CN110832079A - 苯乙醇、醛、酸、胺及相关化合物的生物生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用过表达酶的重组微生物细胞，通过在一锅反应体系中使包含葡萄糖、L‑苯丙氨酸、取代的L‑苯丙氨酸、苯乙烯或取代的苯乙烯的起始原料经历多种酶催化的化学转化，从而生物生产取代或未取代的苯乙醛、2‑苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺。为了从苯乙烯生产苯乙醛，将细胞修改为过表达苯乙烯单加氧酶(SMO)和苯乙烯氧化物异构酶(SOI)。为了从苯乙烯生产苯乙酸，过表达SMO、SOI和醛脱氢酶。替代地，为了生产2‑苯乙醇，过表达SMO、SOI和醛还原酶或醇脱氢酶，而为了生产苯乙胺，过表达SMO、SOI和转氨酶。

Description

苯乙醇、醛、酸、胺及相关化合物的生物生产
技术领域
本发明涉及使用新型生物催化剂生物生产有用和有价值的苯乙醇、醛、酸、胺和相关化合物。更特别地，本发明提供了通过一种或多种重组微生物细胞生物生产取代或未取代的苯乙醛、2-苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺的方法，所述重组微生物细胞经基因工程化以相对于野生型细胞过表达至少一种酶，该方法包括在一锅反应体系中使起始原料经历多种酶催化的化学转化，其中起始原料选自包括葡萄糖、L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸、苯乙烯或取代的苯乙烯的组。
背景技术
2-苯乙醇(2-PE)、苯乙醛(PA)、苯乙酸(PAA)和苯乙胺(PEA)广泛用于化妆品、香水和食品工业。生产这些化合物的当前工业方法依赖于对有毒和“脏”的石油基化学品(诸如苯)的传统化学催化。对于食品和化妆品应用，客户首选天然2-PE、PA、PAA和PEA。例如，天然2-PE的售价为约1000美元/千克，而传统化学合成的2-PE的售价仅为约5美元/千克。然而，从植物来源提取天然2-PE、PA、PAA和PEA的生产工艺无法满足庞大的市场需求。从天然生物资源生物生产2-PE、PA、PAA和PEA被认为是一种有前途的替代方法，但是由于天然合成途径的低效率和产品的毒性，现有生物生产的效率受到限制。
2-苯乙醇(2-PE)是一种玫瑰味香料(FEMA-GRAS 2858)，年产量为10,000吨，且主要通过由苯或苯乙烯的化学合成制备[Etschmann,M.,Bluemke,W.,et al.,J.Appl.Microbiol.Biotechnol.59:1-8；(2002)；Hua,D.,Xu,P.Biotechnol.Adv.29:654-660(2011)]。苯乙醛(PA)(FEMA-GRAS 2874)是用于食品和化妆品应用的有价值的香味物质，且在这些应用中天然PA是更优选的。苯乙酸(PAA)(FEMA-GRAS 2878)在低浓度下具有蜂蜜般的气味，并因此用于一些香水中。苯乙胺(PEA)是一种具有精神活性和刺激作用的天然单胺生物碱。它已被广泛用作食品补充剂和营养补充剂，以改善情绪和心理表现。
为了提供天然2-PE或其他相关化合物的充分供给，开发了天然来源的生物技术方法，并且产品可以被认为是天然的。微生物生产2-PE对于生产高价值的“天然”产品一直非常有吸引力。一些酵母中的天然埃利希途径(Ehrlich pathway)被用于微生物生产(例如，通过一些酵母、真菌和极少细菌)这些天然化合物[Etschmann,M.,Bluemke,W.,et al.,J.Appl.Microbiol.Biotechnol.59:1-8；(2002)；Hua,D.,Xu,P.Biotechnol.Adv.29:654-660(2011)]。然而，这些方法仅产生低至中等浓度的所需产物。例如，面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最近经过工程改造，可通过传统的埃利希途径从10g/L的Phe生产4.8g/L的2-PE[Kim,B.,Cho,B.R.,Hahn,J.S.Biotechnol.Bioeng.111:115-124(2014)]。
需要改进的方法来生产有用和有价值的“天然”苯乙醇、醛、酸、胺和相关化合物。
发明内容
在本发明中，将新颖且有效的生物合成途径工程化到微生物细胞中，以分别从苯乙烯、天然产物L-苯丙氨酸(L-Phe)和葡萄糖生物生产2-PE、PA、PAA和PEA。本发明中公开的代谢工程方法还可以应用于大肠杆菌(E.coli)和其他微生物菌株中其他生化试剂的生产。新的合成途径包括：1)上游莽草酸途径，从葡萄糖产生L-Phe；2)中游脱氨-脱羧模块，将L-Phe转化为苯乙烯；3)下游模块，将苯乙烯分别官能化为2-PE、PA、PAA和PEA。下游模块可单独用于将苯乙烯转化为2-PE、PA、PAA和PEA。中游和下游模块可以组合在一个重组菌株中，以直接将生物基L-Phe转化为这些产物。通过进一步与上游途径整合，重组生物催化剂能够从生物基葡萄糖发酵生产这些产物。此外，还从相应的取代的苯乙烯生产2-PE、PA、PAA和PEA的环取代的衍生物。
因此，在本发明的第一方面，提供了通过一种或多种重组微生物细胞生物生产取代或未取代的苯乙醛、2-苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺的方法，所述重组微生物细胞经基因工程改造以相对于野生型细胞过表达至少一种酶，该方法包括在一锅反应体系中使起始原料经历多种酶催化的化学转化，其中起始原料选自包括葡萄糖、L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸、苯乙烯或取代的苯乙烯的组。
在本发明的第一方面的一些实施方式中，基因工程细胞：
(i)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙醛的苯乙烯单加氧酶和苯乙烯氧化物异构酶；
(ii)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙酸的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和醛脱氢酶；
(iii)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的2-苯乙醇的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶；或
(iv)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙胺的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和转氨酶。
在一些实施方式中，苯乙烯单加氧酶包含SEQ ID NO：1和2所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；苯乙烯氧化物异构酶包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；醛脱氢酶包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；醇脱氢酶包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，以及转氨酶是ω-转氨酶，包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
在一些实施方式中，苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)VLB120或其突变体，苯乙烯氧化物异构酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，醛脱氢酶来自大肠杆菌(Escherichia coli)或其突变体，醛还原酶来自番茄(Solanum lycopersicum)或其突变体，或是来自大肠杆菌的YqhD或其突变体；醇脱氢酶来自酿酒酵母，以及转氨酶是ω-转氨酶，来自紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)或其突变体或河流弧菌(Vibriofluvialis)或其突变体。
在一些实施方式中，苯乙烯单加氧酶由SEQ ID NO：7和8所示的核酸序列编码；苯乙烯氧化物异构酶由SEQ ID NO：9所示的核酸序列编码；醛脱氢酶由SEQ ID NO：10所示的核酸序列编码；醇脱氢酶由SEQ ID NO：11所示的核酸序列编码，以及转氨酶是由SEQ IDNO：12所示的核酸序列编码的ω-转氨酶。
在相同的一锅反应体系中由L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸的转化提供苯乙烯或取代的苯乙烯可能是有利的。
因此，在一些实施方式中，相同的基因工程细胞或其他基因工程细胞通过由解氨酶的过表达催化的脱氨反应和由脱羧酶的过表达催化的脱羧反应从L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸生产苯乙烯或取代的苯乙烯。
在优选的实施方式中，解氨酶是苯丙氨酸解氨酶，且脱羧酶是苯基丙烯酸脱羧酶。
在一些实施方式中，苯丙氨酸解氨酶包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，且苯基丙烯酸脱羧酶包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
在一些实施方式中，苯丙氨酸解氨酶是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtPAL2，其由SEQ ID NO：15所示的核酸序列编码，并且其中苯基丙烯酸脱羧酶是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的AnPAD，其由SEQ ID NO：16所示的核酸序列编码。
在相同的一锅反应体系中通过催化葡萄糖提供用于生产苯乙烯的L-苯丙氨酸可能是有利的。
在一些实施方式中，相同的基因工程细胞或其他基因工程细胞通过由选自包括DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)或其突变体的组中的至少一种酶的过表达催化的反应从葡萄糖产生L-苯丙氨酸。
在一些实施方式中，AroG包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；AroK包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；YdiB包含SEQ IDNO：19所示的氨基酸序列，其变体，突变体或片段；PheA包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，且TyrB包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
在一些实施方式中，AroG由包含SEQ ID NO：22的核酸编码；AroK由包含SEQ IDNO：23的核酸编码；YdiB由包含SEQ ID NO：24的核酸编码；PheA由包含SEQ ID NO：25的核酸编码，且TyrB由包含SEQ ID NO：26的核酸编码。
根据本发明的实施方式，在一锅反应体系中，葡萄糖可以被催化成2-PE。
在一些实施方式中，基因工程细胞通过由DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)、苯丙氨酸解氨酶(AtPAL2)、苯基丙烯酸脱羧酶(AnPAD)、苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶、其变体、突变体或片段的过表达催化的反应从葡萄糖生产2-PE。
在一些实施方式中，将AroG替换为由包含SEQ ID NO：27的核酸编码的抗反馈抑制突变体AroG*，和/或将PheA替换为由包含SEQ ID NO：28的核酸编码的抗反馈抑制突变体PheA*。
在一些实施方式中，根据本发明任何方面的方法还包括crr和/或预苯酸脱氢酶(tyrA)基因的删除或失活。
在一些实施方式中，crr基因和/或tyrA基因被删除并被短的10-20bp长的双链DNA代替，其实例分别在SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中示出。在一些实施方式中，至少一种过表达的酶位于一个或多个质粒上。合适质粒的实例是T7表达质粒。
在本发明方法的一些实施方式中，一锅反应体系包括使用水性介质。
发现超过一定浓度的2-PE产生对基因工程细胞有毒，并且需要从发酵介质中分离和/或除去2-PE。这可以通过使用双相介质来实现。
在一些实施方式中，一锅反应体系包括使用双相介质。
在一些实施方式中，双相介质是水性:固体树脂介质。
在一些实施方式中，双相介质是水性:有机溶剂介质。
在一些实施方式中，一锅反应体系包括使用三相介质，该三相介质包括水性:有机溶剂:固体树脂介质。
在一些实施方式中，一锅反应体系包括使用三相介质，该三相介质包含水性:有机溶剂:官能化纳米颗粒介质。
在本发明的一方面，提供了一种或多种基因工程/重组原核或真核细胞，其选自包括细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞的组，其中所述细胞包含至少一种表达构建体和/或异源核酸分子，其编码从葡萄糖到取代或未取代的苯乙醛、2-苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺的途径中所需的至少一种催化酶。
根据本发明的第二方面，提供了基因工程细胞的分离株，其与野生型细胞相比，能够提高在一锅反应体系中取代或未取代的苯乙醛、2-苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺的生物生产，其中细胞过表达选自组(i)-(iv)的酶的组合，这些酶包括：
(i)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙醛的苯乙烯单加氧酶和苯乙烯氧化物异构酶；
(ii)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙酸的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和醛脱氢酶；
(iii)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的2-苯乙醇的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶；以及
(iv)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙胺的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和转氨酶。
在一些实施方式中，苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，苯乙烯氧化物异构酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，醛脱氢酶来自大肠杆菌或其突变体，醇脱氢酶来自酿酒酵母，以及转氨酶是来自紫色色杆菌或其突变体的ω-转氨酶。
在一些实施方式中，苯乙烯单加氧酶由SEQ ID NO：7和8所示的核酸序列编码；苯乙烯氧化物异构酶由SEQ ID NO：9所示的核酸序列编码；醛脱氢酶由SEQ ID NO：10所示的核酸序列编码；醇脱氢酶由SEQ ID NO：11所示的核酸序列编码，以及转氨酶是由SEQ IDNO：12所示的核酸序列编码的ω-转氨酶。
在相同的一锅反应体系中由L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸的转化提供苯乙烯或取代的苯乙烯可能是有利的。
因此，在一些实施方式中，相同或不同的基因工程细胞通过由解氨酶的过表达催化的脱氨反应和由脱羧酶的过表达催化的脱羧反应从L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸生产苯乙烯或取代的苯乙烯。
在优选的实施方式中，解氨酶是苯丙氨酸解氨酶，且脱羧酶是苯基丙烯酸脱羧酶。
在一些实施方式中，苯丙氨酸解氨酶是来自拟南芥的AtPAL2，其由SEQ ID NO：15所示的核酸序列编码，并且其中苯基丙烯酸脱羧酶是来自黑曲霉的AnPAD，其由SEQ ID NO：16所示的核酸序列编码。
在相同的一锅反应体系中通过催化葡萄糖提供用于生产苯乙烯的L-苯丙氨酸是有利的。
在一些实施方式中，相同或不同的基因工程细胞通过由选自包括DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)或其突变体的组中的至少一种酶的过表达催化的反应从葡萄糖产生L-苯丙氨酸。
在一些实施方式中，AroG由包含SEQ ID NO：22的核酸编码；AroK由包含SEQ IDNO：23的核酸编码；YdiB由包含SEQ ID NO：24的核酸编码；PheA由包含SEQ ID NO：25的核酸编码，且TyrB由包含SEQ ID NO：26的核酸编码。
根据本发明的实施方式，在一锅反应体系中葡萄糖可以被催化成2-PE。
在一些实施方式中，基因工程细胞通过由DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)、苯丙氨酸解氨酶(AtPAL2)、苯基丙烯酸脱羧酶(AnPAD)、苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶，其变体、突变体或片段的过表达催化的反应从葡萄糖生产2-PE。
在一些实施方式中，将AroG替换为由包含SEQ ID NO：27的核酸编码的抗反馈抑制突变体AroG*，和/或将PheA替换为由包含SEQ ID NO：28的核酸编码的抗反馈抑制突变体PheA*。
在其他实施方式中，根据本发明任何方面的分离株还包含crr和/或预苯酸脱氢酶(tyrA)基因的删除或失活。在一些实施方式中，crr基因和/或tyrA基因被删除并被短的10-20bp长的双链DNA代替，其实例分别在SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53中示出。
在一些实施方式中，本发明的基因工程细胞的分离株是含有必需酶的野生型菌株。优选地，所述细胞是基因工程细菌细胞。更优选地，所述细胞是大肠杆菌。
在一些实施方式中，基因工程细胞的分离株是共表达多种酶的重组大肠杆菌菌株。
应当理解，以上概述的方法通过将特定酶组合到单个反应体系中而起作用。
根据本发明的方面，提供了编码根据本发明的任何方面的至少一种催化酶的分离的核酸分子。更特别地，在一些实施方式中，本发明提供了编码选自组(i)-(iv)的至少一种异源催化酶的分离的核酸分子，异源催化酶包括：
(i)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙醛的苯乙烯单加氧酶和苯乙烯氧化物异构酶的核酸；
(ii)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙酸的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和醛脱氢酶的核酸；
(iii)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的2-苯乙醇的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶的核酸；以及
(v)编码用于从苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙胺的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和转氨酶的核酸。
在一些实施方式中，分离的核酸分子编码用于从L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸生成苯乙烯或取代的苯乙烯的选自苯丙氨酸解氨酶和苯基丙烯酸脱羧酶的至少一种异源催化酶。
在一些实施方式中，分离的核酸分子编码用于从葡萄糖产生L-苯丙氨酸的选自包括DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)或其突变体的组的至少一种异源催化酶。在一些实施方式中，将AroG替换为由包含SEQ ID NO：27的核酸编码的抗反馈抑制突变体AroG*，和/或将PheA替换为由包含SEQ ID NO：28的核酸编码的抗反馈抑制突变体PheA*。
应当理解，本发明这一方面的分离的核酸可以编码多种催化酶，其中至少一种是异源的。例如，多种催化酶被布置为选自模块(i)-(viii)的组中的至少一个模块，模块包括：
i)包含在表达时将苯乙烯或取代的苯乙烯酶促转化为取代或未取代的苯乙醛的异源核酸序列的模块；
ii)包含在表达时将苯乙烯或取代的苯乙烯酶促转化为取代或未取代的苯乙酸的异源核酸序列的模块；
iii)包含在表达时将苯乙烯或取代的苯乙烯酶促转化为取代或未取代的2-苯乙醇的异源核酸序列的模块；
iv)包含在表达时将苯乙烯或取代的苯乙烯酶促转化为取代或未取代的苯乙胺的异源核酸序列的模块；
v)包含在表达时将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸酶促转化为苯乙烯或取代的苯乙烯的异源核酸序列的模块；
vi)包含在表达时将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸酶促转化为取代或未取代的2-苯乙醇的异源核酸序列的模块；
vii)包含在表达时将葡萄糖酶促转化为L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸的异源核酸序列的模块；
viii)包含在表达时将葡萄糖酶促转化为取代或未取代的2-苯乙醇的异源核酸序列的模块。
特别地，分离的核酸分子可以编码：
i)SEQ ID NO：1、2、3和4、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的苯乙酸；和/或
ii)SEQ ID NO：1、2和3、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的苯乙醛；和/或
iii)SEQ ID NO：1、2、3和5、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的2-苯乙醇；和/或
iv)SEQ ID NO：1、2、3和6、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的苯乙胺；和/或
v)SEQ ID NO：13和14、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸转化为苯乙烯或取代的苯乙烯；和/或
vi)SEQ ID NO：1、2、3、5、13和14、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸转化为取代或未取代的2-苯乙醇；或
vii)SEQ ID NO：17、18、19、20、21、50和51、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将葡萄糖转化为L-苯丙氨酸；或
viii)SEQ ID NO：1、2、3、5、13、14、17、18、19、20、21、50和51、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将葡萄糖转化为取代或未取代的2-苯乙醇。
根据本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包含至少一种根据本发明的任何方面的基因工程细胞、表达构建体或分离的核酸。
附图说明
图1示出了从葡萄糖生产2-苯乙醇(2-PE)、苯乙醛(PA)、苯乙酸(PAA)和苯乙胺(PEA)的整体新型人工途径。
图2示出了L-Phe向苯乙烯的级联转化以及共表达AtPAL和AnPAD的中游模块1的基因结构。
图3示出了苯乙烯向苯乙醛(PA)的级联转化以及共表达SMO和SOI的下游模块2-1的基因结构。
图4示出了苯乙烯向2-苯乙醇(2-PE)的级联转化以及共表达SMO、SOI和ADH的下游模块2-2的基因结构。
图5示出了苯乙烯向苯乙胺(PEA)的级联转化以及共表达SMO、SOI、ω-TA和AlaDH的下游模块2-3的基因结构。
图6示出了苯乙烯向2-苯乙醇(2-PE)的级联转化以及共表达SMO、SOI和ALDH的下游模块2-4的基因结构。
图7a和7b示出了大肠杆菌(StyABC-PAR)(图7a)和大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)(b)的全细胞蛋白的SDS-PAGE分析。
图8示出了在KP缓冲液(200mM，pH 8，2％葡萄糖)和正十六烷(1:1)中，用大肠杆菌(StyABC-PAR)细胞(10g cdw L–1)将60mM Sty生物催化水合为2-PE的时间过程。
图9示出了在NaP缓冲液(200mM，pH 8，2％葡萄糖，200mM NH3/NH4Cl)和正十六烷(1:1)中用大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)细胞(10g cdw/L)将80mM Sty生物催化氢胺化为PEA的时间过程。
图10a和10b示出了质粒pRSF-StyABC-EcALDH的基因构建体(图10a)，以及共表达SMO(StyA&StyB)、SOI(StyC)和EcALDH的大肠杆菌(StyABC-EcALDH)的全细胞蛋白的SDS-PAGE分析(图10b)。
图11a至11e示出了用大肠杆菌(StyABC-EcALDH)细胞(10g cdw/L)将Sty生物转化为PAA的反应条件的优化。(图11a)使用不同有机相的生物转化；(图11b)使用不同水性缓冲液的生物转化；(图11c)使用不同葡萄糖浓度的生物转化；(图11d)不同温度下的生物转化；(图11e)使用不同比例的有机相:水性缓冲液的生物转化。
图12示出了在KP缓冲液(400mM，pH 8，0.5％葡萄糖)和油酸乙酯(1:1)中，用大肠杆菌(StyABC-EcALDH)细胞(15g cdw/L)将1300mM Sty生物催化氢胺化为PAA的时间过程。
图13a和13b示出了质粒pRSF-StyABC-ADH9v1的基因构建体(图13a)以及大肠杆菌(StyABC-EcALDH)(泳道1)和大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)(泳道2)的细胞蛋白的SDS-PAGE分析(图13b)。
图14示出了在含有各种量的葡萄糖的KP缓冲液(200mM，pH 8.0)和正十六烷(5:1)的两液相体系中使用不同量的大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)静息细胞，在30℃下将α-甲基苯乙烯(20mM)不对称级联氧化为(S)-2-苯基丙酸。
图15示出了12种构建的大肠杆菌重组菌株的筛选(10g cdw/L，用于在双相体系(正十六烷作为有机溶剂)中在2h内从L-苯丙氨酸(50mM)产生2-PE。
图16示出了不同树脂对2-PE和L-苯丙氨酸的吸附。所有树脂均以10％(w/v)使用。2-PE和-L-苯丙氨酸的初始浓度各自设定为在KP缓冲液(100mM，pH 8.0)中50mM，30℃下2h。值是一式三份的平均值，且误差条表示标准偏差值。
图17a和17b示出了在进行反应之前，在用不同浓度的2-PE处理大肠杆菌细胞(R-PAL-PAD_E-SMO-SOI-PAR)3小时的情况下的2-PE产物抑制测试(图17a)，并且示出了全细胞大肠杆菌(R-PAL-PAD_E-SMO-SOI-PAR)的表观动力学(图17b)。图17b的反应在水相为含有0.5％(w/v)葡萄糖、5g cdw/L的细胞悬浮液、10mM的L-苯丙氨酸和(●)0或(▲)3mM的2-PE的2ml KP缓冲液(100mM，pH 8.0)，以及有机相为正十六烷的情况下，在30℃和250rpm下完成。
