KR20090022328A

KR20090022328A - 자가 절단 2ａ배열을 포함하는 베타카로틴 생합성용 융합폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR20090022328A
Application number: KR1020070087608A
Authority: KR
Inventors: 하선화; 김주곤; 김정봉; 정하린; 김영미; 서석철
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2007-08-30
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2009-03-04
Also published as: KR100905219B1

Abstract

본 발명은 자가 절단 2A배열을 포함하는 베타카로틴 생합성용 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것으로서 보다 상세하게는 파이토엔 합성 효소, FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소를 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 세포 내에서 안정적으로 파이토엔 합성효소 및 카로틴 불포화 효소를 발현할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드는 베타카로틴 생합성을 위하여 식물체의 대사과정의 조절의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 이로 인해 유용한 대사산물인 베타카로틴 함량의 증진의 목적으로 사용할 수 있다.

유전자 다중 발현, 2A 배열, 파이토엔 합성 효소, 카로틴 불포화 효소, 베타카로틴, 벼, 쌀

Description

자가 절단 2Ａ배열을 포함하는 베타카로틴 생합성용 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Fusion polynucleotide for biosynthesis of beta-carotene comprising self-cleavage 2A sequence and transformed cell using the same}

본 발명은 자가 절단 2A배열을 포함하는 베타카로틴 생합성용 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것으로서 보다 상세하게는 고추 파이토엔 합성 효소, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소를 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다.

분자생물학적 기법이 발전함에 따라 유전공학적 방법에 의해 유용 대사 물질을 생성하거나 더 유용한 물질로 변경코자 하는 방법들이 발전해 왔다. 그 중, 식물을 매개체로 활용하는 식물 대사공학(plant metabolic engineering) 연구, 또는 비 식물유래 고부가 경구용 백신(edible vaccine) 및 의료용 단백질 등을 식물체에서 생산하는 식물 분자농업(plant molecular farming) 연구가 많이 이루어지고 있으나, 여러 가지 기술적인 어려움으로 인해 구체적인 결과는 그다지 많지 않은 실 정이다.

그러한 어려움 중 하나가 대사 과정을 조절하기 위하여 가능한 한 여러 개의 유전자를 동일한 조건에서 동시에 발현시킬 수 있는 기술의 적용인데, 이러한 점에 있어서는 현재까지 담배 등에서 리포터 유전자를 이용한 모델 연구 수준의 보고만 있을 뿐이며, 하나의 프로모터에 의해서는 하나의 유전자만이 발현되는 모노-시스트로닉 mRNA(mono-cistronic mRNA) 생성 기작을 가진 진핵생물(식물, 동물 등)의 특성상 원핵생물과는 달리 다중 유전자의 발현을 동시에 조절하기가 어려운 실정이다.

특히 식물의 경우, 일반적으로 아그로박테리아 매개 T-DNA 삽입 방법에 의한 형질전환이 많이 이루어지는데, 이 경우 다중의 유전자를 동시에 도입하여 발현 시키고자 할 때 사용되는 기술들은 일반적으로 1) 다중 카세트 도입, 2) 아그로박테리아 공동 형질전환, 3) 형질전환체의 교배, 4) 단일 카세트 내에 다중 유전자 도입 방법 등이 있다.

하지만, 다중 카세트 도입방법은 가장 보편적으로 사용되고 있는 방법이나, 도입할 수 있는 전체 카세트 수가 일반적으로 3 내지 4개 카세트를 넘지 않아, 결국, 선발 마커를 제외하면 두개의 목적 유전자 그 이상을 하나의 T-DNA 운반체에서 발현시키는 것은 어렵다고 할 수 있으며, 아그로박테리아 공동 형질전환(co- transformation)의 경우 두 개의 T-DNA 도입을 동시에 선발하기 위해서 각 T-DNA는 다른 종류의 선발마커 보유가 필수적인데, 식물에 따라 형질전환 조건이 특정 선발마커에 국한되어 확립되어 있다고 볼 때, 이 방법은 적용대상 선정시 제한이 큰 단점이 있다. 아울러, 형질전환체의 교배(sexual crossing)에 의한 유전자 집적(gene stacking)의 방법은 개개의 목적으로 이미 도입된 형질전환체의 유용 형질을 교배를 통해 한 식물체로 모을 수 있으나, 장기간이 소요되며, 그 결과를 구체적으로 조절하기 어려운 단점이 있다.

