；色醇产量由18.62mg/L提高至27.3mg/L，提高了46.62%。
实施例3：酿酒酵母KMLY1-2菌株 uli1基因的敲除
1、编辑载体构建
从Addgene网站（https://www.addgene.org，美国）上购买表达gRNA的pCfB3052质粒，由于pCfB3052含有3个gRNA表达框，需对其进行改造。首先利用 NdeⅠ限制性内切酶切割pCfB3052质粒使其线性化，酶切体系为：pCfB3052质粒8μL、 NdeⅠ(10U/μL) 2μL、1×Mbuffer 10μL，总体积20μL，条件：16℃金属浴酶切16h；
切胶回收酶切产物，将酶切产物作为模板，利用特异性引物3052（2）-F（5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC-3’）和3052（2）-R（5’-GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG-3’）进行PCR扩增，PCR反应体系为50μL（2×Phanta MaxBuffer 25μL、dNTP Mix（10mM each）1μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1U/ta）1μL、质粒DNA模板2μL、（上、下游）引物（10μM）各2μL、ddH2O 17μL），扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火20s，72℃延伸3min 10s，30个循环后72℃延伸5min，得到5273bp只含有一个gRNA表达框的线性化质粒pCfB3052-gRNA；
然后，在CRISPR设计网站（https://chopchop.cbu.uib.no）中设计针对 uli1基因的gRNA靶标序列（TTTCCGCCATCAAATCTCAG AGG），在20bp靶标序列的两端各添加15bp同源于线性化质粒pCfB3052-gRNA两端的同源臂序列，通过生工生物工程（上海）股份有限公司化学合成两条50bp寡链DNA。两条寡链DNA利用碧云天生物技术有限公司（上海）的寡链退火Buffer进行退火形成双链DNA，退火产物与线性化质粒pCfB3052-gRNA利用Hieff Clone®Plus One Step Cloning Kit（翌圣生物科技，上海）进行无缝克隆，无缝克隆体系转化至大肠杆菌DH5α中，涂布于氨苄青霉素抗性（50μg/mL）的LB固体培养基上，37℃倒置培养18h，挑取单克隆至氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，150rpm、37℃摇床培养24h，用引物3052-veriflcation-F（5’-GAATGCGTGCGATAGGGAACA-3’）和3052-veriflcation-R（5’-AGCGGAAGAGCGCCCAATAC-3’）进行菌液PCR验证，并将PCR产物送公司测序，测序结果正确的质粒为重组质粒pCfB-3052- uli1。
2、Donor DNA的构建
利用引物对 uli1-uF/R（5’-AGGATATGGGAACCCACA-3’；5’-GTTTTTTTCGTCTTCTTCACAATCACGTTACTTGAA-3’）和 uli1-dF/R（5’-GAAGAAGACGAAAAAAAC-3’；5’-TGAATCCAAAGAGAGAAT-3’），以KMLY1-2基因组为模板克隆出 uli1基因上下游同源臂，上下游同源臂的长度分别为566bp和570bp，因为 uli1-uR的5’端带有18bp同源于 uli1-dF序列，所以用overlap PCR将上下游序列进行重叠，PCR扩增程序设为：95℃预变性3min，95℃变性20s，53℃退火15s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸5min。回收PCR产物，得到长度为1136bp，用于 uli1敲除的Donor DNA。
3、转化子筛选和验证
从Addgene网站上购买表达Cas9蛋白的pCfB2312质粒。将pCfB-3052- uli1、pCfB-2312和Donor DNA在10kv/cm，200Ω的电转条件下共同转化至KMLY1-2感受态中，涂布于G418（200μg/mL）和诺尔丝菌素（100μg/mL）的双抗YPD平板上，30℃培养48h后挑取单克隆，提取酵母基因组，利用引物对（knockout verification-F：5’-TCCTTGAATGGTTTCGCTCTG-3’、knockout verification-R：5’-TCTTGCCCAATGACTGCT-3’）进行 uli1基因敲除的验证，得到敲除菌株KMLY1-2-∆ uli1。
4、基因敲除菌株KMLY1-2-∆ uli1和野生型菌株KMLY1-2的苯乙醇和色醇含量测定
将敲除菌株KMLY1-2-∆ uli1和野生型菌株KMLY1-2分别在YPD培养基（葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L）中培养24h，然后将菌悬液转接至分别含0.6g/L色氨酸和1.75g/L苯丙氨酸的TM培养基中，调节菌悬液OD 600为0.25~0.26，150rpm、30℃下摇床培养12h和48h后，离心收集上清，0.45µm滤膜过滤，分别用于色醇和苯乙醇含量测定；HPLC分析结果显示，与野生型菌株KMLY1-2相比，敲除型菌株 KMLY1-2-∆ uli1在相同条件下苯乙醇和色醇产量显著降低，敲除型菌株苯乙醇产量为822.61mg/L，野生型菌株的产量为1294.52mg/L，降低了36.45%，色醇产量由252.34mg/L降低至187.35mg/L，降低了25.75%（图2）。
上述实施例结果均说明 uli1基因及其表达产物（ULI1）是控制酵母菌合成苯乙醇和色醇的关键因素，能显著提高苯乙醇和色醇产量，在苯乙醇和色醇生物和酶学合成领域具有重要应用前景。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 昆明理工大学 江西师范大学
<120> 一个基因及其在提高苯乙醇和色醇产量中的用途
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> 酿酒酵母KMLY1-2(Saccharomyces cerevisiae KMLY1-2)
<400> 1
atgacgccct atgcagtagc aattaccgtg gccttactaa ttgtaacagt gagcgcactc 60
caggtcaaca attcatgtgt cgcttttccg ccatcaaatc tcagaggcaa aaatggagac 120