图18a和18b示出了水性有机双相体系中的2-PE的分配系数(图18a)。分配系数在1:1的相比处测量。将KP缓冲液(100mM，pH 8.0)用作水性缓冲液。所有数据均通过HPLC分析从一式三份的平均值获得，并带有标准偏差。在所提到的所有各个有机溶剂中，观察到L-苯丙氨酸的K值均为～0，并且用含有0.5％葡萄糖和50mM L-苯丙氨酸的KP缓冲液(100mM，pH8.0)筛选7种不同的有机溶剂，用于从L-苯丙氨酸一锅法生产2-PE(图18b)。
图19a至19e示出了OA-MNP-PS的合成(图19a)，分别地OA-MNP的TEM和DLS(图19b和图19c)，以及分别地OA-MNP-PS的TEM和DLS(图19d和图19e)。
图20示出了不同树脂对2-PE和L-苯丙氨酸的吸附。所有树脂均以10％(w/v)使用。2-PE和L-苯丙氨酸的初始浓度各自设定为在KP缓冲液(100mM，pH 8.0)中50mM，30℃下2小时。值是一式三份的平均值，且误差条表示标准偏差值。
图21a至21c示出了(图21a)在1锅中经由萃取和MNP吸附来三相原位产物去除的情况下，将L-苯丙氨酸(50mM)生物转化为2-PE，(图21b)在1锅中经由萃取和XAD4树脂吸附来三相原位产物去除的情况下，将L-苯丙氨酸(50mM)生物转化为2-PE。使含有10g cdw/L的重悬细胞、50mM的L-苯丙氨酸和0.5％葡萄糖于KP缓冲液(100mM，pH 8)中的2ml水相与2ml有机相反应。添加不同类型的树脂(0.36g)或MNP(5mg/ml)进行生物转化，然后反应24h，并随后分离吸附剂、有机相和水相。(图21c)在一锅法中经由萃取和XAD4树脂吸附来三相原位产物去除的情况下，从100mM L-苯丙氨酸的2-PE生物转化的重复分批处理。将细胞(10g/l)重悬在含有0.5％葡萄糖和100mM初始底物浓度的新鲜缓冲液中，然后与新的有机溶剂和吸附剂混合以进行生物转化。
图22示出了大肠杆菌中从葡萄糖生产2-苯乙醇的方法的示意图。以粗体突出显示的基因被过表达，并且通过删除crr或tyrA而删除了叉号标记的途径。缩写：PTS，磷酸转移酶体系；EMP，埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯途径(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)；PPP，戊糖磷酸途径；G6P，葡萄糖-6-磷酸；PEP，磷酸烯醇丙酮酸；E4P，赤藓糖-4-磷酸；DAHP，3-脱氧-d-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸；DHQ，5-脱氢-奎尼酸；DHS，5-脱氢-莽草酸；SHIK，莽草酸；S3P，莽草酸-5-磷酸；EPSP，3-烯醇丙酮莽草酸-5-磷酸；CHO，分支酸；PPA，预苯酸；PPY，苯丙酮酸；L-Phe，L-苯丙氨酸；C酸，反式肉桂酸；Sty，苯乙烯；StyO，苯乙烯氧化物；PA，苯乙醛。
图23a和23b示出了由过表达L-苯丙氨酸生产途径的大肠杆菌突变体从葡萄糖生产L-苯丙氨酸。示出了在24h所有突变体的生长细胞的细胞密度和L-苯丙氨酸生产(图23a)以及在12h时T7-Phe和T7ΔΔ-Phe的高细胞密度生长细胞(图23b)。
图24示出了通过T7ΔΔ-Phe-Sty由葡萄糖产生2-PE的时间过程曲线。
图25a和25b示出了通过T7ΔΔ-Phe-Sty在双相介质中由葡萄糖生产2-PE。在双相介质中具有不同比例的M9培养基和油酸的情况下的细胞生长曲线(图25a)以及在24h时培养物的代谢产物(图25b)。
图26示出了通过T7ΔΔ-Phe-Sty在双相介质中从葡萄糖生物反应器规模生产2-PE的结果。仅在40h时测量有机相中的2-PE浓度。
具体实施方式
说明
为了方便起见，本说明书中提到的书目参考文献以参考文献列表的形式列出并且在实施例的末尾添加。这些书目参考文献的全部内容通过引用并入本文。
定义
为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。
本文所用的术语“氨基酸”或“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或其任何一种的片段，以及天然存在或合成的分子。本文所述的“氨基酸序列”是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列，“氨基酸序列”和类似术语并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白分子相关的完整天然氨基酸序列。
如本文所用，术语“包含”或“包括”应被解释为指定所提到的所述特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组件或其组的存在或增加。然而，在本公开的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由……组成”。词语“包含”(诸如“包含”和“包含”)和“包括”(诸如“包括”和“包括”)的变体具有相应变化的含义。
术语“分离”在本文中定义为生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已从生物体的细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA以及蛋白质)中基本分离、生产分离出来或纯化出来，在该生物体中该组分天然存在。因此，已分离的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质，以及化学合成的核酸。
本文所用的短语“核酸”或“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其任何片段，可为单链或双链的并且可以代表有义或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA，肽核酸(PNA)或任何类似DNA或类似RNA的物质。在本发明的上下文中，“片段”是指长度大于约60个核苷酸，并且最优选地长度为至少约100个核苷酸、至少约1000个核苷酸或至少约10,000个核苷酸的那些核酸序列，它们不是全长天然序列，但是保留了催化酶活性。
本文所用的术语“寡核苷酸”是指至少约6个核苷酸至60个核苷酸，优选约15至30个核苷酸，且最优选约20至25个核苷酸的核酸序列，其可用于PCR扩增或杂交测定或微阵列。如本文所用，术语“寡核苷酸”基本上相当于术语“扩增子”、“引物”、“寡聚物”和“探针”，这些术语在本领域中被通常定义。
术语“变体”和“突变体”在本文可互换使用。编码至少一种催化酶的至少一种核酸可以编码保留活性的示例性催化酶的变体或突变体。如本文所用，催化酶的“变体”是指被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。该变体可以具有“保守”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(例如，用异亮氨酸替代亮氨酸)。很少地，变体可具有“非保守”变化(例如，用色氨酸替代甘氨酸)。类似的微小变化也可以包括氨基酸删除或插入，或两者。使用本领域熟知的计算机程序，例如DNASTAR软件，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或删除而不丧失催化活性的指导。在一些实施方式中，变体酶在氨基酸水平上与本文所述的示例性氨基酸序列(例如醇脱氢酶、ω-转氨酶)或其功能片段——例如在成熟参考序列的长度的约：50、55、60、65、70、75、75、80、85、90、95或100％，优选至少90％的长度上，具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，优选至少90％的同源性或同一性，而仍保持催化活性。优选地，所述变体酶在氨基酸水平上具有至少90％的同一性并保持催化活性。示例性的醇脱氢酶由SEQ ID NO：5表示，且示例性的ω-转氨酶由SEQ ID NO：6表示。
本文所用的术语“苯乙醛还原酶”(PAR)和“醇脱氢酶”(ADH)可互换使用。
载体可以以适合在宿主细胞中表达该一种或多种核酸的形式包括一种或多种催化酶核酸。优选地，重组表达载体包括与要表达的一种或多种核酸序列可操作地连接的一个或多个调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的序列，以及组织特异性调控和/或诱导型序列，诸如本文实施例中公开的T7 IPTG诱导型启动子。表达载体的设计可以取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等的因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞，从而产生由本文所述的核酸编码的蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽(例如，催化酶蛋白、融合蛋白等)。
可以设计本发明的重组表达载体以在原核或真核细胞中表达催化酶蛋白。例如，本发明的多肽可以在细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel,(1990)Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.中进一步讨论。替代地，重组表达载体(一种或多种)可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核生物中的表达最常见的是用含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体通常在重组蛋白的氨基末端上向其中编码的蛋白质添加许多氨基酸。这种融合载体通常具有三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；和3)通过在亲和纯化中充当配体来帮助重组蛋白的纯化。通常，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，以使得在纯化融合蛋白之后能够将重组蛋白与融合部分分离。
最大化重组蛋白在大肠杆菌中的表达是在蛋白水解切割重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达该蛋白(Gottesman,S.,(1990)Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.119-128)。另一种策略是改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列，以使每个氨基酸的各个密码子是在大肠杆菌中优先使用的那些密码子(Wada et al.,(1992)Nucleic Acids Res.20:2111-2118)。本发明的核酸序列的这种改变可以通过已知的DNA合成技术进行，并且在实施例中进行了描述。
催化酶表达载体可以是酵母表达载体，用于在昆虫细胞中表达的载体，例如杆状病毒表达载体，用于在细菌细胞中表达的载体，例如质粒载体，或适合于在哺乳动物细胞中表达的载体。
当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能可由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
上文描述的方法利用酶催化一系列反应。尽管这些反应可以单独进行，或更特别地，将它们中的两个或更多个合并进行，但特别优选将所有反应合并到级联反应序列中，该级联反应序列以一锅法由起始原料提供产物，从而消除了分离中间体的需要，并有可能增加反应序列的总产率。这些级联反应可涉及在所述反应容器中使用选自由细胞、固定化细胞、细胞提取物、分离的酶和固定化酶组成的组的一种或多种反应性组分。
在本发明中，我们提出了新颖的生物催化路径(途径)，以由易于获得的生物基L-苯丙氨酸和葡萄糖生产“天然”2-PE、PA、PAA和PEA(图1)。路线(途径)是新颖的，且与天然途径明显不同。更重要的是，已知新途径中的酶非常有效。例如，我们已经证明了通过裂解酶和脱羧酶对L-苯丙氨酸的脱氨-脱羧可生产最高达15g/L的苯乙烯(关键中间体)。苯乙烯进一步转化为2-PE、PA、PAA和PEA类似于天然苯乙烯降解途径，这是众所周知的高效方法。重组大肠杆菌菌株经过工程化后可以大量且最佳比例地表达酶，因此是生物生产2-PE、PA、PAA和PEA的有效的全细胞催化剂。此外，进一步的工艺工程化将降低产物毒性并增加最终产物浓度。总而言之，我们的方法将是从生物基资源生产有价值的天然2-PE、PA、PAA和PEA的经济有效的方式。
整个路径分为三个部分：1)上游莽草酸途径，由葡萄糖生产L-Phe(图1)；2)中游脱氨-脱羧模块，将L-Phe转化为苯乙烯(图2)；3)下游模块，将苯乙烯分别官能化为2-PE、PA、PAA和PEA(图3-6)。生产L-Phe的上游莽草酸途径是众所周知的，并且已被工程化以生产高浓度(>50g/L)的L-Phe。我们最近证明了通过共表达来自拟南芥的苯丙氨酸解氨酶(AtPAL2)和来自黑曲霉的苯基丙烯酸脱羧酶(AnPAD)来将L-Phe转化为苯乙烯(Sty)的中游模块[Zhou,Y.,Wu,S.,Li,Z.Angew.Chem.Int.Ed.55:11647-11650(2016)]。在下游模块中，通过苯乙烯单加氧酶(SMO)在消耗氧气的情况下将Sty转化为苯乙烯氧化物(SO)。苯乙烯氧化物异构酶(SOI)用于转化SO以产生醛PA。在最后一步中，PA可以通过醛脱氢酶(ALDH)氧化为PAA，通过醛还原酶(例如PAR)/醇脱氢酶(ADH)还原为2-PE，或通过ω-转氨酶(ω-TA)胺化为PEA。优选地，这些多个反应在一个反应容器中同时或顺序地进行，从而允许直接从生物基L-Phe或葡萄糖绿色、有效且经济地生产2-PE、PA、PAA和PEA。因此，一锅法级联反应可以避免昂贵且耗能的中间体的分离和纯化，最小化废物的产生，并克服传统多步合成中可能存在的热力学障碍。优选地，多种酶在一个重组微生物菌株中共表达，并且该菌株的整个细胞直接用作直接发酵生产2-PE、PA、PAA和PEA的催化剂。替代地，这些酶或模块可以在几种细胞中分别表达、单独纯化或固定化，然后可以以一锅法将生物催化剂(酶、细胞、固定化酶和固定化细胞)混合在一起进行反应。例如，用于发酵生产L-Phe的重组菌株，以及用于通过设计的途径(中游和下游模块)将L-Phe分别直接转化为2-PE、PA、PAA和PEA的其他菌株。
在本发明的实施方式中，负责反应的所有酶在一个重组大肠杆菌菌株中共表达。在这种情况下，所有化学反应都在单个细胞内发生。为了构建重组生物催化剂，将这些酶作为几个人工操纵子或者单独地克隆到一个质粒或几个兼容质粒上。在将质粒转化到大肠杆菌菌株中后，多种酶被共表达，且整个重组细胞被用作级联反应的生物催化剂。可以调节和优化多种酶的表达水平，以实现有效的级联转化，而没有大量中间体的积累。有许多方法可以实现调节多种酶的表达水平：使用具有不同强度的不同质粒、诱导物、启动子或核糖体结合位点。
在优选的实施方式中，在水相中更好地进行级联转化。对于低浓度生物转化，水性一相体系可以满足要求，并且可以轻松获得最终产品。但是，中间体Sty和SO通常是疏水的(在水相中溶解度有限)，且对细胞和酶有毒(可能具有底物抑制)。因此，有机:水两相反应体系是高浓度生物转化的更好选择。Sty和SO在有机相中的溶解性更好，而二醇、氨基醇、氨基酸、细胞和酶大多在水相中。通过应用两相反应体系，解决了Sty和SO的低溶解度和抑制问题。
其他形式的生物催化剂也可用于合成2-PE、PA、PAA和PEA。它们包括分离的酶，固定在纳米或微米尺寸支撑物(诸如磁性纳米颗粒)上以增加其稳定性和可再用性的酶，野生型微生物细胞，以及固定在一些载体上的重组细胞。通过利用分离的酶、固定化酶或固定化细胞，可以进行级联生物催化以由生物基L-Phe或葡萄糖生产2-PE、PA、PAA和PEA。不同形式的生物催化剂的混合物也是进行级联生物催化的合适体系。
实施例
通常遵循本领域已知且未具体描述的标准分子生物学技术，如在Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs HarborLaboratory,New York(2012)中所描述的。
菌株、生化试剂和培养基
大肠杆菌T7表达细胞购自New England Biolabs。引物(DNA寡聚物)由IDT合成。Phusion DNA聚合酶、快速消化限制酶和T4 DNA连接酶购自Thermo Scientific。LB培养基、胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂从Biomed Diagnostics获得。氯霉素、链霉素、氨苄青霉素、卡那霉素和葡萄糖购自Sigma-Aldrich。IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)从GoldBiotechnology获得。
本研究中使用的培养基是补充有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)的标准M9培养基。该M9培养基含有6g/L Na2HPO4、3.0g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、1mMMgSO4、0.1mM CaCl2和1mL/L l-1痕量金属溶液。该痕量金属溶液含有8.3g/L FeCl3·6H2O、0.84g/L ZnCl2、0.13g/L CuCl2·2H2O、0.1g/L C℃l2·2H2O、0.1g/L H3BO3、0.016g/LMnCl2·4H2O和0.1g/L Na2MoO4·2H2O于1M HCl中。
SDS-PAGE分析和定量
将新鲜制备的大肠杆菌全细胞离心并重悬于DI水中至密度为8g cdw/L(OD600＝20)。将细胞悬液(60μL)与20μl的SDS样品缓冲液(具有DTT的4x Laemmli样品缓冲液，Bio-Rad)混合并加热至98℃，持续15min。将60μl的0.2g/L、0.1g/L和0.05g/L的BSA标准品也与20μL的SDS样品缓冲液混合，并加热至98℃，持续15min。然后将混合物离心(13000g)10min。使用10μL上清液将12％SDS-PAGE凝胶(手工铸制)加载到样品孔中。电泳在Mini-Proteantetra cell装置中进行，在100V下15min以及150V下75min。运行后，将PAGE凝胶用水洗涤，并然后根据说明用Bio-Safe Coomassie Stain(考马斯染色)(Bio-Rad)染色。该图用GS-900校准的密度计(Bio-Rad)获得，且定量分析用Image Lab软件(Bio-Rad)中的体积工具进行。
培养大肠杆菌细胞进行生物转化的一般程序
最初将大肠杆菌菌株接种在含有适当抗生素(50mg/L卡那霉素、50mg/L氯霉素、50mg/L链霉素、50mg/L氨苄青霉素)的LB培养基(1mL)中，在37℃下维持8-10h(280rpm)，并且然后转移到装有50mL的M9培养基的250mL三角烧瓶中，该M9培养基补充有葡萄糖(20g L-1)、酵母提取物(6g L-1)和适当的抗生素。将细胞继续在37℃和250rpm下生长约2h，以达到OD600为0.6，并然后添加IPTG(终浓度为0.5mM)以诱导酶表达。将细胞在22℃下进一步生长过夜(12-13h)，并通过离心(4000g，10min)收获。
化学品与材料
以下化学品购自Sigma–Aldrich：
Sty–m-OMe-Sty、α-Me-Sty、p-Me-α-Me-Sty、Sty氧化物、PA、PAA-p-OMe-PAA、rac-2-苯基丙酸-α,4-二甲基苯基乙酸、(S)-2-苯基丙酸、乙酸、油酸乙酯、正十六烷、卡那霉素、葡萄糖、NaCl、Na2SO4、Na2HPO4、NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、TFA、苯乙胺和苯甲醇。p-OMe-Sty来自Alfa Asear。油酸、p-F-α-Me-Sty和p-Cl-α-Me-Sty来自TCI Chemical。乙腈、乙酸乙酯、2-丙醇和正己烷从Tedia公司购得。正庚烷、硅胶60和TLC板购自Merck。LB培养基、酵母提取物和琼脂购自Biomed Diagnostics。DNA聚合酶、连接酶和限制酶购自Thermo Fisher。
分析方法
通过分光光度法(NanoDropTM,Thermo Fisher Scientific Inc.,Massachusetts,USA)测量600nm处的光密度(OD600)来监测细胞生长。通过配备有光电二极管阵列(DAD)检测器的高效液相色谱仪(Prominence,Shimadzu Corporation)测量代谢物，诸如L-Phe和2-PE。将培养基样品离心并过滤，并在反相条件下用30％乙腈和70％含0.1％TFA的超纯水通过Agilent Poroshell 120SB-C18柱(150×4.6mm，2.7μm)洗脱。流速：0.4ml/min，温度：25℃。检测器：光电二极管阵列检测器。波长：210nm。用2％乙腈和己烷通过Agilent ZORBAXRX-SIL柱(150×4.6mm，5μm)洗脱从油酸中提取的2-PE。补料分批发酵过程中的葡萄糖水平通过配备有折射率检测器的HPLC进行监测。使用Aminex-HPX87P柱(Biorad，美国)以超纯水作为流动相洗脱样品。
使用Agilent 7890A气相色谱(GC)分析2-PE(有机相)和苯乙烯。柱：Agilent HP-5(30m×0.32mm×0.25mm)。温度程序：初始温度为70℃，以25℃/min升至达到200℃；随后以50℃/min升至250℃，然后保持1分钟；最后，以20℃/min升至270℃。
使用JEOL JEM 2010透射电子显微镜(TEM-JEOL，美国)确定合成的MNP的尺寸和形态。使用zetasizer(Molvern)表征流体动力学直径和尺寸分布。
在25℃下在具有光电二极管阵列检测器和反相Agilent Poroshell 120SB-C18柱(150×4.6mm，2.7mm)的Shimadzu prominence HPLC系统上进行Sty-p-OMe-Sty的HPLC分析。流动相：具有0.1％TFA的50％水:50％乙腈。流速：0.5mLmin-1。通过将210nm处的峰面积与真正化合物的校准曲线上的峰面积进行比较来确定浓度。保留时间：苯乙胺(内标)3.2min、PAA 4.8min、o-F-PAA 5.0min、m-F-PAA 5.1min、p-F-PAA 5.0min、m-Cl-PAA6.0min、p-Cl-PAA 6.1min、m-Br-PAA 6.4min、p-Br-PAA 6.5min、m-Me-PAA 5.7min、p-Me-PAA 5.7min、m-OMe-PAA 4.8min、p-OMe-PAA 4.7min。
Sty–p-OMe-Sty、Sty氧化物和PA的GC-FID分析在配备FID检测器的Agilent 7890A气相色谱系统上进行。色谱柱：Agilent HP-5(30m×0.32mm×0.25mm)。温度程序：从70℃开始，以25℃min-1升至200℃，以50℃min-1升至250℃，保持1min，并然后以20℃min-1升至270℃。通过将峰面积与真正化合物的校正曲线上的峰面积进行比较来确定浓度。保留时间：苯甲醇(内标)2.8min、Sty 2.2min、o-F-Sty 2.2min、m-F-Sty 2.2min、p-F-Sty 2.2min、m-Cl-Sty 3.1min、p-Cl-Sty 3.1min、m-Br-Sty 3.5min、p-Br-Sty 3.5min、m-Me-Sty2.6min、p-Me-Sty 2.6min、m-OMe-Sty 3.4min、p-OMe-Sty 3.4min。
α-Me-Sty–p-Me-α-Me-Sty(浓度)的手性HPLC分析是在使用反相DaicelChiralpak AD-3R柱(150×4.6mm，3mm)的相同HPLC系统上在15℃下进行的。通过将210nm处的峰面积与真正化合物的校准曲线上的峰面积进行比较来确定浓度。
方法A：以1.0mLmin-1递送由具有0.1％TFA的80％水:20％乙腈组成的流动相。保留时间：苯甲醇(内标)5.8min、(R)-2-苯基丙酸13.9min、(S)-2-苯基丙酸14.6min、(R)-p-F-α-Me-PAA19.2min、(S)-p-F-α-Me-PAA 19.9min、(R)-p-ME-α-Me-PAA 32.3min、(S)-p-Me-α-Me-PAA 33.4min。
方法B：以1.0mLmin-1递送由具有0.1％TFA的70％水:30％乙腈组成的流动相。保留时间：苯甲醇(内标)3.8min、(R)-p-Me-α-Me-PAA 12.2min、(S)-p-Me-α-Me-PAA 13.0min。
(S)-2-苯基丙酸-(S)-p-Me-α-Me-PAA的ee值是使用Daicel Chiralpak ADH柱(250×4.6mm，5mm)通过另一种手性HPLC分析方法在25℃下测得的。以1.0mLmin-1递送由具有0.1％TFA的90％正己烷:10％2-丙醇组成的流动相。保留时间：(R)-2-苯基丙酸5.7min、(S)-2-苯基丙酸6.3min、(R)-p-F-α-Me-PAA 5.7min、(S)-p-F-α-Me-PAA 6.3min、(R)-p-Cl-α-Me-PAA 6.0min、(S)-p-Cl-α-Me-PAA 6.6min、(R)-p-Me-α-Me-PAA 5.7min、(S)-p-ME-α-ME-PAA 6.4min。
苯乙烯和取代的苯乙烯转化为2-苯乙醇类(2-PEs)、苯乙醛类(PAs)、苯乙酸类 (PAAs)和苯乙胺类(PEAs)
一个代表性实例是证明将(取代的)苯乙烯转化为(取代的)2-PE。以前，我们已经工程化了共表达来自苯乙烯降解假单胞菌属VLB120的SMO的大肠杆菌[Wu,S.,Chen,Y.,etal.,ACS Catal.4:409-420(2014)]。扩增SOI基因并与SMO构建在一起，以得到在质粒pRSFduet-1上的人工操纵子作为模块2-1(图3)。此外，将来自番茄的苯乙醛还原酶(PAR)基因[Tieman,D.M.,Loucas,H.M.,et al.,Phytochemistry 68:2660(2007)]与SMO-SOI一起进行工程化以得到人工操纵子，作为此项目中的模块2-2(图4)。转化含有模块2-2的质粒以得到大肠杆菌(StyABC-PAR)菌株，该菌株用作将Sty转化为2-PE的全细胞生物催化剂。通过SDS-PAGE分析检查酶的表达，并且所有酶均清晰可见(图7a)。通过使用10g cdw/L的大肠杆菌(StyABC-PAR)的静息细胞，在最初的3h内60mM的Sty被迅速转化为2-PE，且只有极少量的SO(0.3％)和PA(3％)在开始的1h内积累(图8)。反应结束时(8h)，以93％分析产率形成了所需的2-PE，几乎没有剩余Sty(2％)。重要的是，在生物转化中没有产生2-PE的另一种异构体1-苯乙醇。使用大肠杆菌(StyABC-PAR)将取代的Sty转化为取代的2-PE(表1)。以非常高的转化率(≥90％)生产了许多取代的2-PE：氟取代的2-PE(条目2-4)、甲基取代的2-PE(条目9、10)和甲氧基取代的2-PE(条目11、12)。以89-62％的良好转化率形成了具有氯(条目5、6)或溴(条目7、8)取代基的2-PE。重要的是，在生物转化中没有产生1-苯乙醇类。这证明了通过新途径将Sty有效转化为2-PE。
为了实现(取代的)Sty到(取代的)PEA的转化(图5)，构建了包含ω-TA和AlaDH的人工操纵子。将来自紫色色杆菌的CvTA的基因[Kaulmann,U.,Smithies,K.,et al.,EnzymeMicrob.Technol.41:628-637(2007)]和来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的AlaDH的基因组合以得到在质粒pCDFduet-1上的CvTA-AlaDH。将质粒pACYCduet-1上的SMO-SOI与上述质粒共转化到大肠杆菌(RARE)菌株中[11]，以得到共表达SMO、SOI、CvTA和AlaDH四种酶的重组大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)作为模块2-3。用大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)的静息细胞进行各种浓度的Sty转化，且对于75mM Sty实现了向PEA的高转化。在最初的4h内，80mM的Sty迅速转化为PEA，并且积累并转化了一些SO(最高达9％)和PA(最高达2％)(图9)。反应结束时(10h)，以93％转化率生成了胺PEA。值得注意的是，检测到醇副产物2-PE的量很小(0.6％)，表明化学选择性很高。另外，未观察到PEA的另一种异构体1-苯乙胺，表明极好的区域选择性。使用大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)将取代的Sty转化为取代的PEA(表2)。以94-99％的非常高的转化率生成了氟取代的PEA(条目2-4)、甲基取代的PEA(条目9、10)和甲氧基取代的PEA(条目11、12)。以86-45％的良好至中等的转化率形成了氯取代的PEA(条目5、6)和溴取代的PEA(条目7、8)。相对于醇，胺的化学选择性也非常高(均>20:1)，且区域选择性优异。通过进一步优化反应条件或使用更有效的酶可以改善当前体系。
