CN101163795B - 积聚萜的转化的植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有改变的萜含量的转化的植物，优选过量积聚单萜和/或倍半萜。通过利用编码萜合酶(TS)和异戊二烯转移酶(PRT)的基因进行植物的转化，可获得积聚了每克新鲜的叶子至少1000ng特定萜的植物。本发明提供了一种优越的系统用于生产萜，其中根据技术人员的选择可在植物中生产任何想要的单萜和/或倍半萜。优选地，该转化的植物含有至少一种重组质体定位的TS和PRT。

Description

积聚萜的转化的植物

技术领域

本发明涉及过量积聚特定的单萜或倍半萜的转化的植物。本发明进一步涉及具有改变的特定萜含量的转化的植物，含有编码异戊二烯转移酶(PRT)和/或单萜或倍半萜合酶(TS)的至少一种核苷酸序列的载体，改变植物中特定萜含量的方法，增加植物中特定萜含量的方法，生产特定萜的方法以及至少一种核苷酸序列在具有改变的萜含量的植物生产中的应用。

背景技术

在大部分有机体中都发现有萜和萜类化合物。它们不断增加的重要的商业价值与围绕不同萜的生物活度和功能性的不同范围相联系。因此，许多维生素、荷尔蒙、杀虫剂、药物、调味料和香料都被发现包含在这样巨大种类的化合物中，所有这些化合物的生成都是来源于称为异戊二烯单元的5碳单元。

萜可通过存在于它们的结构中的异戊二烯单元的数目来分类：单萜(C₁₀)，倍半萜(C₁₅)，二萜(C₂₀)，三萜(C₃₀)，四萜(C₄₀)和多萜(C_n，n等于或大于45个碳原子)。植物界含有高度多样的代表众多的不同结构的单萜和倍半萜。

较高级萜例如倍半萜和二萜的化学合成是非常复杂并且至今还没有实现它们的环境可接受的制备方法。因此，本发明的第一个目的是提供避免多步化学合成而有效生产或积聚特定萜的方法。

关于萜的生物合成路径的研究揭示了所有萜的共同的C5前体为二磷酸异戊烯酯(IPP)。两种不同的IPP生物合成的路径共存于植物中。在细胞溶胶中发现的与内质网联系的甲羟戊酸酯路径(MVA)和在高等植物的质体发现的非甲羟戊酸酯路径(还称为脱氧木酮糖路径或磷酸甲基-D-赤藓醇酯路径(DOXP/MEP))。在两种路径中涉及的起始产物，酶和催化反应都不同，并且它们在高等植物的细胞中平行运转并且相互补充。因此，在细胞质中的MVA路径负责甾醇、倍半萜和多萜的生物合成，而质体(MEP路径)提供用于单萜，二萜例如贝壳杉烯(C₂₀)，和多萜例如类胡萝卜素(C₄₀)和质体醌-9(C₄₅)合成的C₅单元。

在IPP的合成之后，通过异戊二烯转移酶(PRT)的多次浓缩形成脂肪族的二磷酸异戊二烯酯萜前体用于各自的萜，即用于单萜的二磷酸香叶酯(GPP)，用于倍半萜的二磷酸法呢酯(FPP)和用于二萜的二磷酸香叶基香叶酯(GGPP)。这些前体依次用作萜合酶或环化酶的底物，该底物对于每一种类的萜合酶(例如单萜，倍半萜或二萜的合酶)是特定的。萜合酶可催化复杂多步骤的环化反应以形成众多的萜化合物的碳骨架。

业已进行了众多的尝试来分离特定的萜合酶并且WO2004/031376报道了编码荜澄茄醇合酶，朱栾倍半萜合酶和大根香叶烯合酶的基因的分离。当将含有这些基因的质粒转化到大肠杆菌细胞中时，可在培养介质中发现相应的香味化合物。通常，考虑到现有技术中涉及萜合酶的异源表达，目的是提供积聚更多量的特定萜的手段和方法。

在US5,589,619，US5,365,017，US5,349,126和US5,349,126中，公开了转基因植物中增加角鲨烯和甾醇积聚的方法。然而这些文献对于怎样增加其它种类的萜例如单萜，倍半萜和二萜的积聚没有记载。

转基因植物的制备也是US6,841,717的主题，其涉及关于MEP路径的基因。该文献教示了编码HMBPP-合酶(GCPE蛋白)的DNA分子，该分子与叶绿体转运肽相关联并且因此用于生产转基因植物。虽然该文献涉及生育酚底物的积聚，其对于如何有效积聚其它萜化合物没有提及。

在US6,653,530中，公开了在种子中增加类胡萝卜素生产的方法，其中宿主植物用噬夏孢欧文氏菌的编码八氢番茄红素合酶的核酸序列转化。

WO00/22150公开了在转化了编码单萜合酶(柠檬烯合酶，香芹醇合酶和S-里哪醇合酶)的核苷酸序列的植物中通过在植物中表达这些酶产生或增加对昆虫的抗性的方法。

WO02/33060A2公开了生产具有改变的生育酚含量和组合物的植物或种子的核苷酸序列和方法。

WO91/13078中，公开了编码草生欧文氏菌的各种酶的DNA序列。还提及了生产GGPP和多种类胡萝卜素的转化的宿主生物体。

EP1063297提供了编码二磷酸法呢酯合酶的cDNA序列和表达异源二磷酸法呢酯合酶的转基因植物。

WO02/064764公开了与各自的前体接触时能够合成单萜里哪醇和或倍半萜橙花叔醇的分离的或重组的核酸序列。在实施例11中，公知在转基因植物中生产倍半萜的难度，并且在这方面没有给出具体的结果。

同样地，Aharoni等公开的″Terpenoid Metabolism in Wild-Type andTransgenic Arabidobsis Plants″，the Plant cell，Vol.15，2866-2884中，仅通过定位于质体的里哪醇/橙花叔醇合酶来合成非常低水平的橙花叔醇。

本发明人提出了生产或积聚特定的、选择的萜的问题。优选地，提供一种方法，该方法不仅适合于生产预先确定的萜而且适合于生产任何感兴趣的萜。因此目的是提供允许例如任何以上给出的倍半萜(如荜澄茄醇，朱栾倍半萜，大根香叶烯，广藿香醇)的积聚的系统，但是其同样适合积聚其它萜。该问题到目前为止在现有技术中没有解决，后者主要建议在MVA或MEP路径中具有改变的特性的重组生物体，以及观察特定萜终产物进行积聚。

本发明的另一目的是以立体化学的纯净形式并通过可靠和节约成本的生产平台提供生产任何选择的萜，优选倍半萜的手段。

本发明发明人提出的重要的问题是植物中增加了积聚的选择的萜，优选倍半萜。在现有技术中，报道的最大产率约为10μg萜每克新鲜重量的植物材料。特别是关于倍半萜，积聚仍然非常低，通常为微克量级或更低。因此本发明的目的是提供在植物中根据技术人员的选择积聚更多量任何萜(特别是倍半萜)的可能性。优选地，该植物可轻易被栽培。另一目的是在植物器官中积聚相对于成熟植物的总重来说高生物量的萜。

本发明另外的目的是提供积聚了用于抑制植物病原体的生长和草食动物的侵袭的足够量的萜的植物。

发明内容

不同寻常地，本发明人能够用编码定位于植物质体的二磷酸法呢酯合酶(FPS)和特定单萜合酶或倍半萜合酶的基因转化生物体并且获得高产量的萜(其通过萜合酶(TS)合成)。通常存在于细胞溶胶中的类异戊二烯生物合成路径的酶首次可以被用于另外的细胞间隔—质体—中，并且令人惊讶地，所选择的萜化合物的量可通过使用不同路径的前体得到增加。本发明的重要优点在于当编码所选择的萜的合酶的核苷酸序列已知或易于分离时，在任何植物中都可积聚任何想要的萜。通过将至少两种基因产物—即TS和能够合成TS的直接前体的酶(异戊二烯转移酶(PRT))—定位于植物的质体中，上述优点的实现是可能的。

因此，本发明第一方面提供了过量积聚特定萜优选单萜或倍半萜的转化的植物。

另一方面，本发明提供了具有改变的特定萜含量的转化的植物，所述转化的植物含有结构基因，该结构基因含有编码定位于植物质体的异戊二烯转移酶(PRT)和萜合酶(TS)的至少一种核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了积聚倍半萜的转化的植物，该植物被转化为含有编码定位于植物质体的二磷酸法呢酯合酶(FPS)和倍半萜合酶的至少一种核苷酸序列。

再一方面，本发明提供了一种载体，含有编码PRT和/或TS的至少一种核苷酸序列，或含有编码PRT和TS的融合蛋白的至少一种核苷酸序列，所述核苷酸序列还含有以符合读框的方式与编码PRT、TS和/或融合蛋白的核苷酸序列相连的质体定位序列。

又一方面，本发明提供了改变植物中特定萜含量的方法和增加植物中特定萜含量的方法，该方法包括用至少一种DNA结构转化植物材料的步骤，该DNA结构含有分别编码二磷酸法呢酯合酶FPS或二磷酸香叶酯合酶(当所述萜为单萜时)和倍半萜合酶或单萜合酶的至少一种核苷酸序列；和从转化的植物材料再生出转化的植物的步骤。

又一方面。本发明提供了生产特定萜的方法，该方法包括从本发明的植物中分离萜的步骤，还提供编码质体定位功能PRT和/或TS的至少一种核苷酸序列在具有改变的萜含量的植物生产中的应用。

本发明还涉及生产倍半萜的方法，该方法包括栽培本发明植物的步骤。

附图说明

图1显示了对照烟草品系(WT)和用含有质体定位基因的结构转化的品系的GC-MS分析，该基因为编码倍半萜(广藿香醇)合酶和二磷酸法呢酯合酶(tpPTS+tpFPS)的基因。在色谱A中的峰12通过C部分的MS分析并且通过与可信的广藿香醇(D)比较确认为广藿香醇。峰3作为内标(3-α-松香烯)。

图2显示了对照烟草品系(WT)和用含有质体定位基因的结构转化的品系的GC-MS分析，该基因为编码另一倍半萜(紫穗槐-4，11-二烯)合酶和二磷酸法呢酯合酶(tpADS+tpFPS)的基因。主峰显示了在转化的植物中紫穗槐-4，11-二烯的积聚。

图3显示了用不同结构(详见图2)转化的植物的叶子中的广藿香醇的含量。比较显示出用质体定位PTS和FPS(其为独特基因产物形式或融合蛋白形式)转化的植物积聚了高产率的广藿香醇(＞10,000ng每克新鲜的叶子FW)。细胞溶胶定位结构保持低于200ng/gFW。