이에, 단일 카세트 내에 다중 단백질 발현 유전자 도입하여, 다중 유전자 발현이 불가피한 대사공학 연구, 스트레스나 병 등에 대한 복합내성 형질을 얻고자 하는 시도가 있어 왔다. 이러한 방법은 진핵생물의 단백질 발현 기작상 주로 목적으로 하는 도입 유전자 사이에 특수 인식 부위를 삽입하는 방법을 사용하고 있다.

본 발명자들은 유전공학적으로 개량된 식물 형질전환체를 개발하기 위하여 연구하여 오던 중, 유전자 다중 발현 기술을 적용하여 카로티노이드가 전혀 생성되지 않는 벼 종자에서 영양학적으로 의미가 있는 베타카로틴을 생성할 수 있는 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터를 개발하고, 이를 이용하여 베타카로틴을 생성하는 형질전환 식물체를 개발함으로서, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 베타카로틴 생합성 유도용 융합 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타카로틴을 생합성할 수 있도록 파이토엔 합성 효소 및 카로틴 불포화 효소를 발현하는 융합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 형질전환용 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환되고, 베타카로틴을 생합성할 수 있는 식물세포 또는 형질전환체를 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드는 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테 리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이 때, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 서열번호 1의 티민(T)는 우라실(U)로 대체하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 공지된 화학적 합성법에 의해서 제조될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 즉, 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

일반적으로 베타카로틴은 도 2의 과정을 통해서 합성된다. 식물체내 본격적인 카로티노이드 생합성 경로는 두 분자의 GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate)가 파이토엔 합성효소(phytoene synthase, PSY)에 의해 촉매되는 중합반응을 통해 탄소 40개의 파이토엔(phytoene, three conjugated double bond) 물질을 합성하면서 시작된다. 파이토엔 불포화 효소(phytoene desaturase, PDS)에 의한 두 단계의 불포화 반응 후에 ζ-카로틴(ζ-carotene, seven conjugated double bond)이 만들어지고 ζ-카로틴 불포화 효소(ζ-carotene desaturase, ZDS)에 의해 두 단계의 불포화 반응이 더 진행되면 그 결과 뉴로스포렌(neurosporene, nine conjugated double bond)를 거쳐 라이코펜(lycopene, 11 conjugated double bond)이 생성된다. 비환형 카로티노이드로서 최종물질인 라이코펜은 두 종류의 환형 카로틴 물질로 전환되는데, 하나는 라이코펜-β-사이클라제(lycopene-β-cyclase, β-LCY)의 두 단계 작용에 의해 γ-카로틴(γ-carotene)를 거쳐 만들어지는 β-카로틴(β-carotene)이고, 다른 하나는 β-LCY와 라이코펜-ε-사이클라제(lycopene-ε-cyclase, ε-LCY)의 공동작용에 의해 각각 γ-카로틴과 δ-카로틴(δ-carotene)을 거쳐 만들어지는 α-카로틴(α-carotene)이다. 그러나 쌀에서는 카로티노이드 생합성의 첫 단계인 파이토엔 합성효소(PSY) 유전자가 발현되지 않음으로서 어떤 종류의 카로티노이드 성분도 생성되지 않는다. 그러나 본 발명자들은 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 상기 효소들을 발현시킴으로서 벼에서 베타카로틴을 합성할 수 있도록 하였다.

상기에서 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)는 GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate) 두 분자를 중합하여 파이토엔(phytoene) 을 생합성하는 기능의 효소로서 본 발명에서의 고추(한국산 녹광 품종)유래 파이토엔 합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 서열을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열일 수 있다.