ggtactaatg aacagtatgc aactgcacta ctttctattc cctggaatgg acctcctgag 180
tcattgaggg atattaatct tattgaactc gaaccgcaag ttgcactcta tttgctcgaa 240
aattatatta accattacta caacaccaca agagacaata agtgccctaa taaccactac 300
ctaatgggag ggcagttggg tagctcatcg gataatagga gtttgaacga tccgcaaacg 360
atgctatggc cggaaaagaa gaagacgaaa aaaactgcca agaaactttt aaaggggcct 420
gttcgtgtac caaaaggttt tgcaagggtt atttctctgt aa 462
<210> 2
<211> 153
<212> PRT
<213> 酿酒酵母KMLY1-2(Saccharomyces cerevisiae KMLY1-2)
<400> 2
Met Thr Pro Tyr Ala Val Ala Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile Val Thr
1               5                   10                  15
Val Ser Ala Leu Gln Val Asn Asn Ser Cys Val Ala Phe Pro Pro Ser
            20                  25                  30
Asn Leu Arg Gly Lys Asn Gly Asp Gly Thr Asn Glu Gln Tyr Ala Thr
        35                  40                  45
Ala Leu Leu Ser Ile Pro Trp Asn Gly Pro Pro Glu Ser Leu Arg Asp
    50                  55                  60
Ile Asn Leu Ile Glu Leu Glu Pro Gln Val Ala Leu Tyr Leu Leu Glu
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Ile Asn His Tyr Tyr Asn Thr Thr Arg Asp Asn Lys Cys Pro
                85                  90                  95
Asn Asn His Tyr Leu Met Gly Gly Gln Leu Gly Ser Ser Ser Asp Asn
            100                 105                 110
Arg Ser Leu Asn Asp Pro Gln Thr Met Leu Trp Pro Glu Lys Lys Lys
        115                 120                 125
Thr Lys Lys Thr Ala Lys Lys Leu Leu Lys Gly Pro Val Arg Val Pro
    130                 135                 140
Lys Gly Phe Ala Arg Val Ile Ser Leu
145                 150
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atgaattcat gacgccctat gcagtag 27
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tactcgagtt acagagaaat aacccttgca aaacc 35
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
ggcacaaaca ggcaaaaaa 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
ggttagagcg gatgtggg 18
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 40
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
gatcatttat ctttcactgc ggagaag 27
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
tttccgccat caaatctcag agg 23
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
aggatatggg aacccaca 18
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
gtttttttcg tcttcttcac aatcacgtta cttgaa 36
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
gaagaagacg aaaaaaac 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
tgaatccaaa gagagaat 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
tccttgaatg gtttcgctct g 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
tcttgcccaa tgactgct 18

Claims (2)

1.基因uli1在提高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）苯乙醇和色醇产量中的应用，所述基因uli1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.基因uli1的表达产物ULI1在提高酿酒酵母苯乙醇和色醇产量中的应用，所述基因uli1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
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