图4定量显示了在过量表达二磷酸法呢酯合酶(FPS)，倍半萜(广藿香醇)合酶或两者的再生转基因植物品系中mRNA表达水平。

图5显示了在转基因植物中广藿香醇合酶(PTS)和二磷酸法呢酯(FPS)蛋白用作标准免疫检测的表达水平和处理。

图6显示了生长于[1-¹³C]-葡萄糖中的秧苗中通过MEP或MVA路径生物合成的广藿香醇的预测¹³C标记模式。

图7比较了通过供给¹²C-葡萄糖(上图)植物合成的广藿香醇的MS母离子和通过对细胞质(中图)生物合成或质体(下图)生物合成进行工程设计的植物从[1-¹³C]-葡萄糖合成的广藿香醇的MS母离子。

图8显示了适合于根癌脓杆菌(A.tumefaciens)介导的植物转化的载体(“pBDON”)组成，其中在attp 1和attp2序列之间的区域(cm ccdB)可在体外和位点特异地被重组以包埋定位于植物的质体上的TS和/或PRT。该载体含有植物转化的边界区域，启动子，终止子和attp 1/2重组序列，其将会在实施例中进一步详细讨论。

图9A和图9B显示了辅助载体(“pTMON”和“pTDUAL”)，其包含位于attp2序列和attp1序列之间的一个或两个结构基因，分别通过位点特异性重组插入到图6的pBDON载体中。A部分显示了适合一次插入一个基因到pBDON载体的辅助载体，而B部分显示了适合于一次插入两个基因到pBDON中的辅助载体。所述载体含有启动子，终止子，attp1/2重组体和位置标记(place-holder)序列CVS，HPO，其将会在实施例中进一步详细讨论。

图10A和图10B显示了不同植物转化载体的T-DNA区域的组成。HPT区域提供了潮霉素抗性，PTS编码了萜(广藿香醇)合酶和FPS二磷酸法呢酯合酶(PRT)。在某些载体中，基因通过His-标志或质体定位序列(tp)侧面相连。该载体还含有合适的启动子和终止子序列。

图11以图解的方式显示了pBDON载体的结构(图8)。

图12以图解的方式显示了pTMON辅助载体的结构(图9A)。

图13部分I和部分II以图解的方式显示了pTDUAL辅助载体的结构(图9B)。

图14显示了来自于辅助载体pTMON和pTDUAL(图10A和图10B)的相应片断的插入pBDON载体获得合适的植物转化载体的家族。

图15部分I-III显示了具有编码倍半萜合酶和二磷酸法呢酯合酶的基因的植物质体DNA的转化载体的制备细节。

图16显示了载体pLGUS和pLFPP+PTS的组成，该载体用于分别转化具有编码GUS和FPS+PTS的基因的植物质体基因组。Nt-LA63表示烟草品系的转基因attB的整合位点。

具体实施方式

本发明涉及积聚特定单萜或倍半萜的转化的植物。本发明还涉及具有改变的特定萜含量的转化的植物，该植物含有定位于植物质体的结构基因。

对于本发明来说“转化的植物”是进行了遗传工程的植物。“转化的植物”包括来自于已转化的个体植物的无性地(植物性地)和有性地衍生的材料。例如根据本发明，当后代含有至少一个编码定位于植物质体的PRT和萜合酶的核苷酸序列时，本发明包括通过将具有单独转化的植物与非转化植物杂交获得的植物。该植物可为任何植物，优选为适合本发明转化的植物。优选地，该植物为天生生产大量的萜的植物。例如，选自于茄科(Solanaceae)，禾本科(Poaceae)或薄荷科(Lamiaceae)的植物。例如选自烟草属，茄属，高粱属，泥南芥属，苜蓿属(紫花苜蓿)，棉属(棉花)，白菜属(油菜)。优选属于烟草类的植物。

而且本发明优选涉及植物，其定义可同样很好地被用于其它含有细胞器的生物体。例如，本发明还适用于藻类和真菌类。优选地，适用于含有质体的生物体如藻类和植物。

术语“改变的特定萜含量”或者“积聚特定萜”指的是本发明转化的植物的特定萜的含量高于没有转化的相同的植物中的相同萜的含量。因此本发明包括两种情况：首先，本发明涉及植物，该植物的野生型不能生产特定感兴趣的萜，通过本发明的转化，这些植物将积聚感兴趣的萜并因此具有改变的特定萜含量。本发明包括的另外一种情况，植物已经生产感兴趣的萜。通过转化，该植物将生产更多的特定萜并因此具有改变的萜含量。

同样地，术语“积聚”或“过量积聚”指的是与不转化的相同的植物相比，转化的植物中有较高的特定萜的含量。

因此，术语PRT和/或TS基因的“表达”或“过量表达”指的是相对于不转化植物对照在任何植物器官中具有较高的PRT和/或TS RNA含量的植物。

“萜”是环状或非环状的基于异戊二烯单元(C₅H₈)或由其组成的烃。

在此使用的“单萜”是一种基于C₁₀结构的萜，并且包括单萜衍生物。实例为薄荷醇，柠檬烯，α-蒎烯，β-蒎烯，S-里哪醇，仅提及特定的例子来说明。

在此使用的“倍半萜”是基于C₁₅结构的萜。例如实例为环洒剔烯(cyclosativene)，cyclocopacamphene，cyclocopacamphenol差向异构体，cyclocopacamphenal差向异构体，cyclocopacamphenic酸差向异构体，顺式-α-香柠檬烯，反式-α-香柠檬烯，(+)-epi-β-檀香萜，β-红没药烯，和反式-γ-红没药烯。

对于本发明来说，术语“萜”，“单萜”和“倍半萜”还包括萜的衍生物例如萜类化合物，该萜类化合物为包括具有经过一步或多步的如羟基化，异构化，氧化还原，二甲基化或酰化等官能化的分子的萜衍生物。

说明书上下文中，词“包含”被认为是“包括，除此之外还包括”的意思，不解释为“仅由...组成”。

在优选实施方式中，本发明的植物被转化以含有结构基因，该结构基因包含编码定位于植物质体的异戊二烯转移酶(PRT)的核苷酸序列。

根据本发明的另一优选实施方式，本发明的植物被转化以包含结构基因，该结构基因包含编码定位于植物质体的萜合酶(TS)的核苷酸序列。

术语“定位于植物质体”指的是PRT和/或TS将会存在于质体中的事实。通过用含有质体定位序列的基因进行的核转化，这些蛋白可定位于质体，得到由植物细胞活性转运到质体中的基因产物。另一种将蛋白定位于质体的可能方式是通过直接转化质体基因组(如果质体定位序列不再是必须的)。本发明的植物优选被转化以含有编码定位于植物细胞质体的PRT和特定TS的基因。

优选地，本发明的植物表达PRT和/或TS。优选地，该植物过量表达PRT和/或TS。PRT或TS的表达优选根据在实施例中给出的规程，由RNA提取和定量RT-PCR分析来确定。

异戊二烯转移酶(PRT)也称为二磷酸聚异戊二烯酯合酶或焦磷酸聚异戊二烯酯合酶，其为可以包括二磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)和一个或多个IPP残基(例如二磷酸法呢酯(FPP)，二磷酸香叶酯(GPP)，二磷酸香叶基香叶酯(GGPP)或其它)的催化烷基化步骤的酶。术语PRT还包括能够催化一个或一系列反应产生多种萜类化合物家族的二磷酸聚异戊二烯酯前体的一种或几种不同的酶。因此，对于本发明而言，编码PRT的至少一种核苷酸序列包括编码包含单个蛋白，二个蛋白，三个蛋白，四个蛋白和寡聚蛋白的同源或异源混合物的四级结构的多肽的序列。具体地，PRT可为单体，异源二聚体或同源二聚体。来自于薄荷(薄荷属)的油腺的二磷酸香叶酯合酶可被用作本发明包含的特定PRT的复杂遗传组成的实例，因为这个酶已经被纯化并且公开了其为异源二聚体，两个亚单位都需要从IPP和DMAPP前体中生产GPP。

优选地，例如，PRT包括EC号为EC2.5.1分类的酶。

在一种优选实施方式中，编码PRT的至少一种核苷酸序列编码一种或多种具有二磷酸香叶酯(GPP)合酶和/或二磷酸法呢酯(FPP)合酶活性的蛋白。GPP和FPP分别为单萜和倍半萜的前体。

二磷酸香叶酯合酶(GDS)也称为二甲基-烯丙基转转移酶，是PRT的实例。

根据一种优选实施方式，PRT为二磷酸法呢酯合酶(FPS)。FPS是可用IPP催化如二磷酸香叶酯(GPP)的缩合以产生二磷酸法呢酯的酶。优选地，FPS能够用二磷酸烯丙酯和二磷酸二甲基丙烯酯(DMAPP)然后用合成的二磷酸香叶酯(GPP)来催化二磷酸异戊烯酯(IPP)的连续缩合，得到最终的产物二磷酸法呢酯。优选地，存在于转化的植物中的PRT从不同于转化的植物的种类中分离出来。根据本发明的一种优选实施方式，PRT为非植物PRT。优选地，所述PRT为动物的或真菌的PRT，更优选为动物的PRT。优选脊椎动物的PRT，更优选来自于鸟类。优选地，PRT是非植物的二磷酸法呢酯合酶。

对于本发明来说，转化的植物优选含有编码特定TS和能够合成上述特定TS的直接前体的PRT的基因。例如，质体定位倍半萜合酶和质体定位FPS。这是本发明的一个特别优选的实施方式，因为它利用了MEP路径生产倍半萜，这是以前没有使用过的。作为另一实施例，该植物被转化以含有编码质体定位的GDS和质体定位的单萜合酶的基因。

从各种生物体中分离出来的大量的编码PRT的核苷酸序列是技术人员容易获得的并且可从公共数据库中下载。本发明非常重要的优点在于任意能够合成相应的TS前体的任何PRT的核苷酸序列都可交替的应用于本发明的植物中。

公开可用的适合于获得编码PRT或TS的核苷酸序列的数据库可以是例如欧洲生物信息学学会(European Bioinformatics Institute)的数据库(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/index.html)，EXPASY数据库(http://www.expasy.org/enzyme/)，NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov和众多其它的数据库。仅出于说明对于技术人员来说可用的能够满足本发明目的的FPS的许多可能性的目的，可以引用从松小蠹虫(Ips pini)(NCBI Accession Number(AN)：AY 953508.1)中分离出来的二磷酸香叶酯合酶，从费氏弧菌(NCBI AN：YP 203660)中分离出来的二磷酸法呢酯合酶以及Tarshis等(1994)报道的鸟类的二磷酸法呢酯合酶。当然，也可从其它数据库中选择任何其它的PRT。

TS是由给定的前体化合物催化形成单萜或倍半萜的酶。本发明的重要的优点是特定萜合酶的可交换性。根据技术人员感兴趣的特定倍半萜，可选择任何相应的TS并且可使用编码它的核苷酸序列用于转化本发明的植物。