另一个代表性实例是证明将(取代的)苯乙烯转化为(取代的)PAA。将来自大肠杆菌的苯乙醛脱氢酶(EcALDH)的基因[Ferrandez,A.,Prieto,M.A.,et al.,FEBS Lett.406:23(1997)]与SMO-SOI一起工程化以得到人工操纵子作为模块2-4(图6)。转化含有模块2-4的质粒以得到大肠杆菌(StyABC-EcALDH)菌株，该菌株被用作将Sty转化为PAA的全细胞生物催化剂。通过SDS-PAGE分析检查酶的表达，并且所有酶都清晰可见(图10(b)和图13(b))。通过探索不同的有机相、缓冲液、葡萄糖浓度、温度和两相的比例，发现了最佳的生物转化条件(图11)。在最佳条件下，15g cdw/L的大肠杆菌(StyABC-EcALDH)的静息细胞在6h内成功将130mM的Sty转化为122mM的PAA(总产率为94％)，并且在反应期间没有中间体的积累(图12)。使用大肠杆菌(StyABC-EcALDH)将取代的Sty转化为取代的2-PE(表3)。以非常高的转化率(≥90％)生成了许多取代的PAA：氟取代的PAA(条目2-4)、甲基取代的PAA(条目9、10)和甲氧基取代的PAA(条目11、12)。以87-78％的良好转化率形成了具有氯(条目5、6)或溴(条目7、8)取代基的PAA。这证明了重组大肠杆菌将Sty有效转化为PAA。
为了以很高的ee生产(S)-PAA，克隆了如[P.
Figure BDA0002354062380000291
H.Merkens,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.51:9914–9917(2012)]中报道的醇脱氢酶ADH9v1，其具有S选择性，用于外消旋PA的对映选择性氧化。合成ADH9v1的基因，并与styC和pRSF-StyAB一起构建以形成重组质粒pRSF-StyABC-ADH9v1(图13(a))。将该质粒转化到大肠杆菌T7表达菌株中以得到大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)。该菌株在与大肠杆菌(StyABC-EcALDH)的相同培养程序下生长并诱导。细胞蛋白的SDS-PAGE分析证实了StyA、StyB、StyC和ADH9v1的表达(图13(b)中的泳道2)。
下面提供示例性实施方式的进一步描述。
实施例1.含有模块2-1并表达SMO和SOI的大肠杆菌的基因工程化
首先合成编码来自假单胞菌属VLB120的SOI(SEQ ID NO：9)的styC基因，并根据公开的序列进行针对大肠杆菌的密码子优化。然后使用引物StyC-KpnI-RBS-F(CGGGTACCTAAGGAGATATATAATGTTACACGCGTTTGAACG TA AAATG；SEQ ID NO：29)和StyC-HindIII-XhoI-R(ACTGCTCGAGAAGCTTACTCGGCTGCCGCGTGTGGAACGGC TTTACG；SEQ ID NO：30)和Phusion DNA聚合酶(可从Thermo获得)对其进行扩增。将PCR产物用KpnI和XhoI双重酶切，并然后用T4DNA连接酶与相同酶切后的pRSF-SMO质粒连接[Wu,S.,Chen,Y.,et al.,ACS Catal.4:409-420(2014)]。将连接产物转化(热激)到大肠杆菌T7表达感受态细胞(可从New EnglandBiolabs获得)中，以得到pRSF-SMO-SOI。通过以下程序将该模块2-1亚克隆至其他三个载体。将模块2-1操纵子用引物StyA-BspHI-F(ACTGTC ATGAAAAAGCGTATCGGTATTGTTGG；SEQ IDNO：31)和StyC-HindIII-XhoI-R(ACTGCTCGAGAAGCTTACTCGGCTGCCGCGTGTGGAACGGC TTTACG；SEQ ID NO：30)扩增，用BspHI和XhoI酶切，并然后与双重酶切的pACYCduet、pCDFduet和pETduet(可从Novagen获得)连接。转化这些产物分别得到pACYC-SMO-SOI、pCDF-SMO-SOI和pET-SMO-SOI。
实施例2.含有模块2-2并表达SMO、SOI和PAR的大肠杆菌的基因工程化
首先合成编码来自番茄啤酒酵母的ADH(乙醇脱氢酶；SEQ ID NO：11)的pad基因，并根据公开的序列进行针对大肠杆菌的密码子优化。然后使用引物PAR-HindIII-RBS-F(ACTGAAGCTTTAAGGAGATATATAATGAGCGTGACCGCGAAA ACCGTG；SEQ ID NO：32)和PAR-XhoI-R(ACTGCTCGAGTCACATGCTTGAACTCCCG CCGAAA；SEQ ID NO：33)和Phusion DNA聚合酶(可从Thermo获得)对其进行扩增。将PCR产物用HindIII和XhoI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶与相同酶切后的pRSF-SMO-SOI质粒连接(参见实施例1)。将连接产物转化(热激)到大肠杆菌T7表达感受态细胞(可从New England Biolabs获得)中，以得到pRSF-SMO-SOI-PAR。通过以下程序将该模块2-2亚克隆至其他三个载体。将模块2-2操纵子用引物StyA-BspHI-F(ACTGTC ATGAAAAAGCGTATCGGTATTGTTGG；SEQ ID NO：31)和PAR-XhoI-R(ACTGCTCGAGTCACATGCTTGAACTCCCG CCGAAA；SEQ ID NO：33)扩增，用BspHI和XhoI酶切，并然后与双重酶切的pACYCduet、pCDFduet和pETduet(可Novagen获得)连接。转化这些产物分别得到pACYC-SMO-SOI-PAR、pCDF-SMO-SOI-PAR和pET-SMO-SOI-PAR。
实施例3.通过使用含有模块2-2并表达SMO、SOI和PAR的大肠杆菌经由级联生物催化由Sty生产2-PE
将含有质粒pRSF-SMO-SOI-PAR的重组大肠杆菌(StyABC-PAR)在1mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中。当OD600达到0.6时，添加0.5mM IPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12小时，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有2％葡萄糖(用于辅因子再生)的200mM KPB缓冲液(pH＝8.0)中至10gcdw/L。向2mL的水性体系中，将含有60mM Sty的2mL正十六烷添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在100mL烧瓶中进行反应8小时。反应期间取100μL水相样品，并通过反相HPLC(Agilent poroshell120EC-C18柱，乙腈:水＝50:50，且流速为0.5mL/min)进行分析以定量水相中2-PE的生产。在反应过程中取100μL有机相样品，并通过GC-FID(AgilentHP-5柱，以25℃/min从70℃升高至200℃，以50℃/min升高至250℃，保持1min，并然后以20℃/min升高至270℃)进行分析以量化有机相中的Sty、SO、PA、2-PE。由Sty生产了2-PE，在8h内获得的最佳结果为约56mM(93％产率)(图8)。该结果表明，构建的重组菌株是Sty向2-PE级联生物转化的有力催化剂。
实施例4.通过使用大肠杆菌(StyABC-PAR)经由级联生物催化从取代的Sty有效生产取代的2-PE
Figure BDA0002354062380000321
将大肠杆菌(StyABC-PAR)在1mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中。当OD600达到0.6时，添加0.5mM IPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12h，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有2％葡萄糖(用于辅因子再生)的200mM KPB缓冲液(pH＝8.0)中至10g cdw/L。向2mL的水性体系中，将含有20mM取代的Sty的2mL正十六烷添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在100mL烧瓶中进行反应8小时。反应期间取100μL水相样品，并通过反相HPLC(Agilent poroshell120EC-C18柱，乙腈:水＝50:50，且流速为0.5mL/min)进行分析以定量水相中取代的2-PE的生产。在反应过程中取100μL有机相样品，并通过GC-FID(Agilent HP-5柱，以25℃/min从70℃升高至200℃，以50℃/min升高至250℃，保持1min，并然后以20℃/min升高至270℃)进行分析以量化有机相中的取代的Sty、SO、PA、2-PE。如表1所示，所有12种取代的2-PE在8h内均以良好至优异的产率62-99％生产。这证明了级联生物转化体系的相对广泛的范围。
表1.用大肠杆菌(StyABC-PAR)将取代的苯乙烯转化为取代的2-PE。
Figure BDA0002354062380000331
Figure BDA0002354062380000341
实施例5.在100mL体系中通过使用大肠杆菌(StyABC-PAR)从(取代的)Sty制备(取代的)2-PE
将大肠杆菌(StyABC-PAR)在1mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中。在37℃下生长5h后，将50mL培养物扩展到2L含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中，并在37℃下继续培养。当OD600达到0.6时，添加0.5mMIPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12小时，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于含有2％葡萄糖的200mM KPB缓冲液(pH＝8.0)中至10gcdw/L。向50mL的水性体系中，将含有50mM Sty的50mL正十六烷添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在1L烧瓶中进行反应24小时。反应后，通过离心(4000g，15min)分离两相。将水相用50mL乙酸乙酯萃取三次，并将十六烷相用50mL水洗涤三次。合并洗涤水，并用100mL乙酸乙酯萃取两次。合并所有乙酸乙酯，经Na2SO4干燥并蒸发。将残余物通过快速色谱用正己烷:乙酸乙酯＝5:1进一步纯化。合并各级分并蒸发以得到253mg纯2-PE，分离产率为83％。使用类似的过程，p-氟-2-PE、p-甲基-2-PE和m-甲氧基-2-PE也被分离，产率分别为74％、66％和78％。
实施例6.含有模块2-3并表达SMO、SOI、CvTA和AlaDH的大肠杆菌的基因工程化
使用引物CvTA-BamHI-BspHI-F(ACTGGGATCCGATCATGATGCAAAAACAACGCACCACCTCAC；SEQ ID NO：35)和AlaDH-XhoI-R(ACTGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATGATTCA；SEQ ID NO:36)，从先前的模板pRSF-AlkJ-CvTA-AlaDH[Wu,S.,Zhou,Y.,et al.,Nat.Commun.7:11917(2016)]一起扩增了cvTA基因(编码CvTA：SEQ ID NO：12)和ald基因(编码AlaDH；SEQ IDNO：34)。将PCR产物用BspHI和XhoI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶连接到pCDF(用NcoI和XhoI酶切的)。将连接产物转化(热激)到大肠杆菌T7表达感受态细胞中以得到pCDF-CvTA-AlaDH。将pCDF-CvTA-AlaDH和pACYC-SMO-SOI质粒共转化到大肠杆菌RARE菌株的感受态细胞中[Kunjapur,A.M.,Tarasova,Y.,Prather,K.L.J.Am.Chem.Soc.136:11644-11654(2014)]以得到共表达SMO、SOI、CvTA和AlaDH的大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)。大肠杆菌RARE菌株的感受态细胞是根据以下方案制备的：将其在1mL LB培养基中于37℃下生长过夜；然后在37℃下将100μL培养物接种到含有适当抗生素的5mL新鲜LB培养基中，直到OD600达到0.5(约2h)；然后通过离心(2500g，10min，4℃)收获细胞，并重悬于冰上的1mL冷CaCl2溶液(0.1M)中。将细胞悬液保持在冰上并以90rpm摇动2h，并然后通过离心(2500g，8min，4℃)收获，并重悬于0.2-0.5mL冷CaCl2溶液(0.1M)中以获得感受态细胞。
实施例7.通过使用含有模块2-3并表达SMO、SOI、CvTA和AlaDH的大肠杆菌经由级联生物催化由Sty生产PEA
将重组大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)在1mL含有50mg/L氯霉素和50mg/L的链霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)、50mg/L氯霉素和50mg/L链霉素的M9培养基中。当OD600达到0.6时，添加0.5mM IPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12h，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有2％葡萄糖(用于辅因子再生)和200mM NH3-NH4Cl(pH 8.25)的200mM NaPB缓冲液(pH＝8.0)中至10g cdw/L。向2mL的水性体系中，将含有80mM Sty的2mL正十六烷添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在100mL烧瓶中进行反应10h。反应期间取100μL水相样品，并通过反相HPLC(Agilent Poroshell 120EC-C18柱，乙腈:水:TFA＝30:70:0.1，且流速为0.5mL/min)进行分析以定量水相中的PEA的生产。在反应过程中取100μL的有机相样品，并通过GC-FID(Agilent HP-5柱，以25℃/min从70℃升高至200℃，以50℃/min升高至250℃，保持1min，并然后以20℃/min升高至270℃)进行分析以量化有机相中的Sty、SO、PA、2-PE。由Sty生产PEA，且最好的结果是在10h内获得约74mM(93％产率)(图9)。该结果表明，我们构建的重组菌株是Sty向PEA级联生物转化的有力催化剂。
实施例8.通过使用大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)经由级联生物催化从取代的Sty有效生产取代的PEA
将大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)在1mL含有50mg/L氯霉素和50mg/L链霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L氯霉素和50mg/L链霉素的M9培养基中。当OD600达到0.6时，添加0.5mM IPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12h，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有2％葡萄糖(用于辅因子再生)和200mM NH3-NH4Cl(pH 8.25)的200mMNaPB缓冲液(pH＝8.0)中至10g cdw/L。向2mL的水性体系中，将含有20mM取代的Sty的2mL正十六烷添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在100mL烧瓶中进行反应10-24小时。反应期间取100μL水相样品，并通过反相HPLC(Agilent poroshell 120EC-C18柱，乙腈:水:TFA＝30:70:0.1，且流速为0.5mL/min)进行分析，以定量水相中取代的PEA的生产。在反应过程中取100μL的有机相样品，并通过GC-FID(Agilent HP-5柱，以25℃/min从70℃升高至200℃，以50℃/min升高至250℃，保持1min，并然后以20℃/min升高至270℃)进行分析以量化有机相中的取代的Sty、SO和PA。如表2所示，所有12种取代的PEA在10-24h内均以良好至优异的产率45-99％生产。这证明了级联生物转化的相对广泛的范围。
表2.用大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)将取代的苯乙烯转化为取代的PEA。
Figure BDA0002354062380000371
Figure BDA0002354062380000381
实施例9.在60mL体系中通过使用大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)从(取代的)Sty制备(取代的)PEA
将大肠杆菌(StyABC-CvTA-AlaDH)在1mL含有50mg/L氯霉素和50mg/L链霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L氯霉素和50mg/L链霉素的M9培养基中。在37℃下生长5h后，将50mL培养物扩展到2L含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L氯霉素和50mg/L链霉素的M9培养基中，并在37℃下继续培养。当OD600达到0.6时，添加0.5mM IPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12h，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有2％葡萄糖(用于辅因子再生)和200mM NH3-NH4Cl(pH 8.25)的200mM NaPB缓冲液(pH＝8.0)中至10g cdw/L。向50mL的水性体系中，将含有50mM Sty的10mL正十六烷添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在1L烧瓶中进行反应24h。反应后，通过离心(4000g，15min)分离两相。用NaOH将水相调节至pH＝13，并用50mL乙酸乙酯萃取三次。合并所有乙酸乙酯，经Na2SO4干燥并蒸发。将残余物通过快速色谱用二氯甲烷:甲醇:三乙胺＝100:5:1进一步纯化。合并各级分并蒸发以得到236mg纯PEA，分离产率为78％。使用类似的过程，p-氟-PEA、p-甲基-PEA和m-甲氧基-PEA也被分离，产率分别为68％、71％和82％。
实施例10.含有模块2-4并表达SMO、SOI和EcALDH的大肠杆菌的基因工程化
使用引物EcALDH-NotI-RBS-F(ACTGCGGCCGCTAAGGAGATATATAATGACAGAGCCGCATGTAGCAGTAT；SEQ ID NO：37)和EcALDH-XhoI-R(ACTG CTCGAG TTAATACCGTACACACACCGACTTAG；SEQ ID NO：38)和Phusion DNA聚合酶(可从Thermo获得)对编码来自大肠杆菌的EcALDH(苯乙醛还原酶；SEQ ID NO：10)的padA基因进行扩增。将PCR产物用NotI和XhoI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶与相同酶切后的pRSF-SMO-SOI质粒连接(参见实施例1)。将连接产物转化(热激)到大肠杆菌T7表达感受态细胞(可从New England Biolabs获得)中以得到pRSF-SMO-SOI-EcALDH。通过以下程序将该模块2-4亚克隆至其他三个载体。用引物StyA-BspHI-F(ACTGTCATGAAAAAGCGTATCGGTATTGTTGG；SEQ ID NO：31)和EcALDH-XhoI-R(ACTGCTCGAGTTAATACCGTACACACACCGACTTAG；SEQ ID NO：38)扩增模块2-4操纵子，用BspHI和XhoI酶切，并然后与双重酶切的pACYCduet、pCDFduet和pETduet(可从Novagen获得)连接。这些产物的转化分别得到pACYC-SMO-SOI-EcALDH、pCDF-SMO-SOI-EcALDH和pET-SMO-SOI-EcALDH。
实施例11.通过使用含有模块2-4并表达SMO、SOI和EcALDH的大肠杆菌经由级联生物催化由Sty生产PAA
将含有质粒pRSF-SMO-SOI-EcALDH的重组大肠杆菌(StyABC-EcALDH)在1mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中。当OD600达到0.6时，添加0.5mM IPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12hr，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有0.5％葡萄糖(用于辅因子再生)的400mM KPB缓冲液(pH＝8.0)中至15g cdw/L。向2mL的水性体系中，将含有130mM Sty的2mL油酸乙酯添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在100mL烧瓶中进行反应6h。反应期间取100μL水相样品，并通过反相HPLC(Agilent poroshell 120EC-C18柱，乙腈:水＝50:50，且流速为0.5mL/min)进行分析，以定量水相中PAA的生产。在反应过程中取100μL有机相样品，并通过GC-FID(Agilent HP-5柱，以25℃/min从70℃升高至200℃，以50℃/min升高至250℃，保持1min，并且然后以20℃/min升高至270℃)进行分析以量化有机相中的Sty、SO、PA。由Sty生产PAA，且最好的结果是在6h内获得约122mM(94％产率)(图12)。该结果表明，我们构建的重组菌株是Sty向PAA级联生物转化的有力催化剂。
实施例12.在48mL体系中通过使用大肠杆菌(StyABC-EcALDH)从(取代的)Sty制备(取代的)PAA
将大肠杆菌(StyABC-EcALDH)在1mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中在37℃下生长，并然后接种到50mL含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中。在37℃下生长5h后，将50mL培养物扩展到2L含有葡萄糖(20g/L)、酵母提取物(6g/L)和50mg/L卡那霉素的M9培养基中，并在37℃下继续培养。当OD600达到0.6时，添加0.5mMIPTG以诱导酶的表达。细胞在22℃下继续生长并表达蛋白质12小时，然后将它们通过离心(4000g，10min)收获。将细胞重悬于具有0.5％葡萄糖(用于辅因子再生)的400mM KPB缓冲液(pH＝8.0)中至15g cdw/L。向40mL的水性体系中，将含有25-100mM取代的Sty的8mL油酸乙酯添加至反应体系以形成第二相。在30℃和300rpm下在250ml三角烧瓶中进行反应10小时。反应期间取100μL水相样品，并通过反相HPLC(Agilent poroshell 120EC-C18柱，乙腈:水＝50:50，且流速为0.5mL/min)进行分析，以定量水相中取代的PAA的生产。如表3所示，所有12种取代的2-PE在10h内均以良好至优异的产率85-99％生产。这证明了级联生物转化的相对广泛的范围。反应之后，通过离心(4000g，15min)分离两相。用HCl将水相调节至pH＝2，并用100mL乙酸乙酯萃取两次。合并乙酸乙酯级分，经Na2SO4干燥并蒸发。通过快速色谱法纯化PAA。以82％的分离产率获得纯PAA(表3)。
表3.用大肠杆菌(StyABC-EcALDH)将取代的苯乙烯转化为取代的PAA。
Figure BDA0002354062380000411
Figure BDA0002354062380000421
实施例13.表达SMO、SOI和ADH9v1的大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)的基因工程化
使用引物ADH9v1-HindIII-RBS-F:ACTGAAGCTTTAAGGAGATATATCATGAAAAATCGTGTTGCCTTTGTTAC(SEQ ID NO：40)和ADH9v1-XhoI-R:ACTGCTCGAGTTAGTTAAACACCATACCACCAT(SEQ ID NO：41)以及Phusion DNA聚合酶(可从Thermo获得)对如[P.H.Merkens,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.51:9914–9917(2012)]中报道的编码ADH9v1的基因(SEQ IDNO:39)进行扩增。将PCR产物用HindIII和XhoI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶与相同酶切后的pRSF-SMO-SOI质粒连接(参见实施例1)。将连接产物转化(热激)到大肠杆菌T7表达感受态细胞(可从New England Biolabs获得)中，以得到大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)或(pRSF-SMO-SOI-ADH9v1)。
实施例14.用大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)从α-甲基苯乙烯衍生物制备(S)-2-芳基丙酸类
将新鲜制备的大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)细胞重悬于KP缓冲液(200mM，pH 8.0)中至20g cdw/L。在三角烧瓶(500mL)中，将100mL细胞悬液与10mL正十六烷混合。加入α-Me-Sty(2mmol)或p-F-α-Me-STy-p-Me-α-Me-Sty(0.5mmol)以开始反应，在300rpm和30 8℃下持续24h。通过离心(13000g，3min)分离水相样品(100mL)，用400mL TFA溶液(0.5％)和500mL乙腈(具有2mM苯甲醇)稀释，并通过手性HPLC分析以定量2-苯基丙酸-p-Me-α-Me-paa的浓度和ee。在反应结束时，对混合物进行离心(4000g，15min)以收集水相。用水(20mL)洗涤反应烧瓶、细胞和正十六烷。合并水相和洗涤水，用HCl调节至pH≤2，用NaCl饱和，并然后用乙酸乙酯萃取(3×100mL)。收集乙酸乙酯，经Na2SO4干燥，并通过使用旋转蒸发仪进行蒸发。将粗产物通过硅胶柱上的快速色谱纯化，洗脱液由5:1的正己烷:乙酸乙酯和乙酸(0.5％作为添加剂)组成(Rf＝0.2-0.3)。对收集的级分进行GC-FID分析以确认纯度。合并所需的级分，进行蒸发(加入正庚烷以通过形成共沸物除去乙酸)，并在真空下干燥过夜。
实施例15.用大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)从α-甲基苯乙烯衍生物一锅法合成(S)-芳基丙酸类