FMDV(Foot and Mouth Disease Virus) 유래 2A 서열은 특정 부위(2A 배열의 C-말단)에서 비-단백질가수분해 기작(intra-ribosomal 'skip' mechanism during translation)으로 자가 절단되는 서열로서(Donnelly et al., 1997, J. Gen. Virol. 78, 13-21; Ryan et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 2727-2732), 본 발명에서의 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열일 수 있다.

박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)는 식물에서 파이토엔을 라이코펜 물질로 전환시키는데 필요한 두 종류의 불포화 효소인 PDS와 ZDS 기능을 동시에 수행하는 미생물(Erwinia uredovora 또는 Pantoea ananatis) 유래 불포화효소로서 본 발명에서의 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 서열을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 8로 표시되는 염기서열일 수 있다.

한편, 본 발명의 고추 파이토엔 합성 효소, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소의 융합 단백질은 이와 기능적 동등물일 수 있다. 상기에서 기능적 동등물이란 예를 들어, 고추 파이토엔 합성 효소, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소와 각각 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 상기에서 '동등한 생리활성'이란 각각 GGPP(geranylgeranyl pyrophosphate) 두 분자를 중합하여 파이토엔(phytoene) 을 생합성하는 활성, 비-단백질가수분해 기작으로 자가 절단되는 활성 및 파이토엔을 라이코펜 물질로 전환시키기 위한 PDS와 ZDS의 활성을 말한다.

상기 기능적 동등물이란 고추 파이토엔 합성 효소, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열, 박테리아 카로틴 불포화 효소에 대해서 각각 서열번호 5, 서열번호 2, 서열번호 7이 순차적으로 연결된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

상기 기능적 동등물은 각각 고추 파이토엔 합성 효소, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과로 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 각각 고추 파이토엔 합성 효소, FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 각각의 고추 파이토엔 합성 효소, FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성, 용해도 또는 정제능 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase), 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 공지의 식물 형질전환용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 상기 베타카로틴 생성을 위해서 상기 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동가능하게 연결된다. 상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

상기 프로모터로는 벼 배유특이발현 글로블린(globulin, Glb) 프로모터, 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터 및 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터를 포함하며, 바람직하게는 벼 배유특이발현 글로 블린(globulin, Glb) 프로모터이다.

또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 제초제 저항성 Bar유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있지만, 제초제 저항성 Bar유전자가 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 도 1에 개시된 개열지도를 가지는 벡터, 즉, pGlb-PAC 벡터일 수 있다. 상기 pGlb-PAC 벡터는 pMJ-103 벡터를 기본 백본(backbone)으로 하여 벼 배유특이발현 글로블린(globulin, Glb) 프로모터 및 감자 프로테아제 인히비터(protease inhibitor II, PinII)의 터미네이터 사이에 attB1서열, 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 attB2 서열이 순차적으로 연결된 구조물을 포함한다. 이 때 pMJ-103 벡터는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 포함하고 있는 수퍼-바이너리(super-binary) 플라스미드 pSB11 벡터를 백본(backbone)으로 벼 배유특이발현 글로블린(globulin, Glb) 프로모터와 감자 프로테아제 인히비터(protease inhibitor II, PinII)의 터미네이터가 내재되어 있는 일종의 게이트웨이 운반체로서, 식물체 선발인자로 35S 프로모터와 연결된 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하는 벡터이다.

상기의 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법인 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989; by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1984; and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience, 1987).

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 유전자가 도입되도록 하였다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다. 형질전환된 세포로는 아그로박테리움속 미생물(Agrobacterium spp.), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세 스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포일 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefacience) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 벡터가 도입되고, 베타카로틴을 합성하는 형질전환 식물 세포를 제공한다.

형질전환 식물 세포의 제조는 벡터를 식물에 도입하는 당분야에 공지된 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속(Agrobacterium spp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al., EMBO J., 4:227-288,1985).

상기 식물세포는 통상적인 방법에 따라 배양되어 액체 배양물, 캘러스, 원형질 배양물이 될 수 있으며, 분화되어 식물의 조직 또는 식물이 될 수 있다. 즉, 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다.