术语“特定的”或“选择的”萜、TS或PRT指的是由技术人员选择的TS或PRT。根据感兴趣的“特定的”萜，应用编码能够合成各自的前体和感兴趣的萜的PRT或TS的核苷酸序列来制备转化的植物。

优选地，编码特定TS或PRT的核苷酸序列(其可为任何TS或PRT)可由技术人员容易得到或者分离。例如，“特定的”萜可以是具有令人满意的特性如香料、调味料、药物化合物、维生素、昆虫控制剂、植物控制剂(仅提及一些)的化合物，并且技术人员根据任意的这些特性进行选择。然后本发明提供了允许在植物中生产或积聚非常感兴趣的萜的通用的系统。

优选地，特定的TS为萜合酶，该酶利用任意的GPP和/或FPP作为萜生物合成路径上游的中间产物或前体，在该路径中其自然产生。这种情况下，碳的流动更大量地朝向由TS合成的特定萜的积聚。例如，TS由二磷酸法呢酯作为其直接底物。

在一种实施方式中，本发明的TS优选选自由单萜合酶和倍半萜合酶组成的组。任何萜合酶可被用于本发明的目的。具有可用序列的单萜合酶的实例为柠檬烯合酶(LS)(Ohara等，2003)，S-里哪醇合酶(LIS)(Lucker等2001)。

从各种生物体中分离出来的编码萜合酶的基因或核苷酸序列可容易地从公开可用数据库(见以上PRT的数据库)中下载并且同样公开于文献中。

根据本发明的一种实施方式，TS是倍半萜合酶。任何倍半萜合酶都适用于本发明的目的，因为这些酶通常催化一系列反应产生特定的倍半萜。

在大量的已知的倍半萜中，可以在获得最终的倍半萜之前根据二磷酸前体的中间的正碳离子来区分不同的种类。例如，TS包括形成反式-葎草烷基(humulyl)阳离子以合成β-丁香烯和α-葎草烯的酶和其它酶。其它的TS形成中间产物E，E-大根香叶二烯基阳离子以获得大根香叶烯A、B、C、D、朱栾倍半萜、马兜铃烯(aristolochene)和vetiapinadiene等。当然，其它的TS也是已知的并且可被用于本发明的目的。

在一种优选的实施方式中，TS是选自由广藿香醇合酶，朱栾倍半萜合酶和荜澄茄醇合酶组成的组中的倍半萜合酶。或者，TS为γ-姜黄烯，(-)-大根香叶烯D，(+)-大根香叶烯D，二环大根香叶烯，荜澄茄醇和/或δ-杜松烯(cadiene)合酶。编码这些合酶的基因已经公开于国际申请PCT/IB/2004/003836和WO 2004/031376中。

以上实例仅代表了适合于提供编码本发明PRT或TS的序列的大量公开序列中的很少数的任意选定实例。因此，这些少数的不同的TS和PRT的实例合适地说明了本发明萜生产平台的广泛的适用性，这一平台给技术人员提供了可随意生产任何萜的合适的方法。

优选地，本发明的植物的结构基因编码功能性FPS和功能性TS。

编码PRT和/或TS的基因可从待转化的植物本身中分离出。这种情况下，植物的转化导致了转化的植物中编码PRT和/或TS的基因额外的复制。然而，在转化植物中优选FPS和/或TS为异源表达的酶。

优选地，含有编码PRT和/或TS的核苷酸序列的基因为转基因。

在一种优选实施方式中，本发明的转化的植物与天然的非转化植物相比，积聚了多至1.5倍的由TS合成的特定萜。优选地，转化的植物积聚至少两倍，三倍，更优选至少四倍并且最优选至少六倍的特定萜。

根据本发明另一实施方式，转化的植物积聚至少1000ng(纳克)/克新鲜叶子的可由TS合成的特定萜。优选地，转化的植物积聚至少1000ng，更优选至少4000ng，甚至更优选至少5000ng，更优选至少7000ng的可由存在于转化的植物中的TS重组体合成的特定萜。根据一种优选的实施方式，转化的植物积聚至少10000ng/g的可由TS合成的萜，优选倍半萜。优选地，转化的植物相对每克新鲜叶子积聚至少13,000ng，更优选至少20,000ng，甚至更优选25,000ng，最优选多于30,000ng的特定萜。特定萜的量也可用干物质的量来表示。这种情况下，植物材料的干物质特别是叶子对应约10％的鲜重值。因此相对于每克干叶子，至少积聚10μg，40μg，50μg，70μg，100μg，130μg，200μg，250μg，300μg的萜。

在自然的非转化植物已经产生出特定萜的情况下，将上述对于转化的植物有效的值添加到天然存在于非转化植物中的特定萜的量中。

为了确定本发明的植物中特定萜的含量，任何产生或积聚萜的植物器官都可作为参考。优选分别从转化的植物和非转化植物上取下具有相同年龄的绿叶进行比较。通常取成熟的叶子。该分析优选根据实施例中列出的“萜分析”流程进行。优选将新鲜叶子从植物上切下来后直接进行分析。叶子可以在收获后冷冻并且在冷冻状态下分析。

根据一种优选实施方式，本发明转化的植物为转化的烟草。本发明植物的种子已经保藏于ATCC，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209，USA，保藏者的样本参考号分别为″tpPTS+tpFPS-4″和″pBtpPTS+tpFPS-4″以及专利保藏号(Patent Deposit Designations)ATCC PTA-6659和PTA-6660。

优选地，转化的植物可在选择的野生型的基因中含有敲除、缺失或其它形式的有害突变，该基因可以参与到萜生物合成路径中适合使碳流动从本发明的TS偏离。例如，本发明的植物可在FPP，GPP和/或GGPP合酶编码基因的下游具有一种或多种非官能基因以产生甾醇，聚类异戊二烯(polyprenoids)，植醇和类胡萝卜素。这样碳流动可更加有效朝着特定萜合成方向。

本发明提供了改变和/或增加植物中特定萜的含量的方法。所述方法包括用至少一种含有定位于植物质体的结构基因的DNA结构将植物材料转化的步骤。

通常，任何用本发明的结构基因转化植物的方法都可以使用。例如，用特定的膜活性试剂处理或用电穿孔处理后，已经除去其保护性细胞壁的植物细胞吸收纯DNA。DNA还可通过非常细的玻璃针被微量注射到目标植物细胞中。最近新开发的植物转化的方法—生物射弹方法—包括将用DNA涂覆的非常小的钨或金颗粒用静电脉冲、空气压力或火药引爆加速进入到细胞中。

例如，结构基因可以直接设计到质体中，优选与合适的质体表达载体一起。合适的转化植物的质体基因组的方法公开在Lutz K.A.，Corneille S，Azhagiri A.K.，Svab Z.，Maliga P.的(2004)A novel approachto plastid transformation utilizes the phiC31 phage integrase.Plant joumal 37：906-913中。

因此，在一种优选实施方式中，本发明提供了这样的植物，其中编码PRT和TS的结构基因存在于质体基因组中并且有效地连接到质体表达启动子上。

另外，通过在核DNA水平将植物材料转化，该基因产物可以被定位于质体中。因此，本发明在一种优选实施方式中提供了这样的植物，其中含有编码PRT和TS的核苷酸序列的结构基因为核基因并且含有连接到编码PRT和/或TS的核苷酸序列的质粒定位序列。

根据本发明的一种优选实施方式，萜(优选倍半萜)至少部分是通过MEP路径生物合成的。优选地，至少30％的由萜合酶合成的萜是通过MEP路径生物合成的。优选至少50％，更优选至少60％并且最优选至少80％的萜通过MEP路径获得。通常MEP路径使用甘油醛和丙酮酸酯作为合成二磷酸异戊烯酯的底物。这条路径的特征在于中间体为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸酯。其通常在质体中发生。另外的生成IPP的路径—MVA路径—通常在细胞溶胶中发生。

通过MEP路径合成的IPP中，与通过MEV路径合成的IPP相比这样的IPP的碳被不同地排列，这就导致了在最终的萜中碳原子的不同排列。MEP和MVA路径中碳原子的不同排列方式可被用来鉴别标记试验中萜的生物合成来源。例如，通过MEP路径的[1-¹³C]-葡萄糖的合并生成了具有两个¹³C-标记的碳原子的IPP，而三个这样的原子存在于由MVA路径生成的IPP中。本发明人已获得了很好的根癌脓杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化结果。优选使用含有至少一种本发明的结构基因的质粒结构(载体)，通过核苷酸序列与其侧面相连，以允许将结构基因整合到植物的核染色体DNA中。

一方面，本发明提供了含有编码PRT和/或TS或编码PRT和TS的融合蛋白的核苷酸序列的载体，所述结构基因还含有位于编码PRT，TS或融合蛋白的序列的上游或下游的质体定位序列。换句话说，该载体可含有编码PRT和TS的核苷酸序列以及编码二者融合蛋白的核苷酸序列中的仅一种或两者。

合适的质体定位序列包括编码质体或叶绿体转运肽的序列。质体定位序列为技术人员公知并且可以符合读框的方式连接到编码PRT和/或TS的核苷酸序列上。可用质体定位序列的多种例子之一为拟南芥RUBisCO小单元基因(GenBank accession no.NM 123102)。

优选地，质粒定位序列位于编码PRT和/或TS的结构基因的N末端。

优选地，该载体进一步含有启动子和终止子序列，优选分别位于包括对于PRT和/或TS的质粒定位序列和结构基因的核苷酸序列的上游和下游。优选地，该载体含有强组成型启动子。启动子的例子为MOS和NOS启动子。优选地，选择独立于非转化宿主植物的控制和/或反馈调节机制的启动子。优选地，PRT和TS的重组体具有上游启动子序列。更优选地，它们分别具有不同的启动子序列。

非强制性选择地，所述载体可以进一步包含适合抗体结合的标志，例如His-标志和/或myc标志。

优选地，本发明的载体还含有适于选择转化的植物的标记。例如，该载体可含有给予潮霉素或卡那霉素抗性的基因，或任何适合于选择成功转化的植物的其它种类的标记。

优选地，为了促进结构基因向植物核基因组整合，本发明的载体还含有与PRT和/或TS侧面相连的左边界区域和右边界区域，包括非强制性选择的启动子，终止子，标志和/或质体定位序列以及植物抗性标记。

因此，本发明的载体优选含有编码PRT和/或TS的结构基因(其连接到至少一个质体定位序列)和用于选择转化的植物的标记(侧面相连于左边界区域和右边界区域以易于插入植物基因组)。