Figure BDA0002354062380000431
用大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)的静息细胞在不同条件下以小规模检查了α-甲基苯乙烯(20mM)的不对称级联氧化(图14)。在所有这些条件下，(S)-2-苯基丙酸的ee都极好(98-99％)，并且在静息细胞(20g cdw/L)和无葡萄糖的条件下实现了高转化率(80％)。
为了证明2-芳基丙酸的不对称合成的级联氧化，使用大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)静息细胞(20g cdw/L)在由100mL KP缓冲液和10mL正十六烷组成的较大体系中转化α-甲基苯乙烯(20mM)。反应24小时后，以82％转化率生产了(S)-2-苯基丙酸(表4)。后处理，用乙酸乙酯萃取，并通过快速色谱纯化，以65％的分离产率得到195mg纯(S)-2-苯基丙酸。(S)-2-苯基丙酸的ee极好(98％)。进一步应用级联生物氧化以在100mL KP缓冲液和10mL正十六烷的相同体系中转化环取代的α-甲基苯乙烯类(S)-p-F-α-Me-PAA–(S)-p-Me-α-Me-PAA(5mM)。以67-75％转化率成功生产了(S)-p-F-α-Me-PAA–(S)-α,4-二甲基苯基乙酸，并且相似的后处理、萃取和纯化得到了纯(S)-p-F-α-Me-PAA–(S)-p-Me-α-ME-PAA，分离收率为46-52％。(S)-4-F-α-Me-PAA和(S)-p-Me-α-Me-PAA的ee也是优异的(97-98％)，而(S)-p-Cl-α-Me-PAA的ee略低(92％)。这些结果清楚地表明，对于转化2-芳基丙烯类以得到(S)-2-芳基丙酸类，环氧化-异构化-氧化级联具有很高的区域选择性和立体选择性。到目前为止，这种独特的一锅法不对称氧化还没有化学上的类似方案。
表4.用大肠杆菌(StyABC-ADH9v1)由α-甲基苯乙烯衍生物一锅法合成(S)-芳基丙酸类
通过手性HPLC分析确定转化为4[％]和ee[％]。
由L-Phe一锅法生产天然2-PE
实施例16.含有模块1和模块2-2并表达PAL、PAD、SMO、SOI和PAR的大肠杆菌的基因工程化
选择来自拟南芥的AtPAL2进行L-苯丙氨酸的脱氨，而选择来自黑曲霉的AnPAD(fdc1和pad1)进行肉桂酸的脱羧。随后将两个基因一起克隆到兼容质粒中，以提供含有模块1的第一级联。
使用引物“AnFDC-BspHI-F:ACTGTCATGAGCGCGCAACCTGCGCACCTG”(SEQ ID NO：44)和“AnFDC-EcoRI-R:ACTGGAATTCTTAGTTACTGAAGCCCATTTTGGTC”(SEQ ID NO：45)与PhusionDNA聚合酶对具有编码AnPAD蛋白序列(SEQ ID NO：43)的核酸序列(SEQ ID NO：42)的AnFDC的合成基因(fdc1)进行扩增。将PCR产物用BspHI和EcoRI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶与NcoI和EcoRI酶切的pRSFDuet-1连接。将连接产物转化到大肠杆菌T7表达感受态细胞中以得到pRSF-AnFDC。另一方面，使用引物“AnPAD-EcoRI-RBS-F:ACTGGAATTCTAAGGAGATATATCATGTTCAACTCACTTCTGTC CGGC”(SEQ ID NO：46)和“AnPAD-PstI-R:ACTGCTGCAGTTATTTTTCCCAACCATTCCAACG”(SEQ ID NO：47)对具有编码AnPAD蛋白序列(SEQ ID NO：14)的核酸序列(SEQ ID NO：16)的AnPAD的合成基因(pad1)进行扩增。将PCR产物用EcoRI和PstI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶连接至相同酶切后的pRSF-AnFDC。将连接产物转化到大肠杆菌T7表达感受态细胞中以得到pRSF-PAD质粒。然后，使用引物“AtPAL-NdeI-F:
ACTGCATATGGATCAAATCGAAGCAATGTTGTG”(SEQ ID NO：48)和“AtPAL-XhoI-R:ACTGCTCGAGTTATTTTTCCCAACCATTCCAACG”(SEQ ID NO：49)从拟南芥的cDNA文库(购自ATCC77500)中对具有编码PAL蛋白序列(SEQ ID NO：13)的核酸序列(SEQ ID NO：15)的AtPAL2的基因进行扩增。将PCR产物用NdeI和XhoI双重酶切，并然后用T4 DNA连接酶连接至相同酶切后的pRSF-PAD。将连接产物转化到大肠杆菌T7表达感受态细胞中以得到pRSF-PAD-PAL质粒。通过以下程序将PAD-PAL也亚克隆至其他三个载体。用引物“AnFDC-BspHI-F:ACTGTCATGAGCGCGCAACCTGCGCACCTG”(SEQ ID NO：44)和“AtPAL-XhoI-R:ACTGCTCGAGTTATTTTTCCCAACCATTCCAACG”(SEQ ID NO：49)扩增PAD-PAL，用BspHI和XhoI酶切，并然后连接到NcoI和XhoI酶切的pACYCDuet-1、pCDFDuet-1和pETDuet-1。这些产物的转化分别得到pACYC-PAD-PAL、pCDF-PAD-PAL和pET-PAD-PAL。
对于含有模块2-2的第二级联，根据实施例2生产pRSF-SMO-SOI-PAR、pACYC-SMO-SOI-PAR、pCDF-SMO-SOI-PAR和pET-SMO-SOI-PAR。
为了在大肠杆菌菌株中获得相等的酶表达，分别使用4个不同的质粒pACYC、pCDF、pET和pRSF将全部5种主要酶分为2个不同的模块，即PAL-PAD和SMO-SOI-PAR。然后将十二种重组质粒转化到大肠杆菌T7感受态细胞中以提供12种大肠杆菌菌株，每种菌株共表达PAL、PAD、SMO、SOI和PAR。表5示出了模块1和模块2-2的质粒，模块1和模块2-2的组合质粒。
表5.使用不同质粒的两个模块(PAL_PAD和SMO_SOI_PAR)，表达PAL、PAD、SMO、SOI和PAR的重组大肠杆菌的工程化
实施例17.筛选用于生产2-PE的重组大肠杆菌
进行经由静息细胞生物转化的2-PE生产的一锅法合成以进一步测试所有这12种菌株的活性(表5)。细胞密度为10g cdw/L的含有50mM L-苯丙氨酸的KP缓冲液(磷酸钾，100mM，pH 8)用作初始底物，并以正十六烷作为有机相，总体积为4ml(1:1)。为了经由细胞代谢使NADH再生的目的，将葡萄糖(0.5％)加入反应混合物中。如图15所示，所有12种菌株均成功地生产了具有不同浓度的2-PE，由于基因剂量效应的差异，这将导致细胞生长中复制期间质粒拷贝数的差异。与所有其他11种菌株相比，含有pRSF-PAL-PAD_pET-SMO-SOI-PAR的大肠杆菌菌株具有最佳转化率，因此选择其进行进一步研究。
实施例18.2-PE产物抑制
除了迄今已报告的成就外，大多数2-PE生产还受到产物毒性的阻碍。高于2-3gr/L的2-PE浓度会抑制细胞，导致在生物转化结束时产物的低转化率。[Etschmann,M.,Bluemke,W.,et al.,J.Appl.Microbiol.Biotechnol.59:1-8；(2002)；Hua,D.,Xu,P.Biotechnol.Adv.29:654-660(2011)；Hua,D.L,Liang,X.H.,et al.,Asian J.Chem.25(11):5951-5954(2013)；Stark,D.,Zala,D.,et al.,Enzyme Microb Technol.32:212-223(2003)]2-PE将在生物转化过程中形成后引导至细胞膜，从而增加了膜流动性并降低了葡萄糖和底物的吸收[Seward,R.,Willets,J.C.,Dinsdale,M.G.,and Lloyd,D.J InstBrew.102:439-443(1996)]。由于2-PE的浓度过高，以前也曾报道过对大肠杆菌的蛋白质和RNA抑制[Luchini,J.J.,Corre,J.,and Cremieux,A.Res.Microbiol.141:499-510(1990)]。
通过向以正十六烷作为有机相在含有0.5％葡萄糖的KP缓冲液(100mM，pH 8.0)于水相中的大肠杆菌(pRSF-PAL-PAD_pET-SMO-SOI-PAR)的细胞悬液(10g cdw/L)添加不同浓度的2-PE，然后在30℃和250rpm下温育3h来研究产物抑制。
参考图17(a)，结果清楚地表明2-PE对细胞有毒并阻碍了2-PE的生产。在水相中高于30mM的2-PE浓度开始抑制生物转化，而当在进行生物转化之前用90mM 2-PE预处理细胞时，几乎没有观察到活性。在含有细胞悬浮液(10g cdw/l)、0.5％葡萄糖和50mM L-苯丙氨酸作为初始底物的KP缓冲液(100mM，pH 8.0)的水相中，而将正十六烷作为有机相(250rpm，2h，30℃)，进行生物转化。
为了进一步研究产物抑制，使用Lineweaver-Burk图测量并确定全细胞的表观动力学。为了确定动力学，使用3mM的2-PE浓度持续15min，因此可以忽略产物对细胞的毒性。示出了竞争性抑制(图16)，2-PE的表观Ki值为4.8mM。发现表观Vmax值为22.8μmol/min/gCDW，而表观Km值为2.57。
实施例19.分配2-PE的有机溶剂的筛选与选择
已经进行了通过萃取的原位产物去除技术，以从水相中去除获得的2-PE，并使它的浓度低于抑制水平。我们从二相体系中分配系数的分析开始，研究了不同类型的有机溶剂和离子液体，以由L-苯丙氨酸通过苯乙烯衍生的途径进行2-PE生产的萃取生物转化。通过分别将不同浓度的2-PE和L-苯丙氨酸与相应的有机溶剂一起添加到KP缓冲液(100mM，pH8.0)中，确定有机相和水相中产物和底物系数分配。将反应混合物温育1h(280rpm，30℃)。
图18(a)中的结果表明，使用的大多数有机溶剂都能够从水相中萃取2-PE。通过>>>1的K值示出，这表明大部分2-PE被萃取到有机相中。然而，正十六烷似乎具有较低的分配系数，因此降低了萃取效率。
为了确定有机溶剂对生物催化剂的生物相容性，进行了进一步的研究。通过利用各个有机溶剂，使用在含有0.5％葡萄糖和50mM L-Phe的KP缓冲液(100mM，pH 8.0)中的大肠杆菌细胞沉淀(pRSF-PAL-PAD_pET-SMO-SOI-PAR，10g cdw/L)进行生物转化24h(280rpm，30℃)。从图18(b)中可以看出，结果表明用于生物转化的所有有机溶剂都是生物相容的，并且可以提高2-PE生产最高达150％。生物柴油被证明是最好的有机溶剂，且这可以从生物转化24h后获得的最高2-PE清楚地看出。除了正十六烷外，在生物催化剂进行反应的同时，所有使用的有机溶剂也仍然能够萃取2-PE。这清楚地证实了萃取生物转化能够显着提高2-PE的生产率。
实施例20.纳米固体吸附剂的制备与表征
研究了由氧化铁芯和表面上的苯环官能团组成的磁性吸附剂的使用。为了保护氧化铁芯，使用聚苯乙烯包被OA-MNP。
OA-MNP-PS的合成如图19a所示。发现OA-MNP和OA-MNP-PS的直径分别为12nm和118nm，以及流体动力学尺寸分别为23nm和180nm(图19c和19e)。通过磁力或离心(30min,13000g)来完成分离。通过分析由疏水相互作用对合成的MNP的产物吸附来进行研究。
实施例21.吸附剂筛选
原位产物吸附(ISPA)可以用作原位产物去除(ISPR)替代技术，其中采用树脂或其他吸附介质以最小化2-PE产物抑制。当在生物转化过程中使用大孔树脂D101时，产品浓度增加，最高达6.2g/l。然而，ISPA还受到诸如对2-PE的低的特异性和吸附能力的限制[Mei,J.,Min,H.,and Lu,Z.Process Biochemistry.44:886-890(2009)]。
使用了七种不同的吸附剂，包括OA-MNP-PS。如图20所示，水相中的2-PE浓度保持在抑制水平以下，这很清楚地证实了大多数2-PE是通过疏水作用吸附到吸附剂表面的。对L-苯丙氨酸的吸附能力明显低于2-PE，这是由于其亲水性结构。由于XAD4树脂具有交联的疏水性聚苯乙烯结构、较高的表面积、较低的孔隙率以及其去除药物中的疏水性化合物的应用，因此与所测试的所有其他5种微小尺寸树脂相比，XAD4树脂具有最佳性能。出人意料的是，使用MNP作为纳米级吸附剂使得对2-PE具有良好的选择性。
实施例22.在一锅法中通过萃取和吸附使用原位产物去除(ISPR)三相级联生物转化L-苯丙氨酸成2-PE
选择XAD4树脂(0.36g)或OA-MNP-PS(5mg/ml)作为吸附剂，与油酸一起，已证明其在双相体系中提供了最佳的萃取生物转化(实施例18)。用重悬于含有0.5％葡萄糖和50mML-苯丙氨酸的KP缓冲液(100mM，pH 8.0)中的大肠杆菌静息细胞(pRSF-PAL-PAD_pET-SMO-SOI-PAR，10g cdw/L)进行三相生物转化，水性与有机的比例为1:1，总体积为4ml。如图21(a)和21(b)所示，在生物转化24h后，与所有其他有机溶剂相比，油酸给出最高的产物转化率。向体系中添加XAD4树脂和OA-MNP-PS进一步提高了2-PE的生产率，其中分别获得了45mM(≈5.5g/l)和40mM(～4.9g/l)的2-PE。当初始底物增加到100mM时，在单一批次中使用相同体系(未示出)分别生产了70mM(～8.6g/l)和65mM(～8g/l)的2-PE。这些结果是以前没有添加吸附剂进行的生物转化的2倍高。尽管OA-MNP-PS对2-PE的特异性不如XAD4高，但油酸的存在也被证明可以改善MNP三相体系。
为了进行重复的分批生物转化，将细胞重悬于含有0.5％葡萄糖和相同初始底物浓度的新鲜缓冲液中，并与新的有机溶剂和吸附剂混合以进行生物转化。如图21(c)所示，该体系可以从其前一批次保留最高达83％以生产2-PE(每批次12h)。在7个批次(84h)内累计获得了250mM的2-PE(～31g/l)，是迄今为止达到的最高2-PE生产之一。
由葡萄糖微生物生产2-PE
实施例23.用于L-Phe过量生产的天然生物合成途径的工程化
由葡萄糖生产2-PE的方案如图22所示。改善L-Phe生产的关键酶被确定为DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)。据报道，在L-Phe和/或L-酪氨酸的存在下，AroG和PheA的活性受到抑制，并且报道了两种酶的抗反馈抑制突变体[Liu,S.-P.,et al.ProcessBiochemistry.48(3):413-419(2013)]。而且，所有这些关键酶的表达都受到反馈调节。
克隆AroG*(SEQ ID NO：27)、aroK、ydiB、pheA*(SEQ ID NO：28)和tyrB，并使用强启动子在T7菌株(T7-Phe)中过表达。
通过PCR从大肠杆菌MG1655基因组DNA中扩增用于过量生产L-Phe的过表达和删除的基因。pCDFDuet用于aroG*、aroK、ydiB、pheA*和tyrB基因的过表达。将基因aroG*、aroK、ydiB克隆到多克隆位点-1中，并将pheA*和tyrB克隆到多克隆位点-2中。两个过表达质粒用于苯乙烯介导的途径基因。如实施例15中所述，将pRSFDuet用于PAL、FDC和PAD的过表达，并且将pETDuet用于styABC和PAR的过表达。
基因删除方法：
使用同源重组和Link等人发明的pKOV载体进行crr和tyrA的染色体缺失[Link,A.J.,Phillips,D.,&Church,G.M.Journal of bacteriology,179(20):6228-6237(1997)]。pKOV质粒是从George Church作为礼物获得的(Addgene质粒#25769)。简而言之，使用～600bp的靶基因的上游和下游DNA碱基对为基因置换提供足够的同源性。靶基因被随机的10-20bp长的双链DNA取代。包含侧翼为600bp上游和下游基因核苷酸序列的短双链DNA的crr基因和tyrA基因删除序列分别示于SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53。置换'10-20bp'长度双链DNA插入片段分别位于SEQ ID NO：52和53的核苷酸位置619-635和598-610。
通过使用氯霉素作为选择标记使含有重组pKOV质粒的大肠杆菌T7菌株在42℃下生长，从而将重组pKOV质粒整合到染色体中。在用插入片段成功置换目标DNA后，使用PCR确认删除。此外，使用蔗糖作为选择压力从染色体上去除质粒序列，并通过PCR和DNA测序确认删除。在单一突变体中执行了相似的方法以删除其他基因并创建双重突变体。
表6.实施例23至实施例26中构建的菌株和质粒的列表
Figure BDA0002354062380000531
关键酶的过表达导致通过T7-Phe菌株的L-Phe产量增加(图23(a))。在24h内生产了～2mM L-Phe，而含有空质粒(T7)的T7菌株未生产任何可检测量的L-Phe。另外，未观察到生长的显著差异。
为了进一步提高L-Phe生产，尝试了改善前体可用性的工作。一种方法是通过删除crr限制PEP在PTS体系中的使用。如图22(a)所示，crr的删除显著改善了细胞生长，但降低了L-Phe生产。据信，降低的葡萄糖摄取速率是L-Phe生产降低的原因。
改善前体可用性的第二个靶标是预苯酸脱氢酶(TyrA)。TyrA将预苯酸(L-Phe的前体)转化为酪氨酸。因此，删除了tyrA(T7ΔT)并在T7ΔT-Phe中研究了L-Phe生产。如图23(a)所示，即使细胞生长减少，但也观察到L-Phe生产显著增加，最高达5mM。
出乎意料的是，双突变体T7ΔΔ-Phe可以生产～13mM L-Phe，其为T7-Phe的～6倍高(图23(a))。
由于T7ΔΔ-Phe细胞生长相对较低，因此通过在富培养基(LB肉汤)中生长T7-Phe和T7ΔΔ-Phe 6h来进行简短实验，以增加细胞密度，并转移到M9培养基，起始OD600为～5(图23(b))。在此实验中，在12h内可达到20OD600的细胞密度，其为以前实验的～4倍高，并在发酵12h内可获得16mM的L-Phe。这一有希望的结果还表明，优化培养基和培养条件以增加细胞生长可以提高L-Phe的生产率。
实施例24.L-Phe生产菌中苯乙烯介导的2-PE生产途径的过表达
在从葡萄糖成功过量生产L-Phe后，尝试使用苯乙烯介导的途径酶将L-Phe转化为2-PE(图22)。将按照实施例2制备的重组质粒pRSFDuet-PAL-FDC-PAD和pETDuet-styABC-PAR转化到L-Phe生产菌株(T7ΔΔ-Phe)中，并将所得重组菌株命名为T7ΔΔ-Phe-Sty。
通过T7ΔΔ-Phe-Sty从葡萄糖生产2-PE在摇瓶中进行24h。T7ΔΔ-Phe-Sty可以直接从葡萄糖生产1.3mM 2-PE，且在发酵结束时还存在2.5mM未转化的L-Phe(图24)。
实施例25.使用原位产物去除改善2-PE生产
2-PE和L-Phe的低产量以及L-Phe的积累也可能是由于2-PE的毒性所致，参见实施例23。因此，测试了在不同比例的M9培养基和油酸(v:v)(诸如1:0.25、1:0.5和1:1)的双相介质中，通过T7ΔΔ-Phe-Sty从葡萄糖生产2-PE中的原位2-PE去除。
如图24所示，引入双相介质显示出增加的生长速率，证实了2-PE在细胞生长期间的抑制作用。与对照(仅M9培养基)相比，双相介质的所有三种培养在指数期均显示出增加的生长速率(图24(a))。但是，只有1:0.25在发酵结束时显示出增加的细胞密度，这表明油酸也可能由于其表面活性剂性质或通过干扰氧转移而抑制细胞生长。
如图25(b)所示，代谢物分析表明，所有四种培养物均产生相似量的L-Phe和2-PE，但2-PE在水相和有机相中的分布不同。1:1培养显示从培养基中完全萃取出2-PE，而在1:0.25和1:0.5培养中，水相中存在0.4和0.2mM 2-PE。该结果表明，在选择双相体系中有机相的比例时，应考虑细胞生长与2-PE萃取之间的权衡。在不同时间点添加少量有机相可能是去除2-PE而不影响细胞生长的更好策略。
实施例26.生物反应器规模中用于2-PE生产的工程菌的评价
为了了解T7ΔΔ-Phe-Sty从葡萄糖生产2-PE的潜力，使用双相介质进行了生物反应器规模的发酵。生物反应器可以促进达到更高滴度所需的高细胞密度。
在3L生物反应器中用1L的2x M9培养基进行生物反应器规模的发酵。通过间歇补料500g L-1葡萄糖溶液将葡萄糖维持在50-200mM之间。从发酵10h开始，在6h时添加0.1mMIPTG，并每8h添加100mL油酸。诱导之后，生长温度从30℃转变为22℃。
如图26所示，细胞生长呈线性增长并持续增长直至发酵结束，这可能是由于从培养基中不断去除2-PE所致。诱导后L-Phe浓度开始增加，并从18h开始保持在～3mM，而2-PE浓度从同一时间点开始增加。发酵40h时，水相和有机相中的2-PE浓度分别为2和17mM。水相中仅2mM 2-PE的存在表明了通过油酸有效地原位去除2-PE。在非优化条件下发酵40h结束时，由葡萄糖生产了总共19mM 2-PE(2.3g/L)。
参考资料
本说明书中任何显然在先出版的文件的列表或讨论都不必视为承认该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> 假单胞菌属（pseudomonas sp.）VLB120
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<221> MISC_FEATURE
<223> 苯乙烯单加氧酶, StyA 部分的氨基酸序列
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<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
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<221> MISC_FEATURE
<223> 醇脱氢酶的氨基酸序列
<400> 5
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165 170 175
Phe Val Lys Glu Lys Gly Ile Asp Met Val Val Val Asn Pro Ala Met
180 185 190
Val Ile Gly Pro Leu Leu Gln Pro Thr Leu Asn Thr Ser Ser Ala Ala
195 200 205
Val Leu Ser Leu Val Asn Gly Ala Glu Thr Tyr Pro Asn Ser Ser Phe
210 215 220
Gly Trp Val Asn Val Lys Asp Val Ala Asn Ala His Ile Leu Ala Phe
225 230 235 240
Glu Asn Pro Ser Ala Asn Gly Arg Tyr Leu Met Val Glu Arg Val Ala
245 250 255
His Tyr Ser Asp Ile Leu Lys Ile Leu Arg Asp Leu Tyr Pro Thr Met
260 265 270
Gln Leu Pro Glu Lys Cys Ala Asp Asp Asn Pro Leu Met Gln Asn Tyr
275 280 285
Gln Val Ser Lys Glu Lys Ala Lys Ser Leu Gly Ile Glu Phe Thr Thr
290 295 300
Leu Glu Glu Ser Ile Lys Glu Thr Val Glu Ser Leu Lys Glu Lys Lys
305 310 315 320
Phe Phe Gly Gly Ser Ser Ser Met
325
<210> 6
<211> 459
<212> PRT
<213> 紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> w-转氨酶, CvTA的氨基酸序列
<400> 6
Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala
1 5 10 15
His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly
20 25 30
Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu
35 40 45
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val
50 55 60
Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu
65 70 75 80
Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val
85 90 95
Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp
100 105 110
Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile
115 120 125
Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro
165 170 175
Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly
180 185 190
Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu
195 200 205
Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val
210 215 220
Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu
245 250 255
Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe
260 265 270
Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys
290 295 300
Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val
325 330 335
Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile
340 345 350
Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu
355 360 365
His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg
405 410 415
Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg
420 425 430
Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala
450 455
<210> 7
<211> 1284
<212> DNA
<213> 假单胞菌属VLB120
<220>
<221> misc_feature
<223> 苯乙烯单加氧酶, StyA部分的DNA序列
<400> 7
atgaaaaagc gtatcggtat tgttggtgca ggcactgccg gcctccatct tggtctcttc 60
cttcgtcagc atgacgtcga cgtcactgtg tacactgatc gtaagcccga tgagtacagc 120
ggactgcgtc tcctgaatac cgttgctcac aacgcggtga cggtgcagcg ggaggttgcc 180
ctcgacgtca atgagtggcc gtctgaggag tttggttatt tcggccacta ctactacgta 240
ggtgggccgc agcccatgcg tttctacggt gatctcaagg ctcccagccg tgcagtggac 300
taccgtctct accagccgat gctgatgcgt gcactggaag ccaggggcgg caagttctgc 360