식물세포의 배양은 식물의 일부를 모체로부터 분리하여 적당한 조건 아래에서 무균적으로 배양하여 생육시키는 것으로 조직 절편의 액체 배양, 조직 절편의 캘러스 배양, 원형질체 배양 등 당업자에게 공지된 어떠한 방식의 것에 의할 수 있으며, 그 배양 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 배양된 식물세포를 식물로 분화시키는 것은 캘러스, 원형질체 형태의 배양된 식물세포를 적당한 조건아래에서 분화를 유도하여 식물의 조직 또는 식물로 분화시키는 것으로 그 분화 조건 및 방법은 당업자에게 공지된 조건 및 방법에 의해 수행될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한, 상기 벡터가 도입되고, 베타카로틴을 합성하는 형질전환 식물을 제공한다.

이 때, 상기에서 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 버즈풋 트레포일, 감자, 개구리밥, 들깨, 비둘기콩 및 완두가 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 고추 파이토엔 합성효소 유전자 및 박테리아 카로틴 불포화 효소를 분리하여 클로닝하고, 벼 코돈 사용빈도표를 활용하여 벼 최적화 FMDV 유래 2A 배열을 암호화하는 염기서열을 정한 다음 이들을 융합한 폴리뉴클레오티드를 제작하였다.

한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 융합 폴리뉴클레오티드에 재조합 핵산서열 부위(attB1 및 attB2)를 부가하고 이를 pDONR201 벡터와 재조합한 뒤, 다 시 pMJ-103 벡터와 재조합하여 최종적으로 pGlb-PAC 벡터를 제작하였다. 아울러 형질전환을 위하여 상기 pGlb-PAC 벡터를 아그로박테리움에 도입하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 형질전환된 아그로박테리움을 이용하여 벼를 형질전환시킨 다음 형질전환된 세포를 선별하여 이를 개체로 분화시켜 형질전환체를 얻었다. 아울러, 형질전환체에서 수확된 종자를 육안으로 확인한 결과, 형질전환되지 않은 것에 비해 황색을 띠고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 형질전환체에서 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드의 도입여부, RNA 수준 및 단백질 수준의 발현여부 및 카로티노이드 합성여부를 확인하였다. 그 결과, 선별된 형질전환체에 융합 폴리뉴클레오티드가 잘 도입되어 있고, 이들이 각각 RNA 수준 및 단백질 수준에서 잘 발현되며, 그 결과로서 카로티노이드, 특히 베타카로틴이 잘 합성됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 형질전환된 세포 내에서 안정적으로 파이토엔 합성효소 및 카로틴 불포화 효소를 발현할 수 있는 융합 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포 또는 형질전환 식물을 제공한다. 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드는 베타카로틴 생합성을 위하여 식물체의 대사과정의 조절의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 이로 인해 유용한 대사산물인 베타- 카로틴의 함량의 증진의 목적으로 사용할 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

FMDV 유래 2A 배열의 벼 최적화 유전자( st2A ) 합성

자신의 특정 C-말단 아미노산 부위(G↓P)에서 자가 절단(self-processing)되는 것으로 알려진 FMDV(foot-and-mouse disease virus) 유래 2A 배열의 아미노산 서열(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP, 서열번호 2)을 이용하여 벼에 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 디자인하였다. 이 때, 디자인은 벼 코돈 이용표(codon usage table)를 이용하였으며, 그 결과, 벼 최적화 염기서열(60bp)을 정하였다. 이 염기서열의 양 말단에 특정 제한효소(PstI 및 SmaI) 인식을 위해 각각 3bp의 뉴클레오티드를 추가하였으며, 최종적으로 서열번호 3(5'-ctgCAGCTCCTCAACTTCGACCTCCTCAAGCTCGCCGGCGACGTCGAGAGCAACGACGGCCCGggc-3', st2A-sense ssDNA)의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 디자인하였다. 아울러, 상기 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 서열번호 4(st2A-antisense ssDNA) 의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 디자인하였다.