优选地，载体进一步含有在左边界区域和右边界区域之外的标记，用于选择阳性细菌转化株，该阳性细菌转化株用于克隆含有载体的细菌或用于植物(根癌脓杆菌)的转化。

用含有定位于植物质体的结构基因的DNA结构进行的植物材料的转化可以通过标准方法实施，见Schardl等的Gene(1987)6：61：1-11；Berger等的Proc Natl Acad Sci USA(1989)86：8402-8406；和Horsch等的Science(1985)27：1229-1231，后面的方法描述了“叶盘方法”，其特别适合转化烟草。

本发明的方法进一步包含从转化的植物材料再生出转化的植物的步骤。技术人员可应用常规的从转化的植物材料再生完整植物的方法。例如，可使用Horsch等(1985)公开的方法。通常，含有转化的细胞的叶子的部分可以在选择的介质中生长直到出现愈合组织和再生植物的枝条。大小为1～3cm的枝条可以被转移到含有抗生素的T-介质(Schardl，1987)中刺激根的生长。一旦建立起根系统，幼苗可以转移到商业可得的盆栽土中并在温室中繁育。

本发明进一步包括改变植物中产生的特定萜含量的方法，该方法包括以下步骤：

-用编码PRT的核酸转化第一种植物材料，

-用编码TS的核酸转化第二种植物材料，

-分别从第一种和第二种转化的植物材料再生出第一种和第二种植物，

-将第一种和第二种植物杂交，和

-通过杂交获得的后代中选择过量表达PRT重组体和TS重组体两者的植物。

以上方法对于获得本发明转化的植物是一种变化的方法，因为不同植物材料分别用编码PRT或TS的结构基因转化，并且再生的转化的植物仅含有两种重组体基因中的一种。

在接下来的步骤中，有性来源的后代从含有PRT重组体DNA的植物和含有TS重组体DNA的植物杂交获得。优选地，杂交指的是遗传的杂交也称为孟德尔杂交。这通常通过异花授粉实现。在后代中，选择表达PRT重组体和TS重组体两者的个体。

本发明还提供了生产特定萜的方法，该方法包括将萜从本发明转化的植物中分离的步骤。转化的植物可以被耕种并优选以足够多的量收获，以进行经济的有利的加工。本发明的特定萜可以通过包括(但不限于)色谱法的任何在本领域内使用的方法进行分离，例如，气相色谱法(GC)提取和蒸馏。

除非另外定义，在此使用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域中一般技术人员的常规理解相同的含义。虽然与那些在此描述的方法或材料相似或等价的任何方法或材料也能够被用于本发明的实践中，为了说明的目的还是描述了典型的方法和材料。在本申请中提及的所有的文献在此以参考方式并入，以公开和描述与列举的文献相关的方法和/或材料。

实施例

以下的实施例目的是举例说明本发明，而非限定其范围。实施例的方法和流程通常根据特定材料或试剂盒制造商提供的标准流程或由Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987)定义的完善建立起来的流程实施。

附上的序列表包括编码倍半萜合酶和鸟类二磷酸法呢酯合酶的核酸序列，其与转运肽序列连接。编码广藿香醇合酶(bp187-bp1845)通过接头序列连接到质体定位序列(bp1-bp171)上的核苷酸序列命名为tpPTS(SEQ.ID.NO：1)。

编码鸟类二磷酸法呢酯合酶(bp211-bp1314)通过接头序列连接到质体定位序列(bp1-bp171)上的核苷酸序列命名为tpFPS(SEQ.ID.NO：2)。

编码融合蛋白的核苷酸序列被命名为tpFPS-PTS(SEQ.ID.NO：3)，其中PTS编码区(bp1321-bp2979)融合到鸟类FPS(鸟类二磷酸法呢酯合酶)编码区(bp211-bp1311)并且另外通过接头序列连接到质体定位序列(bp1-bp171)上。

编码紫穗槐-4，11-二烯合酶(bp181-bp1821)通过接头序列连接到质体定位序列(bp1-bp171)上的核苷酸序列命名为tpADS(SEQ.ID.NO：4)。

实施例中描述的在PCR反应中使用的引物列举在SEQ.ID.NO.5～70中。

制备western杂交用抗体的肽片断列举在SEQ.ID.NO.71～78中。

对于一些方法或流程步骤可参考在以下另外详细列出的文献。

用于生产其核DNA被转化的植物的植物材料为烟草L.cv.Xanthi。其质体DNA被转化的植物为烟草LA63。

实施例1～5：重组体的构建和植物转化载体

选择潮霉素选择标记(Hajdukiewicz等，1994)用于建立转化的植物的选择标记。新的载体用如Hartley(2000)等人描述的合适重组体克隆位点进行设计。

实施例1：pBDON载体的建立(图8和图11)

用限制性酶Sph1和Sst1将pBI101载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)消化并且对应于质粒载体的DNA片断(不包括RB边界和NPTII基因盒)通过琼脂糖凝胶纯化(Sambrook等，1989)进行分离(13)。同时，使用标准PCR条件用引物Attp1-SstI-FW和Attp2-SphI-RV将包括ccdb基因和氯霉素抗性基因的attp重组体盒从pDON221载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中扩增出来。PCR扩增的DNA片断用Sph1/Sst1酶限制性酶切，凝胶纯化并连接到上述同样消化的pBI101的相应位点以生产中间体pBattp载体(14)。

通过两步法制备潮霉素基因盒。首先，使用PCR引物HPT-NotI-FD和HPT-Xbal-RV将潮霉素基因和CaUTR(终止序列)从pCAMBIA1301(Cambia，Canberra，AU)载体中PCR扩增出来，并且T/A克隆(Taq-扩增PCR产物直接来自PCR反应混合物)到pT7Blue载体(Novagen，Madison，WI)中生产pTHPT(15)。使用PCR引物TB-SphI-FD和TB-NotI-RV从pBI101中扩增右边界(RB)和NOS-启动子(P-NOS)区域(16)，然后T/A克隆进入pT7Blue载体得到载体pTRBP(17)。潮霉素抗性基因盒从载体pTHPT通过NotI/Xba1消化释放出来(18)，并且克隆到同样消化的pTRBP载体中，得到了载体pTRBPHPTT(19)。然后使用引物TB-SphI-FD和HPT-SphI-R从该载体中扩增NOS启动子-潮霉素-CaUTR盒(20)。扩增的产物用Sph1消化并连接到pBattp的相应位点生产pBDON载体(21)。

pBDON Ti-载体(图8)含有T-DNA区域之外的NPTII选择标记用于选择细菌和潮霉素基因(HPT)以进行植物转化选择。因此植入的attp盒为与attB位点侧面相连的基因结构提供了向pBDON载体中的容易的插入。

根据图12和图13给出的流程建立起具有attB位点的两个不同的attB辅助载体(图9A和图9B)。一个用于单一基因插入(pTMON，图9A)和另一个用于两个目标基因插入pBDON载体(pTDUAL，图9B)。

实施例2：pTMON载体的生成(图9A和图12)

首先，用含有Nde1限制位点和被植入引物CSMV-ATTB1-SGFI-FD的attB1序列的正向PCR引物和含有EcoR1位点的反向引物，从修改的pBI101载体中扩增木薯花叶病毒启动子来构建pTMON载体(22)。将PCR片断T/A克隆到pGem-Teasy载体(Promega，Madison，WI)中(23)，然后重新分离Nde1/EcoR1消化产物(24)。分离的消化产物连接到pECVS载体—包埋有萜合酶基因(“基因1”)的pET2 8a衍生物—的相应的限制性位点，生成pEPCVS(25)。

同时，用正向引物Tnos-XhoI-FW和反向引物Tnos-attB2-RV扩增pBI101的NOS终止子(TNOS)序列(26)，其在TNOS序列的下游并入了attB2重组位点。PCR片断被T/A克隆到pGEM-Teasy载体中，生产pTTNOS载体(27)。随后将pEPCVS的Nde 1/Xho 1消化片断连接到pTTNOS的相应位点产生pTMON(28)(图9A)。

在木薯花叶病毒启动子(Pcv)(Frey等，2001)之后插入单一目标基因来构建pTMON载体，并且之后是Nos终止子序列。

质体定位序列被设计到pTMON载体中。因此使用引物TP-ASCF和TP-ASCR扩增拟南芥小亚单元RUBP羧化酶/加氧酶基因(GenBank accession NM123202)的质体定位序列，用Asc1消化并连接到变异pTMON载体的相应限制性位点上。

实施例3：pTDUAL载体的生成(图9B和图11)

用多步骤方法(图13，部分I和部分II)构建pTDUAL载体。首先使用引物PCaMV-XbaI-FW和PCaMV-SpeI-RV从pBI121载体(Invitrogen)中扩增花椰菜花叶病毒启动子(Benfy等，1990)(29)，并T/A克隆到pT7Blue载体中(30)。随后通过Xba1和Spe1消化将启动子元件从载体中释放(31)。同时，用引物7120D-SpeI-FW和7120D-KpnI-RV扩增另外的萜合酶基因(“基因2”)，接下来用Spe1/Kpn1消化并连接到相应的pT7Blue载体上生产pTHPO(32)。然后将pTHPO用Xba1/Spe1消化并且同样从pTPCa释放的CaMV启动子片断被连接到一起得到pTPHPO(33)。

在建立pTPHPO的同时，使用引物Tnos-KpnI-FW和Tnos-attB2-RV3从pGTNOS载体中扩增NOS终止子序列，将其T/A克隆到pGem-Teasy载体中(34)，之后通过用Kpn1和Sac1进行pGTNOSK质粒的消化进行片断的重新分离(25)。然后将该片断克隆到pTPHPO的相应限制性位点生产pTPHPOT(36)(图11的部分I)。

在构建pTDUAL载体的最后步骤中，使用标准PCR条件扩增从attB1位点延伸至插入的萜合酶基因下游的nos终止子序列的pTMON载体的片断(37)。用引物CsMV-attB1-SgfI-FD和TNOS-XbaI-RV得到扩增产物，产物上也设计了末端的Sph1和Xba1位点到片断上。将PCR片断消化并连接到pT7Blue载体上的相应Sph1/Xba1位点上，生产pTPCVST(38)。最后，来自pTPHPOT的Xbal到Sac1的消化片断(39)被连接到pTPCVST的相应位点上(40)以生产pTDUAL载体，该载体允许在强的结构表达启动子的下游插入两个基因序列(图13部分II)。

将pTDUAL载体(图9B)消化以插入两个基因到转基因植物中。第一个基因的表达由木薯花叶病毒启动子(Frey等，2001)引导，而第二个基因的表达由花椰菜花叶病毒基因启动子(Benfey等，1990)引导。

与pTMON载体的情况相同，将质体定位序列设计到pTDUAL载体中，在这两种情况下，用引物对TP-SpeFW：TP-SpeRV或者TP-ASCF：TP-ASCR来扩增拟南芥小亚单元RUBP羧化酶/加氧酶基因(GenBank accession NM123202)的质体定位序列，然后分别用Spe1或Asc1消化，再将所述定位序列连接到pTDUAL载体的相应位点。