tacgacgcgg tgtctgccga agatctggaa gggctgtcgg agcagtacga tctgctggtt 420
gtgtgcactg gtaaatacgc cctcggcaag gtgttcgaga agcagtccga aaactcgccc 480
ttcgagaagc cgcaacgggc actgtgcgtt ggtctcttca agggcatcaa ggaagcaccg 540
attcgcgcgg tgactatgtc cttctcgcca gggcatggcg agctgattga gattccaacc 600
ctgtcgttca atggcatgag cacagcgctg gtgctcgaaa accatattgg tagcgatctg 660
gaagttctcg cccacaccaa gtatgacgat gacccgcgtg cgttcctcga tctgatgctg 720
gagaagctgg gtaagcatca tccttccgtt gccgagcgca tcgatccggc tgagttcgac 780
cttgccaaca gttctctgga catcctccag ggtggtgttg tgccggcatt ccgcgacggt 840
catgcgaccc tcaataacgg caaaaccatc attgggctgg gcgacatcca ggcaactgtc 900
gatccggtct tgggccaggg cgcgaacatg gcgtcctatg cggcatggat tctgggcgag 960
gaaatccttg cgcactctgt ctacgacctg cgcttcagcg aacacctgga gcgtcgccgc 1020
caggatcgcg tgctgtgtgc cacgcgatgg accaacttca ctctgagcgc tctctcggca 1080
cttccgccgg agttcctcgc cttccttcag atcctgagcc agagccgtga aatggctgat 1140
gagttcacgg acaacttcaa ctacccggaa cgtcagtggg atcgcttctc cagcccggaa 1200
cgtatcggac agtggtgcag tcagttcgca cccactatcg cggcctgatg gtgcagtcag 1260
ttcgcaccca ctatcgcggc ctga 1284
<210> 8
<211> 513
<212> DNA
<213> 假单胞菌属VLB120
<220>
<221> misc_feature
<223> 苯乙烯单加氧酶, StyB部分的DNA序列
<400> 8
atgacgttaa aaaaagatat ggcggtggat atcgactcca ccaacttccg ccaggcggtt 60
gcattgttcg cgacgggaat tgcggttctc agcgcggaga ctgaagaggg cgatgtgcac 120
ggcatgaccg tgaacagttt cacctccatc agtctggatc cgccgactgt gatggtttcc 180
ctgaaatcgg gccgtatgca tgagttgctg actcaaggcg gacgcttcgg agttagcctc 240
ttgggtgaaa gccagaaggt gttctcggca ttcttcagca agcgcgcgat ggatgacacg 300
cctccccccg ccttcaccat tcaggccggc cttcccactc tgcagggcgc catggcctgg 360
ttcgaatgcg aggtggagag cacggttcaa gtacacgacc acacgctctt cattgcgcgc 420
gttagcgcct gtggaacgcc tgaggcgaat accccccagc cgctgctgtt ctttgccagc 480
cgttatcacg gcaacccgtt gccactgaat tga 513
<210> 9
<211> 510
<212> DNA
<213> 假单胞菌属VLB120
<220>
<221> misc_feature
<223> 苯乙烯氧化物异构酶, SOI的DNA序列
<400> 9
atgttacacg cgtttgaacg taaaatggca gggcatggaa ttctgatgat tttttgtaca 60
ctgttgtttg gagtcggcct gtggatgaac cttgtgggcg ggttcgaaat catccccggt 120
tacattatcg aattccatgt tccggggagt cccgaaggtt gggcacgtgc tcatagcggc 180
ccggcactga acggcatgat ggtcattgcc gtcgcgttcg ttctgccatc cctgggcttc 240
gcagacaaaa ccgcacgtct gctgggttcg atcattgttc tggatggctg gtccaatgtg 300
gggttctacc tgtttagcaa cttttcgcct aaccgtggcc tgacctttgg cccgaaccag 360
tttggaccgg gtgatatttt ctcatttctg gctctcgccc cggcgtacct gttcggcgtg 420
ctggctatgg gcgccctcgc ggtgatcggt tatcaggcgt tgaaatctac ccgcagccgt 480
aaagccgttc cacacgcggc agccgagtaa 510
<210> 10
<211> 1500
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 醛脱氢酶, EcALDH的DNA序列
<400> 10
atgacagagc cgcatgtagc agtattaagc caggtccaac agtttctcga tcgtcaacac 60
ggtctttata ttgatggtcg tcctggcccc gcacaaagtg aaaaacggtt ggcgatcttt 120
gatccggcca ccgggcaaga aattgcgtct actgctgatg ccaacgaagc ggatgtagat 180
aacgcagtca tgtctgcctg gcgggccttt gtctcgcgtc gctgggccgg gcgattaccc 240
gcagagcgtg aacgtattct gctacgtttt gctgatctgg tggagcagca cagtgaggag 300
ctggcgcaac tggaaaccct ggagcaaggc aagtcaattg ccatttcccg tgcttttgaa 360
gtgggctgta cgctgaactg gatgcgttat accgccgggt taacgaccaa aatcgcgggt 420
aaaacgctgg acttgtcgat tcccttaccc cagggggcgc gttatcaggc ctggacgcgt 480
aaagagccgg ttggcgtagt ggcgggaatt gtgccatgga actttccgtt gatgattggt 540
atgtggaagg tgatgccagc actggcagca ggctgttcaa tcgtgattaa gccttcggaa 600
accacgccac tgacgatgtt gcgcgtggcg gaactggcca gcgaggctgg tatccctgat 660
ggcgttttta atgtcgtcac cgggtcaggt gctgtatgcg gcgcggccct gacgtcacat 720
cctcatgttg cgaaaatcag ttttaccggt tcaaccgcga cgggaaaagg tattgccaga 780
actgctgctg atcacttaac gcgtgtaacg ctggaactgg gcggtaaaaa cccggcaatt 840
gtattaaaag atgctgatcc gcaatgggtt attgaaggct tgatgaccgg aagcttcctg 900
aatcaagggc aagtatgcgc cgccagttcg cgaatttata ttgaagcgcc gttgtttgac 960
acgctggtta gtggatttga gcaggcggta aaatcgttgc aagtgggacc ggggatgtca 1020
cctgttgcac agattaaccc tttggtttct cgtgcgcact gcgacaaagt gtgttcattc 1080
ctcgacgatg cgcaggcaca gcaagcagag ctgattcgcg ggtcgaatgg accagccgga 1140
gaggggtatt atgttgcgcc aacgctggtg gtaaatcccg atgctaaatt gcgcttaact 1200
cgtgaagagg tgtttggtcc ggtggtaaac ctggtgcgag tagcggatgg agaagaggcg 1260
ttacaactgg caaacgacac ggaatatggc ttaactgcca gtgtctggac gcaaaatctc 1320
tcccaggctc tggaatatag cgatcgctta caggcaggga cggtgtgggt aaacagccat 1380
accttaattg acgctaactt accgtttggt gggatgaagc agtcaggaac gggccgtgat 1440
tttggccccg actggctgga cggttggtgt gaaactaagt cggtgtgtgt acggtattaa 1500
<210> 11
<211> 987
<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<220>
<221> misc_feature
<223> 醇脱氢酶的DNA序列
<400> 11
atgagcgtga ccgcgaaaac cgtgtgtgtt accggcgcca gcggctacat cgcctcttgg 60
cttgtaaagt ttctgttgca ctcgggttat aacgttaaag cgtcagtccg cgatccgaac 120
gacccgaaaa aaacgcagca cctgctgtct ctgggcggcg cgaaagaacg gctgcacctg 180
ttcaaagcga atctgctgga agaaggttcg ttcgatgcgg ttgttgacgg ttgcgaaggt 240
gtgttccata ccgcgtcccc tttctactat tctgtaaccg atccgcaggc cgagcttctg 300
gatccggcag taaaaggcac tctgaacctg ctcggttcct gtgctaaagc gccttcagtt 360
aagcgtgtag tgctcaccag cagcatcgct gccgttgcgt actctggtca accacgtact 420
cctgaagtag tagtggatga atcgtggtgg acgtctcctg attattgtaa agaaaaacag 480
ctgtggtacg tcttaagtaa aacgctggcg gaagatgcgg cttggaaatt tgtgaaagaa 540
aaggggattg acatggtcgt tgtaaatcct gcaatggtca ttggaccgtt actgcagcca 600
accctcaata cgagcagcgc cgcggtgctg tctcttgtaa acggggcgga aacatatcct 660
aatagctctt tcggctgggt taatgtcaaa gatgtggcga atgcccacat tcttgccttt 720
gaaaacccaa gcgccaacgg ccgttacttg atggttgaac gtgttgcgca ctatagcgac 780
atcctgaaaa tcctccgcga cctgtaccct actatgcaat tgcctgaaaa atgtgcagat 840
gataacccgc tgatgcagaa ttaccaggtc tcaaaagaaa aagcgaaatc actgggcatc 900
gaatttacta ctcttgagga aagtattaaa gaaacagtag aatccttgaa agaaaaaaaa 960
tttttcggcg ggagttcaag catgtga 987
<210> 12
<211> 1380
<212> DNA
<213> 紫色色杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> w-转氨酶, CvTA的DNA序列
<400> 12
atgcaaaaac aacgcaccac ctcacaatgg cgcgaactgg atgccgcaca ccacctgcac 60
ccgtttaccg acaccgcaag cctgaatcag gccggcgccc gtgttatgac ccgcggcgaa 120
ggtgtgtatc tgtgggattc tgagggtaac aaaattatcg acggcatggc tggtctgtgg 180
tgcgttaatg tcggctatgg tcgtaaagat tttgccgaag cggcccgtcg ccaaatggaa 240
gaactgccgt tctacaacac ctttttcaaa accacgcatc cggcggtggt tgaactgagc 300
agcctgctgg cggaagttac gccggccggc tttgatcgtg tgttctatac caattcaggt 360
tcggaaagcg tggatacgat gatccgcatg gttcgtcgct actgggacgt ccagggcaaa 420
ccggaaaaga aaaccctgat cggtcgttgg aacggctatc atggttctac gattggcggt 480
gcaagtctgg gcggtatgaa atacatgcac gaacagggcg atctgccgat tccgggtatg 540
gcgcatatcg aacaaccgtg gtggtacaaa cacggcaaag atatgacccc ggacgaattt 600
ggtgtcgtgg cagctcgctg gctggaagaa aaaattctgg aaatcggcgc cgataaagtg 660
gcggcctttg ttggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggccacc 720
tattggccgg aaattgaacg tatctgccgc aaatacgatg ttctgctggt cgcagacgaa 780
gttatttgtg gctttggtcg taccggcgaa tggttcggtc atcagcactt tggcttccaa 840
ccggacctgt ttacggcagc taaaggcctg agttccggtt atctgccgat cggcgccgtc 900
ttcgtgggta aacgcgttgc agaaggtctg attgctggcg gtgattttaa tcatggcttc 960
acctatagcg gtcacccggt ctgtgcggcc gtggcacatg ctaatgtggc agctctgcgt 1020
gacgaaggca tcgtgcagcg cgttaaagat gacattggtc cgtatatgca aaaacgttgg 1080
cgcgaaacgt ttagccgttt cgaacacgtc gatgacgtgc gcggcgttgg tatggtccag 1140
gcatttaccc tggtgaaaaa taaagctaaa cgcgaactgt ttccggattt cggcgaaatt 1200
ggtacgctgt gccgtgacat ctttttccgc aacaatctga ttatgcgtgc gtgtggtgat 1260
cacattgtta gcgccccgcc gctggttatg acccgcgcag aagtcgacga aatgctggcc 1320
gtggcggaac gctgcctgga agaatttgaa cagaccctga aagctcgtgg cctggcgtaa 1380
<210> 13
<211> 717
<212> PRT
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 苯丙氨酸解氨酶, AtPAL的氨基酸序列
<400> 13
Met Asp Gln Ile Glu Ala Met Leu Cys Gly Gly Gly Glu Lys Thr Lys
1 5 10 15
Val Ala Val Thr Thr Lys Thr Leu Ala Asp Pro Leu Asn Trp Gly Leu
20 25 30
Ala Ala Asp Gln Met Lys Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Lys Met
35 40 45
Val Glu Glu Tyr Arg Arg Pro Val Val Asn Leu Gly Gly Glu Thr Leu
50 55 60
Thr Ile Gly Gln Val Ala Ala Ile Ser Thr Val Gly Gly Ser Val Lys
65 70 75 80
Val Glu Leu Ala Glu Thr Ser Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser Asp
85 90 95
Trp Val Met Glu Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val Thr
100 105 110
Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Asn Gly Thr Ala
115 120 125
Leu Gln Thr Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly Asn
130 135 140
Thr Lys Glu Thr Cys His Thr Leu Pro Gln Ser Ala Thr Arg Ala Ala
145 150 155 160
Met Leu Val Arg Val Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg
165 170 175
Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Ser Leu Leu Asn His Asn Ile Ser
180 185 190
Pro Ser Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly His Leu Val
195 200 205
Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys
210 215 220
Ala Thr Gly Pro Asp Gly Glu Ser Leu Thr Glu Lys Glu Ala Phe Glu
225 230 235 240
Lys Ala Gly Ile Ser Thr Gly Phe Phe Asp Leu Gln Pro Lys Glu Gly
245 250 255
Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala Ser Met
260 265 270
Val Leu Phe Glu Ala Asn Val Gln Ala Val Leu Ala Glu Val Leu Ser
275 280 285
Ala Ile Phe Ala Glu Val Met Ser Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp His
290 295 300
Leu Thr His Arg Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala
305 310 315 320
Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Met Lys Leu Ala Gln
325 330 335
Lys Val His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr
340 345 350
Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile
355 360 365
Arg Gln Ala Thr Lys Ser Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp
370 375 380
Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn
385 390 395 400
Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala
405 410 415
Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val
420 425 430
Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Thr Ala Ser Ser
435 440 445
Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala
450 455 460
Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Tyr Leu Ala Asn Pro Val Thr Ser His
465 470 475 480
Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu
485 490 495
Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Asp Ile Leu Lys Leu Met
500 505 510
Ser Thr Thr Phe Leu Val Gly Ile Cys Gln Ala Val Asp Leu Arg His
515 520 525
Leu Glu Glu Asn Leu Arg Gln Thr Val Lys Asn Thr Val Ser Gln Val
530 535 540
Ala Lys Lys Val Leu Thr Thr Gly Ile Asn Gly Glu Leu His Pro Ser
545 550 555 560
Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Lys Val Val Asp Arg Glu Gln Val
565 570 575
Phe Thr Tyr Val Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met Gln
580 585 590
Arg Leu Arg Gln Val Ile Val Asp His Ala Leu Ser Asn Gly Glu Thr
595 600 605
Glu Lys Asn Ala Val Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Gly Ala Phe Glu
610 615 620
Glu Glu Leu Lys Ala Val Leu Pro Lys Glu Val Glu Ala Ala Arg Ala
625 630 635 640
Ala Tyr Gly Asn Gly Thr Ala Pro Ile Pro Asn Arg Ile Lys Glu Cys
645 650 655
Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Arg Phe Val Arg Glu Glu Leu Gly Thr Lys
660 665 670
Leu Leu Thr Gly Glu Lys Val Val Ser Pro Gly Glu Glu Phe Asp Lys
675 680 685
Val Phe Thr Ala Met Cys Glu Gly Lys Leu Ile Asp Pro Leu Met Asp
690 695 700
Cys Leu Lys Glu Trp Asn Gly Ala Pro Ile Pro Ile Cys
705 710 715
<210> 14
<211> 227
<212> PRT
<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 苯基丙烯酸脱羧酶, AnPAD的氨基酸序列
<400> 14
Met Phe Asn Ser Leu Leu Ser Gly Thr Thr Thr Pro Asn Ser Gly Arg
1 5 10 15
Ala Ser Pro Pro Ala Ser Glu Met Pro Ile Asp Asn Asp His Val Ala
20 25 30
Val Ala Arg Pro Ala Pro Arg Arg Arg Arg Ile Val Val Ala Met Thr
35 40 45
Gly Ala Thr Gly Ala Met Leu Gly Ile Lys Val Leu Ile Ala Leu Arg
50 55 60
Arg Leu Asn Val Glu Thr His Leu Val Met Ser Lys Trp Ala Glu Ala
65 70 75 80
Thr Ile Lys Tyr Glu Thr Asp Tyr His Pro Ser Asn Val Arg Ala Leu
85 90 95
Ala Asp Tyr Val His Asn Ile Asn Asp Met Ala Ala Pro Val Ser Ser
100 105 110
Gly Ser Phe Arg Ala Asp Gly Met Ile Val Val Pro Cys Ser Met Lys
115 120 125
Thr Leu Ala Ala Ile His Ser Gly Phe Cys Asp Asp Leu Ile Ser Arg
130 135 140
Thr Ala Asp Val Met Leu Lys Glu Arg Arg Arg Leu Val Leu Val Ala
145 150 155 160
Arg Glu Thr Pro Leu Ser Glu Ile His Leu Arg Asn Met Leu Glu Val
165 170 175
Thr Arg Ala Gly Ala Val Ile Phe Pro Pro Val Pro Ala Phe Tyr Ile
180 185 190
Lys Ala Gly Ser Ile Glu Asp Leu Ile Asp Gln Ser Val Gly Arg Met
195 200 205
Leu Asp Leu Phe Asp Leu Asp Thr Gly Asp Phe Glu Arg Trp Asn Gly
210 215 220
Trp Glu Lys
225
<210> 15
<211> 2154
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> misc_feature
<223> 苯丙氨酸解氨酶, AtPAL的DNA序列
<400> 15