实施例4：广藿香醇合酶(PTS)和广藿香醇合酶+二磷酸法呢 酯合酶(FPP)过量表达载体的构建

通过与pTMON，pTDUAL和pBDON载体相联系的适当的重组克隆位点，非常容易产生PTS和PTS+FPS表达载体(图14)。分别用引物对PTS-AscF和PTS-XhoR或引物对FPP-SpeFW和FPP-KpnRV扩增PTS(WO 2004/031376)或FPS基因(Tarshis等，1994)和质体定位序列(41)，用Asc1/Xho1或者Spe1/Kpn1消化，然后连接到pTMON载体(42)的相应位点或pTDUAL载体(43)的相应位点上。通过用引物FPS-AscF和FPS-AscR扩增FPS基因产生FPS-PTS基因融合，用Asc1消化得到的PCR片断并将该片断连接到pTMON和pTDUAL载体中建立的5’到PTS基因的相应Asc1位点上。然后通过标准的重组克隆(Hartley等，2000)将得到的质粒用于将相应的PTS基因盒，PTS+FPS基因盒和FPS-PTS基因盒转移到pBDON载体产生Ti-质粒载体家族(图8)。

实施例5：紫穗槐-4，11-二烯合酶(ADS)和二磷酸法呢酯合酶 (FPP)过量表达载体的构建

用引物ADS-AscF和ADS-XhoR对由Dr.Peter Brodelius，KalmarUniversity，Kalmar Sweden提供的ADS cDNA(Genbank accession numberAF 138959)进行PCR扩增，并且对于同样含有tpFPS基因的pTDUAL载体中的PTS基因进行置换克隆。用与引物(引物序列为TP-ASCF和TP-ASCR)相联系的AscI限制性位点对发现与小单元的核酮糖-1，5-二磷酸盐羧化酶(RubisCO，GenBank accession no.NM23202)相联系的编码拟南芥转运肽的DNA序列进行PCR扩增，用AscI限制性酶消化并引入到相同的5’至AD S基因的限制性位点，创造pTDUAL载体tpADS+tpFPS。然后通过标准的重组克隆(Hartley等，2000)将得到的质粒用于将相应的tpAD S+tpFPS基因盒转移到pBDON载体中，生成相应的Ti质粒载体(图10B，最终构成)。

实施例6：植物的转化和再生

通过电穿孔(Mersereau等，1990)和为卡那霉素抗性而选择的转化株将单独的pBDON载体的构成(图10A和图10B)转化到根癌脓杆菌菌株GV3850中。通过限制性DNA测序并且随后在含有100mg/L卡那霉素的50mL的LB培养基中生长来为转基因结构检验所选择的菌落。通过离心的方法将具有等于0.6～0.8的OD₆₀₀的过夜培养物浓缩，悬浮于30mL的新鲜LB培养基(不含抗生素)中并且用于接种上述的叶子外植体(Chappell等，1995；Horsch等，1985)。简言之，来自于在无菌条件下生长植物的叶子被置于根癌脓杆菌培养物中，切成约1em的段，并且叶子段覆于非选择性培养基板(Murashige和Skoog，1962)上。3天之后，将叶子外植体转移到含有15μg/mL的潮霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)和500μg/mL的头孢噻肟(Bioworld，Dublin，OH)的培养基板上，随后每周转移到相同的选择培养基中直至愈合组织和再生的植物的枝条变得明显。然后将大小为1～3em的枝条转移到T-培养基(Murashige和Skoog，1962)(含有相同的抗生素)上以刺激根的发育。一旦根系统建立起来，幼苗被转移到商业可得的盆栽土中在温室中培育。

实施例7：萜的分析

通过GC-MS分析对由实施例6获得的转化植物叶子材料提取的倍半萜进行鉴定和量化。250～500mg的冷冻的叶子样本于液氮中磨碎，然后用3mL的含有200ng的α-柏木烯作为外部内标的正己烷∶乙酸乙酯(v/v85∶15)的混合物萃取，通过将样本在硅土柱中用相同的85∶15的乙酸乙酯：正己烷的混合物洗提对提取物进行部分纯化。在氮气流下将洗提物浓缩至30μL，然后由GC-MS(TakahashiS，2005)将1μL的等份样本进行分析。将样本注射到装有RestecRtx-5毛细柱(30m×0.32mm，0.25μm相厚度)的TraceGC-MS(ThermoFinnigan，Somerset，NJ)中，以无分流模式运行，注射温度为250℃并且最初的炉温为70℃持续一分钟，然后每分钟4℃升至230℃。在70eV时记录质谱，从35～300原子质量单位扫描并且与库标准(NIST库)和检验可信标准对比。

图1显示了对照烟草品系(WT)和对于倍半萜含量用tpPTS+tpFPS基因结构转化的品系的萜分析的结果。在图1中对包含tpPTS+tpFPS基因结构的转基因品系的总离子色谱(A)与对照植物(非转化株)的总离子色谱(B)进行比较。通过可用的标准与它们的质子光谱比较或通过在NIST库中可用的光谱配色来识别峰。例如，峰12(C)的MS与可信的广藿香醇(D)进行比较。其它的峰的鉴定：1-β-广藿香烯；2-β-榄香烯；3-α-柏木烯(内标)；4-石竹烯；5-α-愈创木烯；6-未知；7-α-广藿香烯；8-赛切烯；9-未知，10-δ-愈创木烯；11-广藿香醇；和12-广藿香醇。

图2显示了对照烟草品系(WT)和对于倍半萜含量tpADS+tpFPS基因结构转化的品系的萜分析的结果。与图1相似，转基因品系的总离子色谱与对照植物的总离子色谱进行比较。最高的峰值对应紫穗槐-4，11-二烯，第二高的峰是荜澄茄醇。箭头表示作为内标的α-柏木烯的存在。

图1和图2为GC-MC分析的结果并且说明了用编码感兴趣的特定萜(广藿香醇或紫穗槐-4，11-二烯)合酶和PRT(二磷酸法呢酯合酶)的质体定位基因特定转化的植物(A)包括(除由相同的萜合酶合成的其它萜之外)具有与野生型(B)相比改变的萜含量和分别过量积聚的广藿香醇和紫穗槐-4，11-二烯。

图3是用不同结构转化的植物的倍半萜(广藿香醇)含量的定量分析。HisPTS指的是用编码与His-标志相连的广藿香醇合酶(PTS)的重组基因转化的植物。FPSPTS指的是二磷酸法呢酯合酶(FPS)和PTS的融合蛋白，和PTS+FPS指的是用编码PTS和FPS的单独的基因转化的植物。图表的右手边，显示了进一步连接到至少一种质体定位序列(tp)上的相似的结构。野生型植物不积聚任何广藿香醇，也不积聚任何其它的与转基因品系相关的倍半萜(图1)。

用tpADS+tpFPS转化的植物中，紫穗槐-4，11-二烯的积聚也被量化并且发现接近30μg/g FW。更加具体的单个转基因品系的倍半萜的积聚示于表3中(是指以下表3？注意-这里有低于10μg/g的例子！)。对照植物(没有给出)不积聚任何紫穗槐-4，11-二烯。

表3：在转基因品系中积聚的紫穗槐-4，11-二烯的定量分析

实施例8：RNA的提取和定量RT-PCR分析

在500mg的嫩叶子中用制造商的Trizol试剂(Invitrogen LifeTechnologies，Carlsbad，CA)分离每种品系的总RNA。在反应缓冲液中，用5μg的总RNA，200ng的oligodT 12-16引物和反转录酶(Superscript II，InVitrogen Life Technologies)的20μL的反应体系并且以制造商推荐的条件合成第一链的cDNA。接下来将1μL的RNase H加入到cDNA制备液中并在37℃温育1小时除掉互补RNA。

应用定量RT-PCT的方法确定不同转基因品系中的mRNA的水平。通过改变添加的cDNA的模板的量和使用PCR循环数(10，15，20，25和30)来确定线性PCR扩增的最佳浓度。使用引物PTS-8F和PTS-160R来扩增PTS基因，而FPP-IF和FPP-160R用于FPS基因。另一对引物RBCS-FW和RBCS-RV用于扩增作为内标的RUBisCO小亚单位基因。常规PCR条件由1xTaq缓冲液(由制造商提供)，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTP混合物，每种引物2μM，1.25μL cDNA和1单位的Taq DNA聚合酶组成，总共25μL的混合物。PCR扩增进行20个温度循环，每一个循环由94℃变性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸60秒组成。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用溴化乙锭染色并且拍照。

PTS和FPS mRNA分析的结果显示在图4中。该图显示了源自从植物中分离的mRNA的RT-PCR产物，该植物转化自：含有广藿香醇合酶(PTS)基因或质体定位PTS(tpPTS)基因的结构，或含有广藿香醇合酶和FPS基因(PTS+FPS)的结构，或含有质体定位PTS和FPS(tpPTS+tpFPS)的独特基因的结构，或编码FPS和PTS的融合蛋白(FPS-PTS)的结构，或相应的质体定位融合蛋白(tpFPS-PTS)。RBCS为源自存在于野生型(WT)植物和转基因植物中作为分子内标的Rubisco小亚单位mRNA的RT-PCR产物。

可以看出野生型(WT)植物不表达PTS或FPS。包含hisPTS，PTS+FPS，PTS-FPS和tpPTS的结构的许多品系表达易于检测水平的PTS mRNA，但是广藿香醇的积聚相对较少并且与PTS mRNA表达水平的相关较小。相反，作为单独基因或融合基因与tpFPS结合的质体定位tpPTS基因的表达导致了PTS mRNA的相似表达水平并获得了明显高水平的广藿香醇的积聚。

实施例9：蛋白表达的分析

4～5条合成肽的混合物用作抗原来制备PTS和FPS的抗体。通过免费软件(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)预测抗原肽并且通过对FP S的3D结构分析(PDB：1FPS)或对PTS的可用结构的EAS(PDB：5EAS)的同源物模型比对来选择抗原肽。我们设计5种PTS的抗原肽(PTS46；PTS108；PTS353；PTS462；PTS475)和4种FPS的抗原肽(FPP41；FPP59；FPP218；FPP320)。所有的肽都通过Sigma-Genosys(The Woodland，TX，US)以免疫级别的10mg大小来合成。然后将每种肽混合物结合到KLH(Keyhole LimpetHemocyanin)载体蛋白上并通过Strategic Biosolutions(Windham，ME)注射到兔子中。PTS和FPS的多克隆抗体根据制造商手册用与纯化的PTS或FPS蛋白结合的CNBR激活的琼脂糖4B树脂制备的制备性抗原结合柱进一步纯化(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，England)。

为了测量转基因植物材料中PTS和FPS蛋白的水平，将100mg的嫩叶子材料于液氮中磨碎，然后用800μL的80mM的磷酸钾(pH7.0)，10％的甘油，10mM的焦亚硫酸钠，15mM MgCl₂，10mM的抗坏血酸钠，1％)聚乙烯吡咯烷酮和14mM的α-巯基乙醇进行提取。粗蛋白提取物在4℃台式微量离心机上全速离心20分钟，得到的上清液作为蛋白来源。含有40μg的上清液蛋白的样本在15％的SDS-PAGE凝胶中电泳并在消化纤维膜(BIO-RAD，Hercules，CA)上打点。用标准的含有5％奶粉的Tween 80/Tris-buffered saline(TTBS)封闭溶液封闭，然后添加纯化的PTS或FPS抗体。然后将膜在室温下振荡温育3～7小时，用TTBS洗涤3次，然后在室温下用抗兔IgG标记的山羊过氧化酶(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)在TTBS封闭溶液中温育另外3小时。根据制造商手册用ECL试剂盒(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，England)实施二级抗体的化学发光检测。

图5显示了转基因植物中广藿香醇合酶(PTS)蛋白和二磷酸法呢酯合酶(FPS)蛋白的表达水平和处理。图5中泳道上方的数字表示独立的转基因品系，这些品系中设计含有广藿香醇合酶(PTS)基因，或质体定位PTS(tpPTS)基因，或含有广藿香醇合酶和FPS基因的结构(PTS+FPS)，或含有质体定位PTS和FPS(tpPTS+tpFPS)的独特基因的结构，或编码FPS和PTS的融合蛋白(FPS-PTS)的结构，或相应的质体定位融合蛋白(tpFPS-PTS)。使用的阳性对照为PTS和FPS蛋白或从转化为过量表达这些蛋白的细菌中纯化而来的含有氨基末端的质体定位肽的相应蛋白(各个泳道PTS，FPS，tpPTS，tpFPS)。泳道WT1是从野生型植物的叶子中提取的。图上部显示了用PTS抗体探明的膜，而图下部的两个膜显示了用FPS抗体探明的膜。可以看出图5中在野生型植物中在免疫学上没有蛋白被检测到。对大多数转基因品系分析来说，PTS和/或FPS可以在叶子的提取物中被检测到并且表达模式通常与广藿香醇的积聚一致。令人感兴趣的是，在用含有与质体定位序列相连的相应基因的结构转化的植物(例如2tpPTS品系和2tpPTS+tpFPS品系)中发现的PTS和FPS蛋白的表观分子量与在没有质体定位信号(例如PTS，2PTS或2PTS+FPS)的植物或细菌中表达的相同蛋白的分子量相同。另外，在细菌(不能切断定位肽)中用质体定位肽进行的PTS或FPS的表达导致了具有显著较高分子量的蛋白的产生。这些现象显示了叶绿体定位蛋白被有效地处理并且因此这些蛋白实际上被转运到了质体中。

实施例10：[1-¹³C]葡萄糖标记用于显示本发明植物中萜合成的所用的路径

在添加潮霉素(15mg/l)的固态MS培养基上使8PTS10的种子(在细胞溶胶中表达PTS的转基因植物品系)和2tpPTS+tpFPS12的种子(在质体中)发芽。

为进行GC-MS分析，三十株4周大的秧苗随后被转移到含有5ml的不含蔗糖的液体MS培养基的25ml烧瓶中并在黑暗中缓慢振荡(125rpm)温育。1天后，将100mg的[1-¹³C]-葡萄糖(Sigma)加入培养基中并且每隔一天收集植物材料。如实施例7所述提取100mg的样本用于GC分析。

为进行NMR分析，使用上述两种转基因品系的1000株秧苗，100株秧苗在添加了1g的[1-¹³C]-葡萄糖的含有50ml的液体MS培养基的250ml的烧瓶中生长。在1周后收集所有标记的秧苗并按如上方式提取。然后使用硅石TLC盘和正己烷∶乙酸乙酯(9∶1)作为展开液通过制备性TLC分离对浓缩的提取物(3ml)进行纯化。

接下来通过¹³C-NMR(750 mHz，CDCl₃ by Bob Coates in the ChemistryDepartment，University of Illinois，Champaign，IL)分析来自2tpPTS+tpFPS12品系的250μg的纯化的¹³C标记的广藿香醇和来自8PTS10的500μg的广藿香醇。相对于由对照的植物纯化出来的未标记的广藿香醇确定碳的位置和富集度。

图6显示了在供给[1-¹³C]葡萄糖的转基因秧苗中，分别出现在MVA和MEP路径中的从IPP合成的广藿香醇中的预测¹³C标记模式。预测MVA路径中的由IPP合成的广藿香醇在位点1，3，5，7，9，12，13，14和15上具有9个¹³C原子，然而预测与其相对的来自MEP的广藿香醇仅在2，6，8，12，13和15位点上有6个¹³C原子。

GC-MS分析的结果示于图7中，其中图7b显示了由供给¹²C-葡萄糖(对照)的植物合成的广藿香醇的MS母离子，和图7c和图7d显示了供给¹³C-葡萄糖的分别通过(细胞质)MVA和(质体)MEP路径生产广藿香醇的植物。由此看出出现在供给¹³C-葡萄糖的植物的广藿香醇具有较重的离子，并且其具有较不明显的质体广藿香醇：主要母离子的质谱从222变动到225，并且当设计细胞质路径时，可观测到M+8 mass母离子；主要母离子的质谱变动到224并且当设计叶绿体路径时可观测到M+6 mass母离子。这些观测结果与标记预计是一致的。NRM分析的结果示于表2。

表2：通过细胞质MVA路径和质体MEP路径从1-¹³C葡萄糖合成广藿香醇的¹³C富集度

^*由于污染造成的信号

根据图6中显示的预测的标记模式，表2中显示出来自于具有定位于质体的PTS和FPS的植物的广藿香醇中，碳原子2，6，8，12，13和15富集13C。因此标记显示出在质体中倍半萜实际上是由MEP路径生成的IPP来合成。

实施例11：用PTS和FPS基因转化的植物质体基因组

由Maliga实验室(Lutz等，2004)开发的重组克隆进入质体基因组中的系统已经被应用和改进。我们使用烟草LA63作为受体烟草宿主材料。LA63具有可整合到叶绿体基因组DNA中的attB位点，该位点允许外源DNA插入到该位点。合适的转化载体可如图15的I-III所示被重建。我们包括了基于之前公开的文献(Muhlbauerand Koop 2005)的IPTG诱导的Prrn启动子以提供受控的基因表达。

11.1质体转化载体的构建

应用pT7Blue(Novagen，Madison，WI)载体作为骨架构建通用的质体转化载体pLvec(图15I-III)。

图15部分I：

用HindIII限制性酶消化pT7Blue载体DNA。在用T4聚合酶处理和自连接之后，HindIII限制性酶位点被敲除并且得到的质粒被称为ΔHindIII pT7Blue。

由两个引物(pLlinkF和pLlinkR)组成的接头被引入pT7blue的EcoRI/KpnI位点来生产新的多克隆位点SgfI-BamHI-SpeI-NotI-SmaI。以前的EcoRI位点同时通过接头设计除去(EcoRI识别序列的最后的C被除去)。生成的载体称为pLlink。

通过引物attP-XbaF和Attp-SphR对attP重组位点进行扩增并且将其连接到pLlink载体的XbaI-SphI位点并消化为pLattP。

用引物Prrn-XbaF和TrbcL-KpnR扩增aadA盒(包括Prrn启动子和Trbc1终止子)并将其连接到pLattP XbaI-KpnI位点生成pLattP+aadA载体。

用引物Prrn-KpnF和Prrn-SmaR第二次扩增Prrn启动子。用相应的限制性酶消化后，将该片断连接到pLattP+aadA的Kpn-SmaI位点生成pLattp+aadA+prrn。

图15部分II：

用引物Tatp-SmaF和Tatp-NotR从烟草中扩增烟草ATP合酶α亚单位操纵子终止子(Tatp)。该片断被连接到pLattp+aadA+prrn+Tatp载体的SmaI-NotI位点。

用引物LacI-SmaF和LacI-SmaR从大肠杆菌中扩增Lac抑制子基因(LacI基因)。用SmaI消化后，将该片断连接到pLattp+aada+prrn+Tatp载体的SmaI位点生成pLattp+aadA+LacI载体。

用引物Trbc1-SpeF和Trbc1-NotR从烟草中扩增新的终止子Trbc1。用SpedI和NotI消化该扩增片断，并连接到pLattp+aadA+LacI载体上生成pLattP+aadA+1acI+TrbcI。

基于Muhlbauer和Koop(2005)的公开，用PrrnlacI-SgfF作为正向引物和在PrrnlacI-BamHR之后的PrrnlacI-Rlnest作为反向引物通过两步连续的PCR扩增产生IPTG诱导引物PrrnlacI。消化后，PrrnlacI连接到pLattp+aadA+LacI+TrbcI的SgfI-BamHI位点生成通用载体pLvec(图15部分II和部分III)。

图15部分III：

从pB121的Ti载体中用引物GUS-BamF和GUS-SpeR扩增GUS基因。用相应的限制性酶消化后，将GUS基因连接到pLvec载体上生成pLGUS结构。

从用于核转化的ptpFPS+tpPTS结构中用引物FPS-BamF和PTS-SpeR扩增FPS-(AscI)-PTS片断。用相应的限制性酶消化后，将FPS-(AscI)-PTS连接到pLvec上生成pLFPS-PTS结构。

在T/A辅助载体中构建Trbcl-(SpeI)-PrrnlacI结构。使用Trbc1-AscF和Trbc1-SpeR对Trbc1进行第一次PCR扩增并且将其T/A克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)上。为了获得序列定位(sequence orientation)，识别含有5’到3’的从T7启动子到SP6启动子的Trbc1基因的一个克隆并将其用于随后的连接。该中间体载体被称为pTTrbc1。通过使用引物PrrnlacI-SpeF和Prrnlac-AscI-SpeR以如上所述的相同的方法扩增另一个PrrnlacI基因。用SpecI消化后，将PrrnLacI连接到pTTrbc1的SpecI位点。通过关键的(strategic)限制性酶消化来鉴别具有正确方向的克隆并且将其称为pTTrbc1-(SpeI)-PrrnlacI。

用AscI将pTTrbcl-(SpeI)-PrmlacI消化后，将Trbc1-(SpeI)-PrrnlacI片断连接到pLFPS-PTS AscI位点生成最终的LFPS+PTS结构。