atggatcaaa tcgaagcaat gttgtgcggc ggaggagaga agacaaaagt ggcggttact 60
acgaagactt tggcagatcc attgaattgg ggtttagcag cggatcaaat gaaaggaagt 120
catttagatg aagtgaagaa gatggtcgaa gagtatcgta gaccagtcgt gaatcttggc 180
ggagaaacac tgacgatcgg acaagttgct gccatctcca ccgtaggagg cagcgttaag 240
gttgagttag cggagacttc aagagccggt gtgaaagcta gcagtgattg ggttatggag 300
agcatgaaca aaggtactga cagttacgga gtcaccaccg gctttggtgc tacttctcac 360
cggagaacca aaaacggcac cgcattacaa acagaactca ttagattttt gaacgccgga 420
atattcggaa acacgaagga gacatgtcac acactgccgc aatccgccac aagagccgcc 480
atgctcgtca gagtcaacac tcttctccaa ggatactccg ggatccgatt cgagatcctc 540
gaagcgatta caagtctcct caaccacaac atctctccgt cactacctct ccgtggaacc 600
attaccgcct ccgggcatct cgttcctctc tcttacatcg ccggacttct caccggccgt 660
cctaattcca aagccaccgg tcccgacggt gaatcgctaa ccgagaaaga agcttttgag 720
aaagccggaa tcagtactgg attcttcgat ttacaaccta aggaaggttt agctctcgtt 780
aatggcacgg cggttggatc tggaatggcg tcgatggttc tattcgaagc gaatgtccaa 840
gcggtgttag cggaggtttt atcagcgatc ttcgcggagg ttatgagcgg gaaacctgag 900
tttaccgatc atctgactca tcgtttaaaa catcatcccg gacaaatcga agcggcggcg 960
ataatggagc acatactcga cggaagctca tacatgaaat tagctcaaaa ggttcacgag 1020
atggatccat tgcagaaacc aaaacaagat cgttacgctc ttcgtacatc tcctcaatgg 1080
ctaggtcctc aaattgaagt aatccgtcaa gctacgaaat cgatagagcg tgaaatcaac 1140
tccgttaacg ataatccgtt gatcgatgtt tcgaggaaca aggcgattca cggtggtaac 1200
ttccaaggaa caccaatcgg agtttctatg gataacacga gattggcgat tgctgcgatt 1260
gggaagctaa tgtttgctca attctctgag cttgttaatg atttctacaa caatggactt 1320
ccttcgaatc taactgcttc gagtaatcca agtttggatt atggattcaa aggagcagag 1380
attgctatgg cttcttattg ttctgagctt caatacttgg ctaatccagt cacaagccat 1440
gttcaatcag ctgagcaaca taatcaagat gtgaactctc ttggtttgat ctcgtctcgt 1500
aaaacatctg aagctgtgga tattcttaag ctaatgtcaa caacgttcct tgtggggata 1560
tgtcaagctg ttgatttgag acatttggag gagaatctga gacaaactgt gaagaacaca 1620
gtttctcaag ttgctaagaa agtgttaacc actggaatca acggtgagtt acatccgtca 1680
aggttttgcg agaaggactt gcttaaggtt gttgatcgtg agcaagtgtt cacgtatgtg 1740
gatgatcctt gtagcgctac gtacccgttg atgcagagac taagacaagt tattgttgat 1800
cacgctttgt ccaacggtga gactgagaag aatgcagtga cttcgatctt tcaaaagatt 1860
ggagcttttg aagaggagct taaggctgtg cttccaaagg aagttgaagc ggctagagcg 1920
gcttatggga atggaactgc gccgattcct aaccggatta aggaatgtag gtcgtatccg 1980
ttgtataggt tcgtgaggga agagcttgga acgaagttgt tgactggaga aaaggttgtg 2040
tctccgggag aggagtttga taaggtcttc actgctatgt gtgaaggtaa acttattgat 2100
ccgttgatgg attgtctcaa ggaatggaac ggagctccga ttccgatttg ctaa 2154
<210> 16
<211> 687
<212> DNA
<213> 黑曲霉
<220>
<221> misc_feature
<223> 苯基丙烯酸脱羧酶, AnPAD的DNA序列
<400> 16
atgatgttca actcacttct gtccggcact actacaccaa actccggccg tgcaagccct 60
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cgccgtcgca tcgtggttgc aatgaccggt gcaacgggtg caatgctggg cattaaagtg 180
ctgatcgccc tgcgtcgcct gaacgtcgaa acccacctgg tgatgagtaa atgggcagaa 240
gctaccatta aatatgaaac ggattaccat ccgtcaaatg tgcgcgcgct ggccgattat 300
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ctgatcgacc agtcggtggg tcgcatgctg gacctgtttg atctggacac cggcgacttc 660
gaacgttgga atggttggga aaaataa 687
<210> 17
<211> 350
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> DAHP合酶AroG的氨基酸序列
<400> 17
Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala
20 25 30
Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys
35 40 45
Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His
50 55 60
Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu
85 90 95
Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His
100 105 110
Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe
130 135 140
Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly
145 150 155 160
Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr
180 185 190
Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys
195 200 205
Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser
210 215 220
Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala
245 250 255
Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser
260 265 270
Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln
275 280 285
Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His
290 295 300
Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr
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Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala
325 330 335
Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly
340 345 350
<210> 18
<211> 173
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 莽草酸激酶AroK的氨基酸序列
<400> 18
Met Ala Glu Lys Arg Asn Ile Phe Leu Val Gly Pro Met Gly Ala Gly
1 5 10 15
Lys Ser Thr Ile Gly Arg Gln Leu Ala Gln Gln Leu Asn Met Glu Phe
20 25 30
Tyr Asp Ser Asp Gln Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Ala Asp Val Gly
35 40 45
Trp Val Phe Asp Leu Glu Gly Glu Glu Gly Phe Arg Asp Arg Glu Glu
50 55 60
Lys Val Ile Asn Glu Leu Thr Glu Lys Gln Gly Ile Val Leu Ala Thr
65 70 75 80
Gly Gly Gly Ser Val Lys Ser Arg Glu Thr Arg Asn Arg Leu Ser Ala
85 90 95
Arg Gly Val Val Val Tyr Leu Glu Thr Thr Ile Glu Lys Gln Leu Ala
100 105 110
Arg Thr Gln Arg Asp Lys Lys Arg Pro Leu Leu His Val Glu Thr Pro
115 120 125
Pro Arg Glu Val Leu Glu Ala Leu Ala Asn Glu Arg Asn Pro Leu Tyr
130 135 140
Glu Glu Ile Ala Asp Val Thr Ile Arg Thr Asp Asp Gln Ser Ala Lys
145 150 155 160
Val Val Ala Asn Gln Ile Ile His Met Leu Glu Ser Asn
165 170
<210> 19
<211> 288
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 莽草酸脱氢酶YdiB的氨基酸序列
<400> 19
Met Asp Val Thr Ala Lys Tyr Glu Leu Ile Gly Leu Met Ala Tyr Pro
1 5 10 15
Ile Arg His Ser Leu Ser Pro Glu Met Gln Asn Lys Ala Leu Glu Lys
20 25 30
Ala Gly Leu Pro Phe Thr Tyr Met Ala Phe Glu Val Asp Asn Asp Ser
35 40 45
Phe Pro Gly Ala Ile Glu Gly Leu Lys Ala Leu Lys Met Arg Gly Thr
50 55 60
Gly Val Ser Met Pro Asn Lys Gln Leu Ala Cys Glu Tyr Val Asp Glu
65 70 75 80
Leu Thr Pro Ala Ala Lys Leu Val Gly Ala Ile Asn Thr Ile Val Asn
85 90 95
Asp Asp Gly Tyr Leu Arg Gly Tyr Asn Thr Asp Gly Thr Gly His Ile
100 105 110
Arg Ala Ile Lys Glu Ser Gly Phe Asp Ile Lys Gly Lys Thr Met Val
115 120 125
Leu Leu Gly Ala Gly Gly Ala Ser Thr Ala Ile Gly Ala Gln Gly Ala
130 135 140
Ile Glu Gly Leu Lys Glu Ile Lys Leu Phe Asn Arg Arg Asp Glu Phe
145 150 155 160
Phe Asp Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Arg Val Asn Glu Asn Thr Asp
165 170 175
Cys Val Val Thr Val Thr Asp Leu Ala Asp Gln Gln Ala Phe Ala Glu
180 185 190
Ala Leu Ala Ser Ala Asp Ile Leu Thr Asn Gly Thr Lys Val Gly Met
195 200 205
Lys Pro Leu Glu Asn Glu Ser Leu Val Asn Asp Ile Ser Leu Leu His
210 215 220
Pro Gly Leu Leu Val Thr Glu Cys Val Tyr Asn Pro His Met Thr Lys
225 230 235 240
Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gln Ala Gly Cys Lys Thr Ile Asp Gly Tyr
245 250 255
Gly Met Leu Leu Trp Gln Gly Ala Glu Gln Phe Thr Leu Trp Thr Gly
260 265 270
Lys Asp Phe Pro Leu Glu Tyr Val Lys Gln Val Met Gly Phe Gly Ala
275 280 285
<210> 20
<211> 386
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA的氨基酸序列
<400> 20
Met Thr Ser Glu Asn Pro Leu Leu Ala Leu Arg Glu Lys Ile Ser Ala
1 5 10 15
Leu Asp Glu Lys Leu Leu Ala Leu Leu Ala Glu Arg Arg Glu Leu Ala
20 25 30
Val Glu Val Gly Lys Ala Lys Leu Leu Ser His Arg Pro Val Arg Asp
35 40 45
Ile Asp Arg Glu Arg Asp Leu Leu Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Lys
50 55 60
Ala His His Leu Asp Ala His Tyr Ile Thr Arg Leu Phe Gln Leu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Ser Val Leu Thr Gln Gln Ala Leu Leu Gln Gln His Leu
85 90 95
Asn Lys Ile Asn Pro His Ser Ala Arg Ile Ala Phe Leu Gly Pro Lys
100 105 110
Gly Ser Tyr Ser His Leu Ala Ala Arg Gln Tyr Ala Ala Arg His Phe
115 120 125
Glu Gln Phe Ile Glu Ser Gly Cys Ala Lys Phe Ala Asp Ile Phe Asn
130 135 140
Gln Val Glu Thr Gly Gln Ala Asp Tyr Ala Val Val Pro Ile Glu Asn
145 150 155 160
Thr Ser Ser Gly Ala Ile Asn Asp Val Tyr Asp Leu Leu Gln His Thr
165 170 175
Ser Leu Ser Ile Val Gly Glu Met Thr Leu Thr Ile Asp His Cys Leu
180 185 190
Leu Val Ser Gly Thr Thr Asp Leu Ser Thr Ile Asn Thr Val Tyr Ser
195 200 205
His Pro Gln Pro Phe Gln Gln Cys Ser Lys Phe Leu Asn Arg Tyr Pro
210 215 220
His Trp Lys Ile Glu Tyr Thr Glu Ser Thr Ser Ala Ala Met Glu Lys
225 230 235 240
Val Ala Gln Ala Lys Ser Pro His Val Ala Ala Leu Gly Ser Glu Ala
245 250 255
Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Leu Gln Val Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn
260 265 270
Gln Arg Gln Asn Phe Thr Arg Phe Val Val Leu Ala Arg Lys Ala Ile
275 280 285
Asn Val Ser Asp Gln Val Pro Ala Lys Thr Thr Leu Leu Met Ala Thr
290 295 300
Gly Gln Gln Ala Gly Ala Leu Val Glu Ala Leu Leu Val Leu Arg Asn
305 310 315 320
His Asn Leu Ile Met Thr Arg Leu Glu Ser Arg Pro Ile His Gly Asn
325 330 335
Pro Trp Glu Glu Met Phe Tyr Leu Asp Ile Gln Ala Asn Leu Glu Ser
340 345 350
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Met Lys Val Leu Gly Cys Tyr Pro Ser Glu Asn Val Val Pro Val Asp
370 375 380
Pro Thr
385
<210> 21
<211> 397
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 酪氨酸氨基转移酶TyrB的氨基酸序列
<400> 21
Met Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu
1 5 10 15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser
20 25 30
Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala
35 40 45
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Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val
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Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala
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Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp
115 120 125
Pro Thr Trp Glu Asn His Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu
130 135 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe
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Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val
165 170 175
Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn
180 185 190
Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile
195 200 205
Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu
210 215 220
Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu
225 230 235 240
Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val
245 250 255
Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val
260 265 270
Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro
275 280 285
Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu
290 295 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu
305 310 315 320
Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu
325 330 335
Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr
340 345 350
Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val
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Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala
370 375 380
Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met
385 390 395
<210> 22
<211> 1053
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> DAHP合酶AroG的DNA序列
<400> 22
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
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gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
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ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 23
<211> 522
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 莽草酸激酶AroK的DNA序列
<400> 23
atggcagaga aacgcaatat ctttctggtt gggcctatgg gtgccggaaa aagcactatt 60
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gtggttgcaa accagattat tcacatgctg gaaagcaact aa 522
<210> 24
<211> 867
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 莽草酸脱氢酶YdiB的DNA序列
<400> 24
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<210> 25
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 分支酸变位酶/预苯酸脱水酶PheA的DNA序列
<400> 25
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gtgcctgttg atccaacctg a 1161
<210> 26
<211> 1194
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 酪氨酸氨基转移酶TyrB的DNA序列
<400> 26
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt 60
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ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct 180
catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg 240
ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa 300
acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg 360
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gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt 480
aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca 540
tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600
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gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840
cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat 900
gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg 960
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ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194
<210> 27
<211> 903
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗反馈抑制AroG*的DNA序列
<400> 27
atgacatcgg aaagcccgtt accggcgctg cgagagaaaa tcagcgcgct ggatgaaaaa 60
ttattagcgt tactggcaga acggcgcgaa ctggccgtcg aggtgggaaa agccaaactg 120
ctctcgcatc gcccggtacg tgatattgat cgtgaacgca acatgctgga aagattaatt 180
acgctcggta aagcgcacca tctggacgcc cattacatta ctcgcctgtt ccagctcatc 240
attgaagatt ccgtattaac tcagcaggct ttgctccaac aacatctcaa taaaattaat 300
ccgcactcag cacgcatcgc ttttctcggc cccaaaggtt cttattccca tcttgcggcg 360
cgccagtatg ctgcccgtca ctttgagcaa ttcattgaaa gtggctgcgc caaatttgcc 420
gatattttta atcaggtgga aaccggccag gccgactatg ccgtcgtacc gattgaaaat 480
accagctccg gtgccataaa cgacgtttac gatctgctgc aacataccag cttgtcgatt 540
gttggcgaga tgacgttaac tatcgaccat tgtttgttgg tctccggcac tactgattta 600
tccaccatca atacggtcta cagccatccg cagccattcc agcaatgcag caaattcctt 660
aatcgttatc cgcactggaa gattgaatat accgaaagta cggcggcggc aatggaaaag 720
gttgcacagg caaaatcacc gcatgttgct gcgttgggaa gcgaagctgg cggcactttg 780
tacggtttgc aggtactgga gcgtattgaa gcaaatcagc gacaaaactt cacccgattt 840
gtggtgttgg cgcgtaaagc cattaacgtg tctgatcagg ttccggcgaa aaccacgttg 900
tga 903
<210> 28
<211> 1056
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> misc_feature
<223> 抗反馈抑制PheA*的DNA序列
<400> 28
atggtgaatt atcagaacga cgatttacgc atcaaagaaa tcaaagagtt acttcctcct 60
gtcgcattgc tggaaaaatt ccccgctact gaaaatgccg cgaatacggt tgcccatgcc 120
cgaaaagcga tccataagat cctgaaaggt aatgatgatc gcctgttggt tgtgattggc 180
ccatgctcaa ttcatgatcc tgtcgcggca aaagagtatg ccactcgctt gctggcgctg 240
cgtgaagagc tgaaagatga gctggaaatc gtaatgcgcg tctattttga aaagccgcgt 300
accacggtgg gctggaaagg gctgattaac gatccgcaca tggataatag cttccagatc 360
aacgacggtc tgcgtatagc ccgtaaattg ctgcttgata ttaacgacag cggtctgcca 420
gcggcaggtg agtttctcaa catgatcacc ccacaatatc tcgctgacct gatgagctgg 480
ggcgcaattg gcgcacgtac caccgaatcg caggtgcacc gcgaactggc atcagggctt 540
tcttgtccgg tcggcttcaa aaatggcacc gacggtacga ttaaagtggc tatcgatgcc 600
attaatgccg ccggtgcgcc gcactgcttc ctgtccgtaa cgaaatgggg gcattcggcg 660
attgtgaata ccagcggtaa cggcgattgc catatcattc tgcgcggcgg taaagagcct 720
aactacagcg cgaagcacgt tgctgaagtg aaagaagggc tgaacaaagc aggcctgcca 780
gcacaggtga tgatcgattt cagccatgct aactcgtcca aacaattcaa aaagcagatg 840
gatgtttgtg ctgacgtttg ccagcagatt gccggtggcg aaaaggccat tattggcgtg 900
atggtggaaa gccatctggt ggaaggcaat cagagcctcg agagcgggga gccgctggcc 960
tacggtaaga gcatcaccga tgcctgcatc ggctgggaag ataccgatgc tctgttacgt 1020
caactggcga atgcagtaaa agcgcgtcgc gggtaa 1056
<210> 29
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> StyC-KpnI-RBS正向引物
<400> 29
cgggtaccta aggagatata taatgttaca cgcgtttgaa cgtaaaatg 49
<210> 30
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> StyC-HindIII-XhoI反向引物
<400> 30
actgctcgag aagcttactc ggctgccgcg tgtggaacgg ctttacg 47
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> StyA-BspHI正向引物
<400> 31
actgtcatga aaaagcgtat cggtattgtt gg 32
<210> 32
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR-HindIII-RBS正向引物
<400> 32
actgaagctt taaggagata tataatgagc gtgaccgcga aaaccgtg 48
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR-XhoI反向引物
<400> 33
actgctcgag tcacatgctt gaactcccgc cgaaa 35
<210> 34
<211> 1137
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）str.168
<220>
<221> misc_feature
<223> AlaDH的DNA序列
<400> 34
atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60
gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120
cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180
ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240
tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300
gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360
gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420
caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480
gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540
gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac 600
cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660
gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720
ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780
gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840
acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900
ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960
ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020
ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080
gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa 1137
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CvTA-BamHI-BspHI正向引物
<400> 35
actgggatcc gatcatgatg caaaaacaac gcaccacctc ac 42
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AlaDH-XhoI反向引物
<400> 36
actgctcgag ttaagcaccc gccacagatg attca 35
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EcALDH-NotI-RBS正向引物
<400> 37
actgcggccg ctaaggagat atataatgac agagccgcat gtagcagtat 50
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EcALDH-XhoI反向引物
<400> 38
actgctcgag ttaataccgt acacacaccg acttag 36
<210> 39
<211> 774
<212> DNA
<213> 泛菌属（Pantoea）
<220>
<221> misc_feature
<223> ADH9v1的DNA序列
<400> 39
atgaaaaatc gtgttgcctt tgttaccggt gcaggtcagg gtattggtga agcaattgca 60
ctgcgtctgg caaaagatgg tctggcagtt gcagttgccg atttcaatca agaaaccgca 120
cgtcaggttg ccgaaaaaat caatcagcag ggtggtaaag ccattgccct gaaagttgat 180
gttagccagc gtgatcaggt tatggaagca gttgaagaag cacgtcgtac cctgggtggt 240
tttgatgtta ttgttaataa tgcaggtatt gcaccgagca ccccgattgc agaaattacc 300
gaagccgttg ttgataaagt gtataacgtg aatgtgaaag gtgtgatttg gggtatgcag 360
gcagcaatta aagcatttgc agccgaaggt catggtggca aaattatcaa tgcatgtagc 420
caggcaggtc atgttggtgc accggaactg gcagtttata gcagcagtaa atttgcagtt 480
cgtggtctga cccagaccgc agcacgtgat ctggcaccgg caggtattac cgttaatgca 540
ttttgtccgg gtattgttcg taccccgatg tgggaagaaa ttgatcgtca gattagcgaa 600
gcagcaggta aaccggcagg ctatggcacc gaagaatttg caaaacgtat tacactgggt 660
cgtctgagcg aaccggaaga tgttgcagca tgtgttgcat atctggcaag tccggatagc 720
gattatatga caggtcagag tctgctgatt gatggtggta tggtgtttaa ctaa 774
<210> 40
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH9v1-HindIII-RBS正向引物
<400> 40
actgaagctt taaggagata tatcatgaaa aatcgtgttg cctttgttac 50
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH9v1-XhoI反向引物
<400> 41
actgctcgag ttagttaaac accataccac cat 33
<210> 42
<211> 1503
<212> DNA
<213> 黑曲霉
<220>
<221> misc_feature
<223> AnFDC的DNA序列
<400> 42
atgagcgcgc aacctgcgca cctgtgcttc cgcagtttcg tggaagcact gaaagttgat 60
aacgatctgg tggaaattaa taccccgatc gatccgaacc tggaagcggc ggcaattacc 120
cgtcgcgtgt gcgaaacgaa tgataaagcc ccgctgttta acaatctgat tggcatgaaa 180
aacggtctgt tccgcatcct gggtgcaccg ggcagtctgc gtaaaagctc tgcggatcgt 240
tatggtcgtc tggcacgtca tctggcactg ccgccgaccg caagcatgcg tgaaattctg 300
gataaaatgc tgagtgcgag cgatatgccg ccgattccgc cgaccatcgt gccgacgggt 360
ccgtgtaaag aaaatagcct ggatgattct gaatttgatc tgaccgaact gccggttccg 420
ctgatccata aaagcgatgg cggtaaatat attcagacgt acggtatgca catcgtgcag 480
agtccggatg gcacctggac gaattggagc attgcgcgtg cgatggtgca tgataaaaac 540
cacctgaccg gtctggtgat cccgccgcag catatttggc agatccacca gatgtggaaa 600
aaagaaggtc gtagcgatgt tccgtgggca ctggcattcg gcgtgccgcc ggcggcaatt 660
atggcgagta gcatgccgat cccggatggt gttaccgaag cgggttatgt gggcgccatg 720
acgggctcta gtctggaact ggttaaatgc gataccaacg atctgtacgt tccggcgacg 780
tctgaaattg tgctggaagg caccctgtct atcagtgaaa cgggtccgga aggcccgttt 840
ggtgaaatgc atggctatat tttcccgggt gatacccacc tgggcgccaa atataaagtg 900
aatcgcatta cgtaccgtaa caatgcaatc atgccgatga gcagctgcgg tcgcctgacc 960
gatgaaaccc atacgatgat tggcagcctg gcagcggccg aaatccgtaa actgtgtcag 1020
cagaacgatc tgccgatcac ggatgcattt gcgccgttcg aaagccaggt gacctgggtt 1080
gccctgcgcg ttgatacgga aaaactgcgt gcaatgaaaa ccacgtctga aggttttcgt 1140
aaacgcgtgg gcgatgtggt tttcaatcat aaagcgggtt ataccattca ccgcctggtg 1200
ctggttggtg atgatatcga tgtttacgaa ggcaaagatg tgctgtgggc cttttctacc 1260
cgttgtcgcc cgggtatgga tgaaacgctg tttgaagatg ttcgcggctt cccgctgatt 1320
ccgtacatgg gtcatggcaa cggtccggca caccgtggcg gtaaagttgt tagtgatgcc 1380
ctgatgccga ccgaatatac cacgggtcgt aattgggaag cagcggattt taaccagtct 1440
tacccggaag acctgaaaca gaaagtgctg gataattgga ccaaaatggg cttcagtaac 1500
taa 1503
<210> 43
<211> 500
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> AnFDC的氨基酸序列
<400> 43
Met Ser Ala Gln Pro Ala His Leu Cys Phe Arg Ser Phe Val Glu Ala
1 5 10 15
Leu Lys Val Asp Asn Asp Leu Val Glu Ile Asn Thr Pro Ile Asp Pro
20 25 30
Asn Leu Glu Ala Ala Ala Ile Thr Arg Arg Val Cys Glu Thr Asn Asp
35 40 45
Lys Ala Pro Leu Phe Asn Asn Leu Ile Gly Met Lys Asn Gly Leu Phe
50 55 60
Arg Ile Leu Gly Ala Pro Gly Ser Leu Arg Lys Ser Ser Ala Asp Arg
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Ala Arg His Leu Ala Leu Pro Pro Thr Ala Ser Met
85 90 95
Arg Glu Ile Leu Asp Lys Met Leu Ser Ala Ser Asp Met Pro Pro Ile
100 105 110
Pro Pro Thr Ile Val Pro Thr Gly Pro Cys Lys Glu Asn Ser Leu Asp
115 120 125
Asp Ser Glu Phe Asp Leu Thr Glu Leu Pro Val Pro Leu Ile His Lys
130 135 140
Ser Asp Gly Gly Lys Tyr Ile Gln Thr Tyr Gly Met His Ile Val Gln
145 150 155 160
Ser Pro Asp Gly Thr Trp Thr Asn Trp Ser Ile Ala Arg Ala Met Val
165 170 175
His Asp Lys Asn His Leu Thr Gly Leu Val Ile Pro Pro Gln His Ile
180 185 190
Trp Gln Ile His Gln Met Trp Lys Lys Glu Gly Arg Ser Asp Val Pro
195 200 205
Trp Ala Leu Ala Phe Gly Val Pro Pro Ala Ala Ile Met Ala Ser Ser
210 215 220
Met Pro Ile Pro Asp Gly Val Thr Glu Ala Gly Tyr Val Gly Ala Met
225 230 235 240
Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Val Lys Cys Asp Thr Asn Asp Leu Tyr
245 250 255
Val Pro Ala Thr Ser Glu Ile Val Leu Glu Gly Thr Leu Ser Ile Ser
260 265 270
Glu Thr Gly Pro Glu Gly Pro Phe Gly Glu Met His Gly Tyr Ile Phe
275 280 285
Pro Gly Asp Thr His Leu Gly Ala Lys Tyr Lys Val Asn Arg Ile Thr
290 295 300
Tyr Arg Asn Asn Ala Ile Met Pro Met Ser Ser Cys Gly Arg Leu Thr
305 310 315 320
Asp Glu Thr His Thr Met Ile Gly Ser Leu Ala Ala Ala Glu Ile Arg
325 330 335
Lys Leu Cys Gln Gln Asn Asp Leu Pro Ile Thr Asp Ala Phe Ala Pro
340 345 350
Phe Glu Ser Gln Val Thr Trp Val Ala Leu Arg Val Asp Thr Glu Lys
355 360 365
Leu Arg Ala Met Lys Thr Thr Ser Glu Gly Phe Arg Lys Arg Val Gly
370 375 380
Asp Val Val Phe Asn His Lys Ala Gly Tyr Thr Ile His Arg Leu Val
385 390 395 400
Leu Val Gly Asp Asp Ile Asp Val Tyr Glu Gly Lys Asp Val Leu Trp
405 410 415
Ala Phe Ser Thr Arg Cys Arg Pro Gly Met Asp Glu Thr Leu Phe Glu
420 425 430
Asp Val Arg Gly Phe Pro Leu Ile Pro Tyr Met Gly His Gly Asn Gly
435 440 445
Pro Ala His Arg Gly Gly Lys Val Val Ser Asp Ala Leu Met Pro Thr
450 455 460
Glu Tyr Thr Thr Gly Arg Asn Trp Glu Ala Ala Asp Phe Asn Gln Ser
465 470 475 480
Tyr Pro Glu Asp Leu Lys Gln Lys Val Leu Asp Asn Trp Thr Lys Met
485 490 495
Gly Phe Ser Asn
500
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AnFDC-BspHI正向引物
<400> 44
actgtcatga gcgcgcaacc tgcgcacctg 30
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AnFDC-EcoRI反向引物
<400> 45
actggaattc ttagttactg aagcccattt tggtc 35
<210> 46
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AnPAD-EcoRI-RBS正向引物
<400> 46
actggaattc taaggagata tatcatgttc aactcacttc tgtccggc 48
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AnPAD-PstI反向引物
<400> 47
actgctgcag ttatttttcc caaccattcc aacg 34
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AtPAL-NdeI正向引物
<400> 48
actgcatatg gatcaaatcg aagcaatgtt gtg 33
<210> 49
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AtPAL-XhoI反向引物
<400> 49
actgctcgag ttatttttcc caaccattcc aacg 34
<210> 50
<211> 300
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗反馈抑制AroG*的氨基酸序列
<400> 50
Met Thr Ser Glu Ser Pro Leu Pro Ala Leu Arg Glu Lys Ile Ser Ala
1 5 10 15
Leu Asp Glu Lys Leu Leu Ala Leu Leu Ala Glu Arg Arg Glu Leu Ala
20 25 30
Val Glu Val Gly Lys Ala Lys Leu Leu Ser His Arg Pro Val Arg Asp
35 40 45
Ile Asp Arg Glu Arg Asn Met Leu Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Lys
50 55 60
Ala His His Leu Asp Ala His Tyr Ile Thr Arg Leu Phe Gln Leu Ile
65 70 75 80
Ile Glu Asp Ser Val Leu Thr Gln Gln Ala Leu Leu Gln Gln His Leu
85 90 95
Asn Lys Ile Asn Pro His Ser Ala Arg Ile Ala Phe Leu Gly Pro Lys
100 105 110
Gly Ser Tyr Ser His Leu Ala Ala Arg Gln Tyr Ala Ala Arg His Phe
115 120 125
Glu Gln Phe Ile Glu Ser Gly Cys Ala Lys Phe Ala Asp Ile Phe Asn
130 135 140
Gln Val Glu Thr Gly Gln Ala Asp Tyr Ala Val Val Pro Ile Glu Asn
145 150 155 160
Thr Ser Ser Gly Ala Ile Asn Asp Val Tyr Asp Leu Leu Gln His Thr
165 170 175