11.2质体转化方法

DNA制备和金处理

首先将7.5mg(足够9次射击)的1.0微米的金颗粒(Bio-rad，Hercules，CA)用1ml乙醇灭菌。离心后，除去乙醇并加入111μl的干净的乙醇。将金颗粒分成三等份，每一份为35μl的乙醇/金的混合物。向每等份的乙醇/金中加入1.0ml的灭菌水。以200rpm离心5分钟后，除去水/乙醇的上清液，准备好DNA涂覆的金颗粒。依次添加5μl的质粒DNA(pLGUS或pLFPS+PTS，约1μg/μl)，220μl的灭菌水，250μl的CaCl₂(2.5M)，100μl亚精胺(IM)并充分混合。然后将DNA/金的混合物在冰上温育2分钟，然后离心(5分钟，1000rpm)并且除去上清液。然后将DNA/金小球用600μl的乙醇漂洗并悬浮于36μl的乙醇中置于冰上1小时，然后用于射击(生物弹果处理)。

在冰上DNA/金的沉淀过程中，制备植物材料。将1个月大的LA63品系的消过毒的烟草叶片切割并置于陪替氏(petri dish)培养皿的水润湿过的过滤纸上(5cm LD)。

根据制造商的说明，通过颗粒输送系统(基因枪)(model PDS-1000，Dupont)将10μl的冰处理的于乙醇中的DNA/金小球转入到微载体中并射入到叶子材料中。

“射入”的叶子段被转移到TOM培养基并在黑暗中培养24小时。

然后将叶子段切成小片并转移到含有奇霉素(500ng/l)的TOM培养基中进行愈合再生。

每15天便将叶子段转移到干净的选择盘中直至植物的枝条出现。

再生的枝条被转移到具有相同奇霉素选择的生根培养基中。

按如上所述的方式评估再生的秧苗的GUS表达或萜积聚。使用GUS着色方法进行GUS表达检测。首先，再生的叶子或枝条(仅为GUS构建)用具有(500ng/l)的奇霉素和1mM的IPTG的液体TOM培养基温育3天。被诱发的枝条/叶子转移到GUS着色溶液(50mM的磷酸钾缓冲液，12mM的2-巯基乙醇，0.1％的TritonX-100，500μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-葡萄糖苷酸(ResearchProducts International Corp.，Mt.Prospect，IL)，2.5μM的铁氰化钾，2.5μM的亚铁氰化钾)中另外培养1天，然后在70％的乙醇中脱色。

质体基因组的阳性转化株显示出蓝色的斑。因此其显示了植物的质体基因组DNA被转化以包埋编码倍半萜合酶和二磷酸法呢酯合酶的异源基因。

实施例12：杀虫剂的检测

分别收集2tpPTS+tpFPS-12品系和野生型14-2的三片接近相同生产年龄的(W 5cm×L 8cm)健康的叶子，然后相互等距离(约1cm)地放置在封闭的盒子中。六条商业可得的在发育的中间态阶段的天蛾幼虫(Manduca sexta)(Carolina Bilogical Supply Company，Burlington，NC)被平均地放置在每一片叶子上，因此每一条天蛾幼虫都有相同的机会吃到叶子或者向另一条移动。试验进行6小时，然后计算消化掉的叶片面积并记录在移动后每片叶子上的天蛾幼虫的数目。

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序列表

 

<110>肯塔基大学研究机构

 

<120>积聚萜的转化的植物

 

<130>6450-PROV-PCT

 

<160>79

 

<170>Patentln version 3.3

 

<210>1

<211>1845

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>连接到质体转运肽序列的广藿香的广藿香醇合酶的cDNA

 

<400>1

atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg   60

gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac   120

aaggacatca cttccatcgc aagcaacggg ggaagatcta gctgcatgaa ggagctcggc   180

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caagaggtgg tgtctgaatt ctacaaccaa atggagtcag catggaagga cattaatgag    1680

gggttcctca gaccagttga atttccaatc cctctacttt atcttattct caattcagtc    1740

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caaaacatca tcaagcagtt gtaccttcac cctgttccat attaa                    1845

 

<210>2

<211>1314

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>连接到质体转运肽序列的原鸡的二磷酸法呢酯合酶的cDNA

 

<400>2

atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg  60

gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac  120

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<210>3

<211>2979

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>包括质体转运肽序列的融合的广藿香合酶(广藿香)和二磷酸法呢酯合酶

(原鸡)的cDNA

 

<400>3

atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg  60

gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac  120

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gtccatggag aagacgtcct tgataatgct tttgacttca ctaggaacta cttggaatca    1860

gtctatgcaa ctttgaacga tccaaccgcg aaacaagtcc acaacgcatt gaatgagttc    1920

tcttttcgaa gaggattgcc acgcgtggaa gcaaggaagt acatatcaat ctacgagcaa    1980

tacgcatctc atcacaaagg cttgctcaaa cttgctaagc tggatttcaa cttggtacaa    2040

gctttgcaca gaagggagct gagtgaagat tctaggtggt ggaagacttt acaagtgccc    2100

acaaagctat cattcgttag agatcgattg gtggagtcct acttctgggc ttcgggatct    2160

tatttcgaac cgaattattc ggtagctagg atgattttag caaaagggct ggctgtatta    2220

tctcttatgg atgatgtgta tgatgcatat ggtacttttg aggaattaca aatgttcaca    2280

gatgcaatcg aaaggtggga tgcttcatgt ttagataaac ttccagatta catgaaaata    2340

gtatacaagg cccttttgga tgtgtttgag gaagttgacg aggagttgat caagctaggc    2400

gcaccatatc gagcctacta tggaaaagaa gccatgaaat acgccgcgag agcttacatg    2460

gaagaggccc aatggaggga gcaaaagcac aaacccacaa ccaaggagta tatgaagctg    2520

gcaaccaaga catgtggcta cataactcta ataatattat catgtcttgg agtggaagag    2580

ggcattgtga ccaaagaagc cttcgattgg gtgttctccc gacctccttt catcgaggct    2640

acattaatca ttgccaggct cgtcaatgat attacaggac acgagtttga gaaaaaacga    2700

gagcacgttc gcactgcagt agaatgctac atggaagagc acaaagtggg gaagcaagag    2760

gtggtgtctg aattctacaa ccaaatggag tcagcatgga aggacattaa tgaggggttc    2820

ctcagaccag ttgaatttcc aatccctcta ctttatctta ttctcaattc agtccgaaca    2880

cttgaggtta tttacaaaga gggcgattcg tatacacacg tgggtcctgc aatgcaaaac    2940

atcatcaagc agttgtacct tcaccctgtt ccatattaa                           2979

 

<210>4

<211>1821

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>连接到质体转运肽序列的黄花蒿的紫穗槐-4，11-二烯合酶编码cDNA

 

<400>4

atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg  60

gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac  120

aaggacatca cttccatcgc aagcaacggg ggaagatcta gctgcatgaa gggcgcgccg  180

atgtcactta cagaagaaaa acctattcgc cccattgcca actttcctcc aagcatttgg  240

ggagatcagt ttctcatcta tgaaaagcaa gtagagcaag gggtggaaca gatagtgaat  300

gatttaaaaa aagaagtgcg gcaactacta aaagaagctt tggatattcc tatgaaacat  360

gccaatttat tgaagctgat tgatgaaatc caacgccttg gaataccgta tcactttgaa  420

cgggagattg atcatgcatt gcaatgtatt tatgaaacat atggtgataa ctggaatggt  480

gaccgctctt ccttatggtt ccgtcttatg cgaaagcaag gatattatgt tacatgtgat  540

gttttcaata actataaaga caaaaatgga gcgttcaagc aatcgttagc taatgatgtt  600

gaaggtttgc ttgagttgta cgaagcaact tctatgaggg tacctgggga gattatatta  660

gaagatgctc ttggttttac acgatctcgt cttagcatta tgacaaaaga tgctttttct  720

acaaaccccg ctctttttac cgaaatacaa cgggcactaa agcaacccct ttggaaaagg  780

ttgccaagaa tagaggcggc gcagtacatt cctttctatc aacaacaaga ttctcataac  840

aagactttac ttaaacttgc taagttagag ttcaatttgc ttcagtcatt gcacaaggaa  900

gagctcagcc atgtgtgcaa atggtggaaa gctttcgata tcaagaagaa cgcaccttgt  960

ttaagagata gaattgttga atgctacttt tggggactag gttcaggcta tgagccacag  1020

tattcccggg ctagagtttt cttcacaaaa gctgttgctg ttataactct tatagatgac  1080

acttatgatg cgtatggtac ttatgaagaa cttaagatct ttactgaagc tgttgaaagg  1140

tggtcaatta catgcttaga cacacttcca gaatacatga aaccgatata caaattattc  1200

atggatacat acacagaaat ggaagaattt cttgcaaagg agggaagaac agatctattt  1260

aactgcggca aagaatttgt gaaagagttt gttagaaacc tgatggttga agcaaaatgg  1320

gcaaatgagg gacacatacc aaccactgaa gagcatgatc cagttgtaat cattactggc  1380

ggtgctaacc tgcttacaac aacttgttat cttggcatga gtgatatatt cacaaaagag  1440

tctgtcgaat gggctgtctc tgcacctcct ctttttagat actcaggtat acttggtcga  1500

cgcctaaatg atctcatgac ccacaaggcc gagcaagaaa gaaaacatag ttcatcgagc  1560

cttgaaagtt atatgaagga atataatgtc aatgaggagt atgcccaaac cttgatttac  1620

aaggaagtag aagatgtgtg gaaagatata aaccgagagt acctcacaac taaaaacatt  1680

ccaaggccgt tattgatggc tgtgatctat ttgtgccagt ttcttgaagt tcaatatgca  1740

ggaaaggata acttcacacg tatgggagac gaatacaaac atctcataaa gtctctactc  1800

gtttatccta tgagtatatg a                                            1821

 

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Attp1-SstI-FW(引物)

 

<400>5

agtcacgagc tcgtaaaacg acggcca                                      27

 

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Attp2-SphI-RV(引物)

 

<400>6

gcatgccagg aaacagctat gac                 23

 

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>HPT-NotI-FD(引物)

 

<400>7

gcggccgcat gaaaaagcct gaactc             26

 

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>HPT-Xba1-RV(引物)

 

<400>8

tctagataat tcgggggatc tggat              25

 

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TB-SphI-FD(引物)

 

<400>9

gtggttggca tgcacataca aatgga                                      26

 

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TB-NotI-RV(引物)

 

<400>10

gcggccgcgc gaaacgatcc agatcc                                      26

 

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>HPT-SphI-RV(引物)

 

<400>11

ggggcatgct aattcggggg atctggat                                    28

 

<210>12

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>CSMV-ATTB1-SGFI-FD(引物)

 

<400>12

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg cgatcgccct atgttcaaaa atgaag    56

 

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>CSMV-ECORI-RV(引物)

 

<400>13

tacgaattca caaatttctc tgaagttgtat                               31

 

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Tnos-XhoI-FW(引物)

 

<400>14

cggatgctcg aggatcgttc aaacatttgg c                              31

 

<210>15

<211>49

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Tnos-attB2-RV(引物)

 

<400>15

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg atctagtaac atagatgac          49

 

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>His-EcoF(引物)

 

<400>16

aattcggcgc gccatgcatc atcatcatca tcacg                35

 

<210>17

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>His-EcoR(引物)

 

<400>17

aattcgtgat gatgatgatg atgcatggcg cgccg                35

 

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>mHisPTS-F(引物)

 

<400>18

cttcagagaa atttgtgaat tatacatcat catcatcatc acgg      44

 

<210>19

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>mHisPTS-R(引物)

 

<400>19

ccgtgatgat gatgatgatg tataattcac aaatttctct gaag      44

 

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TP-ASCF(引物)

 

<400>20

ttggcgcgcc tatggcttcc tctatgctct c                        31

 

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TP-ASCR(引物)

 

<400>21

ttggcgcgcc cttcatgcag ctagatcttc c                        31

 

<210>22

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PCaMV-XbaI-FW(引物)

 

<400>22

tcagtttcta gacatggagt caaagattca a                        31

 

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PCaMV-SpeI-RV(引物)

 

<400>23

accatgacta gtcccccgtg ttctctc                     27

 

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>7120D-SpeI-FW(引物)

 

<400>24

actagtatgc aattcttcag cttggttt                    28

 

<210>25

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>7120D-KpnI-RV(引物)

 

<400>25

cggggtacct tactcccgag aaggttgata agg             33

 

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Tnos-KpnI-FW(引物)

 

<400>26

cggggtaccg atcgttcaaa catttggc                   28

 

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Tnos-attB2-RV3(引物)

 

<400>27

gagctcgggg accactttgt a                                            21

 

<210>28

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>CsMV-attB1-Sgf I-FD(引物)

 

<400>28

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg cgatcgccct atgttcaaaa atgaag     56

 

<210>29

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TNOS-XbaI-RV(引物)

 

<400>29

gctctagaga tctagtaaca tagatgac                                    28

 

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TP-SpeFW(引物)

 

<400>30

ggggactagt atggcttcct ctatgctctc         30

 

<210>31

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TP-SpeRV(引物)

 

<400>31

ggggactagt cttcatgcag ctagatcttc c       31

 

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS-AscF(引物)

 

<400>32

ggggagctcg gcgcgccgat ggagttgtat gccc    34

 

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS-XhoR(引物)

 

<400>33

ggggctcgag ttaatatgga acagggtgaa g       31

 

<210>34

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP-SpeFW(引物)

 

<400>34

ggggactagt atgcagcccc atcatcatca taaag                                35

 

<210>35

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP-KpnRV(引物)

 

<400>35

cggggtacct catttctggc gtttgtagat c                                     31

 

<210>36

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPS-AscF(引物)

 

<400>36

ttggcgcgcc tatgcagccc catcatcatc                                       30

 

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPS-AscR(引物)

 

<400>37

ttggcgcgcc ttttctggcg tttgtagatc                     30

 

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS-8F(引物)

 

<400>38

gagtgggtgc tgcttctcgt cctc                           24

 

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS-160R(引物)

 

<400>39

ctccatggac tctgagatgc gtgg                           24

 

<210>40

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP-1F(引物)

 

<400>40

gcagccccat catcatcata aagagg                         26

 

<210>41

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP-160R58(引物)

 

<400>41

gaggactcga ggaggaagga gtc                               23

 

<210>42

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>RBCS-FW(引物)

 

<400>42

atgcaggtgt ggccaccaat t                                 21

 

<210>43

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>RBCS-RV(引物)

 

<400>43

ttagtagcct tctggcttgt a                                 21

 

<210>44

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>ADS-AscF(引物)

 

<400>44

ttggcgcgcc gatgtcactt acagaagaaa aacc                        34

 

<210>45

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>ADS-XhoR(引物)

 

<400>45

ggggctcgag tcatatactc ataggataaa cgag                        34

 

<210>46

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>pLlinkF(引物)

 

<400>46

aattgcgatc gcggattcac tagtgcggcc gccccggggg tac              43

 

<210>47

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>pLlinkR(引物)

 

<400>47

ccccggggcg gccgcactag tgaatccgcg atcgc                       35

 

<210>48

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>attP-XbaF(引物)

 

<400>48

gctctagaga gcaatcgccc tgggtg                          26

 

<210>49

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Attp-SphR(引物)

 

<400>49

gggggcatgc cccggtcaca accccttg                        28

 

<210>50

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Prrn-XbaF(引物)

 

<400>50

gctctagaag agtgtcacct tgacgtgg                        28

 

<210>51

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TrbcL-KpnR(引物)

 

<400>51

ggggtaccgt attcggctca atccttttag                      30

 

<210>52

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Prrn-KpnF(引物)

 

<400>52

ggggtaccag agtgtcacct tgacgtgg                        28

 

<210>53

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Prrn-SmaR(引物)

 

<400>53

tcccccggga aatccctccc tacaactg                         28

 

<210>54

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Tatp-SmaF(引物)

 

<400>54

tcccccggga gaaatattga tcacttttg                        29

 

<210>55

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Tatp-NotR(引物)

 

<400>55

ggggcggccg catttatttc catatatatt   t                 31

 

<210>56

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>LacI-SmaF(引物)

 

<400>56

tcccccggga tgaaaccagt aacgt tatac g                  31

 

<210>57

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>LacI-SmaR(引物)

 

<400>57

tcccccgggt cactgcccgc tttccagtcg                     30

 

<210>58

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TrbcI-SpeF(引物)

 

<400>58

ggactagtaa aacagtagac attagcagat aa                                   32

 

<210>59

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TrbcI-NotR(引物)

 

<400>59

gggggcggcc gcgtattcgg ctcaatcctt ttag                                 34

 

<210>60

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PrrnlacI-SgfF(引物)

 

<400>60

ggggcgatcg cagagtgtca cct tgacgtg gtg                                 33

 

<210>61

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PrrnlacI-R1nest(引物)

 

<400>61

attcgcccgg agttcgctcc cagaaatata ttgttatccg ctcacaatcg tcaatcccac     60

 

<210>62

<211>59

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PrrnlacI-BamHR(引物)

 

<400>62

cgggatccaa atccctccct acaactgtat ccaagcgctt cgtattcgcc cggagttcg        59

 

<210>63

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>GUS-BamF(引物)

 

<400>63

cgggattcat gttacgtcct gtagaaacc                                         29

 

<210>64

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>GUS-SpeR(引物)

 

<400>64

ggactagttc attgtttgcc tccctgctgc                                        30

 

<210>65

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>FPS-BamF(引物)

 

<400>65

cgggattcat gcagccccat catcatcata aag                     33

 

<210>66

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS-SpeR(引物)

 

<400>66

ggactagttt aatatggaac agggtgaag                           29

 

<210>67

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TrbcI-AscF(引物)

 

<400>67

ttggcgcgcc aaaacagtag acat tagcag                        30

 

<210>68

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>TrbcI-SpeR(引物)

 

<400>68

ggactagtgt attcggctca atccttttag                         30

 

<210>69

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>PrrnlacI-SpeF(引物)

 

<400>69

ggactagtag agtgtcacct tgacgtggtg                      30

 

<210>70

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

 

<220>

<223>Prrnlac-AscI-SpeR(引物)

 

<400>70

ggactagtgg cgcgccaaat ccctccctac aactgtatcc           40

 

<210>71

<211>7

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS46抗原肽

 

<400>71

Glu Glu Leu Lys Val Glu Leu

1               5

 

<210>72

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS108抗原肽

 

<400>72

His Ala Thr Ala Leu Ser Phe Arg Leu Leu Arg Gln His Gly Tyr Arg

1               5                   10                  15

Val Ser Cys Glu

            20

 

<210>73

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS353抗原肽

 

<400>73

Asp Glu Glu Leu Ile Lys Leu Gly Ala Pro Tyr Arg Ala

1               5                   10

 

<210>74

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS462抗原肽

 

<400>74

His Val Arg Thr Ala Val Glu Cys Tyr Met Glu

1               5                   10

 

<210>75

<211>10

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>PTS475抗原肽

 

<400>75

Lys Val Gly Lys Gln Glu Val Val Ser Glu

1               5                   10

 

<210>76

<211>11

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP41抗原肽

 

<400>76

Glu Phe Val Gly Phe Phe Pro Gln Ile Val Arg

1               5                   10

 

<210>77

<211>18

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP59抗原肽

 

<400>77

Gly His Pro Glu Val Gly Asp Ala Val Ala Arg Leu Lys Glu Val Leu

1               5                   10                  15

Gln Tyr

 

<210>78

<211>20

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP218抗原肽

 

<400>78

Tyr Lys Ala Ile Val Lys Tyr Lys Thr Ala Phe Tyr Ser Phe Tyr Leu

1               5                   10                  15

Pro Val Ala Ala

            20

 

<210>79

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

 

<220>

<223>FPP320抗原肽

 

<400>79

Pro Glu Lys Val Ala Lys Val Lys Glu Leu Tyr Glu Ala

1               5                   10

Claims (10)

1.改变植物中广藿香醇含量的方法，其中所述植物为天生生产大量的萜的植物，该方法包括以下步骤：

-用至少一种DNA结构转化植物材料，该DNA结构含有包含SEQ ID NO：3的至少一种核苷酸序列，和

-从转化的植物材料中再生出转化的植物。

2.根据权利要求1的方法，其中所述天生生产大量的萜的植物为选自茄科、禾本科或薄荷科的植物。

3.包含SEQ ID NO：3的至少一种核苷酸序列在具有改变的广藿香醇含量的植物生产中的应用，其中所述植物为天生生产大量的萜的植物。

4.根据权利要求3的应用，其中所述天生生产大量的萜的植物为选自茄科、禾本科或薄荷科的植物。

5.生产广藿香醇的方法，该方法包括从积聚广藿香醇的植物中分离出广藿香醇的步骤，所述植物经转化以含有包含SEQ ID NO：3的至少一种核苷酸序列，其中所述植物为天生生产大量的萜的植物。

6.根据权利要求5的方法，其中所述天生生产大量的萜的植物为选自茄科、禾本科或薄荷科的植物。

7.根据权利要求5的方法，其中积聚的广藿香醇至少部分是通过MEP路径生物合成的。

8.根据权利要求5或6或7的方法，其中二磷酸法呢酯合酶为非植物异戊二烯转移酶。

9.根据权利要求5或6或7的方法，其中该植物相对于每克新鲜的叶子积聚了至少10,000ng的广藿香醇。

10.根据权利要求5或6或7的方法，其中该至少一种核苷酸序列被整合到植物的质体DNA上。

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