Ser Leu Ser Ile Val Gly Glu Met Thr Leu Thr Ile Asp His Cys Leu
180 185 190
Leu Val Ser Gly Thr Thr Asp Leu Ser Thr Ile Asn Thr Val Tyr Ser
195 200 205
His Pro Gln Pro Phe Gln Gln Cys Ser Lys Phe Leu Asn Arg Tyr Pro
210 215 220
His Trp Lys Ile Glu Tyr Thr Glu Ser Thr Ala Ala Ala Met Glu Lys
225 230 235 240
Val Ala Gln Ala Lys Ser Pro His Val Ala Ala Leu Gly Ser Glu Ala
245 250 255
Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Leu Gln Val Leu Glu Arg Ile Glu Ala Asn
260 265 270
Gln Arg Gln Asn Phe Thr Arg Phe Val Val Leu Ala Arg Lys Ala Ile
275 280 285
Asn Val Ser Asp Gln Val Pro Ala Lys Thr Thr Leu
290 295 300
<210> 51
<211> 351
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗反馈抑制PheA*的氨基酸序列
<400> 51
Met Val Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu
1 5 10 15
Leu Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn
20 25 30
Ala Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu
35 40 45
Lys Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile
50 55 60
His Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu
65 70 75 80
Arg Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe
85 90 95
Glu Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro
100 105 110
His Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg
115 120 125
Lys Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu
130 135 140
Phe Leu Asn Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp
145 150 155 160
Gly Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu
165 170 175
Ala Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly
180 185 190
Thr Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His
195 200 205
Cys Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr
210 215 220
Ser Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro
225 230 235 240
Asn Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys
245 250 255
Ala Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser
260 265 270
Ser Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln
275 280 285
Gln Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser
290 295 300
His Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Tyr Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp
325 330 335
Ala Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly
340 345 350
<210> 52
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crr删除片段
<400> 52
gtaaattgcg cattatgttc ccgatgatca tctctgttga agaagtgcgt gcactgcgca 60
aagagatcga aatctacaaa caggaactgc gcgacgaagg taaagcgttt gacgagtcaa 120
ttgaaatcgg cgtaatggtg gaaacaccgg ctgccgcaac aattgcacgt catttagcca 180
aagaagttga tttctttagt atcggcacca atgatttaac gcagtacact ctggcagttg 240
accgtggtaa tgatatgatt tcacaccttt accagccaat gtcaccgtcc gtgctgaact 300
tgatcaagca agttattgat gcttctcatg ctgaaggcaa atggactggc atgtgtggtg 360
agcttgctgg cgatgaacgt gctacacttc tgttgctggg gatgggtctg gacgaattct 420
ctatgagcgc catttctatc ccgcgcatta agaagattat ccgtaacacg aacttcgaag 480
atgcgaaggt gttagcagag caggctcttg ctcaaccgac aacggacgag ttaatgacgc 540
tggttaacaa gttcattgaa gaaaaaacaa tctgctaatc cacgagatgc ggcccaattt 600
actgcttagg agaagatcat gcatcaagaa gtaattcttg ccgcagtgaa aaatggcgcc 660
catcggcgcc atttttttat gcttccgcca gcggcggcaa aatcaattca tcgctctcat 720
gctgctgggt gtagcgcatc acttccagta cgcgcaaccc cgctcggtgc actgcatcgg 780
ttaacgcctt ccctttcagc aagccactga tgagctgagc acaaaacagg tcgccagtcc 840
ctttcaggtc ggtttttacc cgtgaatggg aaatgacatt cacgctgtcg gcagtgacca 900
ccacaacctg catctcctga ttttcttcat taccggaggc gctggtaacc accacccatt 960
ttaatgtgtc tgaaagcaga ctttttgcgg cagcaatggc actgtcgaga tcgcggcaat 1020
ttttaccggt caggatttcc aactcaaaga tattgggggt aattccctgc gccagcggca 1080
gtaaatattg tcgatacgct tcgggaaggt caggtttgac ataaattccg ctatcaatat 1140
cgccaatcac cggatcgacc atgatcaata ggtcaggatg gtctttgcgt agcgcagtca 1200
gccactcggc aaggattttg atttgcgatg ccg 1233
<210> 53
<211> 1157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tyrA删除片段
<400> 53
caattggtgc tcgtacaacg gaatcgcaaa ctcaccgtga aatggcctcc gggctttcca 60
tgccggttgg ttttaaaaac ggcaccgacg gcagtctggc aacagcaatt aacgctatgc 120
gcgccgccgc ccagccgcac cgttttgttg gcattaacca ggcagggcag gttgcgttgc 180
tacaaactca ggggaatccg gacggccatg tgatcctgcg cggtggtaaa gcgccgaact 240
atagccctgc ggatgttgcg caatgtgaaa aagagatgga acaggcggga ctgcgcccgt 300
ctctgatggt agattgcagc cacggtaatt ccaataaaga ttatcgccgt cagcctgcgg 360
tggcagaatc cgtggttgct caaatcaaag atggcaatcg ctcaattatt ggtctgatga 420
tcgaaagtaa tatccacgag ggcaatcagt cttccgagca accgcgcagt gaaatgaaat 480
acggtgtatc cgtaaccgat gcctgcatta gctgggaaat gaccgatgcc ttgctgcgtg 540
aaattcatca ggatctgaac gggcagctga cggctcgcgt ggcttaagag gtttattatg 600
tcgccagtaa taatccagtg ccggatgatt cacatcatcc ggcacctttt catcaggttg 660
gatcaacagg cactacgttc tcacttgggt aacagcccaa taccttcatt gaacgggtga 720
tttcccctaa ctctttcaat gctttttgca tttccgctga ttcaagattg gcctgaatat 780
ccagatagaa catctcttcc catggattac cgtgaatcgg gcgtgattcc agacgggtca 840
taatcagatt gtggttgcgc agtaccagca acgcttcaac cagcgcaccg gcttgttgcc 900
cggtcgccat taacaacgtg gttttcgccg gaacctgatc agacacgtta atggctttac 960
gcgccaacac cacaaatcgg gtgaagtttt gtcgctgatt tgcttcaata cgctccagta 1020
cctgcaaacc gtacaaagtg ccgccagctt cgcttcccaa cgcagcaaca tgcggtgatt 1080
ttgcctgtgc aaccttttcc attgccgcag acgtactttc ggtatattca atcttccagt 1140
gcggataacg attaagg 1157

Claims (29)

1.一种通过一种或多种重组微生物细胞生物生产取代或未取代的苯乙醛、2-苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺的方法，所述一种或多种重组微生物细胞经基因工程化以相对于野生型细胞过表达至少一种酶，所述方法包括在一锅反应体系中使起始原料经历多种酶催化的化学转化，其中所述起始原料选自包括葡萄糖、L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸、苯乙烯或取代的苯乙烯的组。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因工程细胞：
i)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙醛的苯乙烯单加氧酶和苯乙烯氧化物异构酶；或
ii)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙酸的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和醛脱氢酶；或
iii)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的2-苯乙醇的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶；或
iv)过表达用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙胺的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和转氨酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述苯乙烯单加氧酶包括SEQ ID NO：1和2所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；所述苯乙烯氧化物异构酶包括SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；所述醛脱氢酶包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；所述醇脱氢酶包括SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，以及所述转氨酶是ω-转氨酶，所述ω-转氨酶包括SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，所述苯乙烯氧化物异构酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，所述醛脱氢酶来自大肠杆菌或其突变体，所述醛还原酶来自番茄或其突变体或者是来自大肠杆菌的YqhD或其突变体；所述醇脱氢酶来自酿酒酵母，以及所述转氨酶是来自紫色色杆菌或其突变体或河流弧菌或其突变体的ω-转氨酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述苯乙烯单加氧酶由SEQ ID NO：7和8所示的核酸序列编码；所述苯乙烯氧化物异构酶由SEQ ID NO：9所示的核酸序列编码；所述醛脱氢酶由SEQ ID NO：10所示的核酸序列编码；所述醇脱氢酶由SEQ ID NO：11所示的核酸序列编码，以及所述转氨酶是由SEQ ID NO：12所示的核酸序列编码的ω-转氨酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述基因工程细胞通过由解氨酶的过表达催化的脱氨反应和由脱羧酶的过表达催化的脱羧反应从L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸生产苯乙烯或取代的苯乙烯。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述解氨酶包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，以及所述脱羧酶包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述基因工程细胞通过由选自包括DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)或其突变体的组中的至少一种酶的过表达催化的反应从葡萄糖生产L-苯丙氨酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，AroG包括SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；AroK包括SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；YdiB包括SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，其变体，突变体或片段；PheA包括SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，以及TyrB包括SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，将AroG替换为由包括SEQ ID NO：27的核酸编码的抗反馈抑制突变体AroG*，和/或将PheA替换为由包括SEQ ID NO：28的核酸编码的抗反馈抑制突变体PheA*。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，还包括crr和/或预苯酸脱氢酶(tyrA)基因的删除或失活。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一种过表达的酶位于一个或多个质粒上。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用水性介质。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用双相介质。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述双相介质为：
(a)水性:固体树脂介质；或
(b)水性:有机溶剂介质。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述一锅反应体系包括使用三相介质，所述三相介质包括：
(a)水性:有机溶剂:固体树脂介质；或
(b)水性:有机溶剂:官能化纳米颗粒介质。
17.一种基因工程细胞的分离株，与野生型细胞相比，所述基因工程细胞的分离株能够提高在一锅反应体系中取代或未取代的苯乙醛、2-苯乙醇、苯乙酸或苯乙胺的生物生产，其中所述细胞过表达选自包括以下的组(i)至(iv)的酶的组合：
i)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙醛的苯乙烯单加氧酶和苯乙烯氧化物异构酶；
ii)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙酸的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和醛脱氢酶；
iii)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的2-苯乙醇的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶；以及
iv)用于由苯乙烯或取代的苯乙烯生成取代或未取代的苯乙胺的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和转氨酶。
18.根据权利要求17所述的基因工程细胞的分离株，其中，所述苯乙烯单加氧酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，所述苯乙烯氧化物异构酶来自假单胞菌属VLB120或其突变体，所述醛脱氢酶来自大肠杆菌或其突变体，所述醇脱氢酶来自酿酒酵母，以及所述转氨酶是来自紫色色杆菌或其突变体的ω-转氨酶。
19.根据权利要求18所述的基因工程细胞的分离株，其中，所述苯乙烯单加氧酶由SEQID NO：1和2所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段编码；所述苯乙烯氧化物异构酶由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段编码；所述醛脱氢酶由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段编码；所述醇脱氢酶由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段编码，以及所述转氨酶是ω-转氨酶，所述ω-转氨酶由SEQID NO：6所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段编码。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的基因工程细胞的分离株，其中，所述细胞通过由解氨酶的过表达催化的脱氨反应和由脱羧酶的过表达催化的脱羧反应从L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸生产苯乙烯或取代的苯乙烯。
21.根据权利要求20所述的基因工程细胞的分离株，其中，所述解氨酶包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，以及所述脱羧酶包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的基因工程细胞的分离株，其中，所述基因工程细胞通过由选自包括DAHP合酶(AroG)、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)或其突变体的组中的至少一种酶的过表达催化的反应从葡萄糖生产L-苯丙氨酸。
23.根据权利要求22所述的基因工程细胞的分离株，其中，AroG包括SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；AroK包括SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段；YdiB包括SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，其变体，突变体或片段；PheA包括SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段，以及TyrB包括SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列、其变体、突变体或片段。
24.根据权利要求22或23所述的基因工程细胞的分离株，其中，将AroG替换为由包括SEQ ID NO：27的核酸编码的抗反馈抑制突变体AroG*，和/或将PheA替换为由包括SEQ IDNO：28的核酸编码的抗反馈抑制突变体PheA*。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的基因工程细胞的分离株，还包括crr和/或预苯酸脱氢酶(tyrA)基因的删除或失活。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的基因工程细胞的分离株，其中，所述细胞是：
(i)含有必需酶的野生型菌株；或
(ii)共表达多种酶的重组大肠杆菌菌株。
27.一种分离的核酸分子，编码选自包括以下的组(i)-(viii)的至少一种催化酶：
(i)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯产生取代或未取代的苯乙醛的苯乙烯单加氧酶和苯乙烯氧化物异构酶的核酸；
(ii)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯产生取代或未取代的苯乙酸的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和醛脱氢酶的核酸；
(iii)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯产生取代或未取代的2-苯乙醇的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶的核酸；
(iv)编码用于由苯乙烯或取代的苯乙烯产生取代或未取代的苯乙胺的苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶和转氨酶的核酸；
(v)编码用于从L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸产生苯乙烯或取代的苯乙烯的选自解氨酶和脱羧酶的至少一种异源催化酶的核酸；
(vi)编码将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸转化为取代或未取代的2-苯乙醇的选自解氨酶和脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶或其突变体的至少一种异源催化酶的核酸；
(vii)编码用于从葡萄糖产生L-苯丙氨酸的选自包括DAHP合酶(AroG)或AroG*、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)或PheA*和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)或其突变体的组的至少一种异源催化酶的核酸；以及
(viii)编码将葡萄糖转化为取代或未取代的2-苯乙醇的选自包括DAHP合酶(AroG)或AroG*、莽草酸激酶(AroK)、莽草酸脱氢酶(YdiB)、分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)或PheA*和酪氨酸氨基转移酶(TyrB)、解氨酶和脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、苯乙烯氧化物异构酶、醛还原酶和/或醇脱氢酶或其突变体的组的至少一种异源催化酶的核酸。
28.根据权利要求27所述的分离的核酸，所述分离的核酸编码：
i)SEQ ID NO：1、2和3、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的苯乙醛；和/或
ii)SEQ ID NO：1、2、3和4、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的苯乙酸；和/或
iii)SEQ ID NO：1、2、3和5、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的2-苯乙醇；和/或
iv)SEQ ID NO：1、2、3和6、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将苯乙烯或取代的苯乙烯转化为取代或未取代的苯乙胺；和/或
v)SEQ ID NO：13和14、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸转化为苯乙烯或取代的苯乙烯；和/或
vi)SEQ ID NO：1、2、3、5、13和14、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将L-苯丙氨酸或取代的L-苯丙氨酸转化为取代或未取代的2-苯乙醇；或
vii)SEQ ID NO：17、18、19、20、21、50和51、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将葡萄糖转化为L-苯丙氨酸；或
viii)SEQ ID NO：1、2、3、5、13、14、17、18、19、20、21、50和51、其变体、突变体或片段中的至少一个，以将葡萄糖转化为取代或未取代的2-苯乙醇。
29.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求17至28中任一项所述的基因工程细胞或分离的核酸。
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