디자인된 서열번호 3 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드를 염기서열 합성회사에 의뢰하여 각각 합성한 다음 이를 65℃에서 실온이 될 때 까지 서서히 어닐링(annealing) 반응을 통해 이중 나선 DNA(dsDNA)로 전환시켰다. 전환된 이중 나선 DNA를 제한효소 PstI과 SmaI으로 처리 후 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pKS+벡터(Stratagene)에 클로닝하고, 이를 pBS-st2A 벡터라고 하였다.

< 실시예 2>

고추 PSY 및 미생물 CrtI 유전자 분리

<2-1> 고추 PSY 유전자의 분리

한국산 고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. NocKwang)에서 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase, PSY) 유전자(서열번호 6)의 클로닝을 위해 고추 식물체의 뿌리로부터 분리된 RNA를 사용하였다. 전체 RNA를 분리과정을 상세히 설명하면, 약 1g의 각 시료를 액체질소를 이용하여 막자사발로 분쇄하여 2 ml 튜브에 옮긴 다음 각 튜브에 500 ㎕의 RNA 추출 완충액 (50mM sodium acetate pH 5.5, 150mM LiCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS)과 500㎕ 페놀을 넣고 혼합한다. 혼합액을 65℃에서 10분 동안 처리한 후 상온에서 15분 동안 교반기 (rotary shaker)를 이용해 섞어주었다. 4℃ 에서 원심분리(10000rpm, 10분)한 후 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮기고, 클로로포름 500㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 원심분리 하여 상등액을 취하였다. 여기에 0.6배 부피의 8M 리튬 크로라이드 (LiCl)를 첨가한 후 -20℃에 2시간 이상 보관하였다. 4℃, 12,000rpm에서 20분간 원심분리 후 RNA 침전물을 4M LiCl와 80% 에탄올로 각각 한차례씩 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 50㎕의 증류수에 녹였다. RNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기 (UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량한 후 이용하였다. 이를 주형으로 하여 고추 PSY 유전자 특이 프라이머 세트인 서열번호 9(5'-ATGTCTGTTGCCTTGTTATGGGTT-3', Psy-Fw 프라이머) 및 서열번호 10(5'-TCATGTTCTTGTAGAAGGCACAAG-3', Psy-Rv 프라이머)의 프라이머를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)의 방법으로 고추 PSY 유전자를 분리하였다. 이 때 RT-PCR 반응은 추출한 전체 RNA 약 2㎍ 주형으로 50uM 올리고 dT(oligo dT) 프라이머를 이용해 55℃에서 20분, 99℃에서 5분 처리 후 얼음에서 식힌 후 여기에 다시 RNase H 를 1㎕를 첨가하고 37℃에서 20분간 처리하여 cDNA를 합성(10X RT buffer, 25mM MgCl₂ _,0.1M DTT, RNase OUT, SuperScript_TMRT)하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 프라이머 각각 10pmol를 사용하여 10x Taq 중합효소 버퍼, 250uM MgCl₂ _,100uM dNTP, 1 unit Ex-Taq 중합효소(Takara)를 총 20㎕가 되도록 섞은 후, 94℃ 3분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 30 사이클; 75℃ 5분의 조건으로 수행하였다.

증폭된 PCR 반응산물은 PCR 클로닝 전용 벡터인 pCR2.1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였으며, 이를 pCR2.1-Psy 벡터라고 하였다.

<2-2> 박테리아 CrtI 유전자의 분리

박테리아(Erwinia uredovora, 20D3) 유래 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase, CrtI) 유전자(서열번호 8)의 클로닝을 위해 한국농용미생물보존센터(KACC)로부터 ATCC 19321 균주를 분양받아 게놈 DNA를 통상적인 대장균 게놈 DNA 분리 방법(Molecular cloning)에 따라 분리하였다. 이를 주형으로 하여 박테리아 CrtI 유전자 특이 프라이머 세트인 서열번호 11(5'-ATGAAACCAACTACGGTAATTGGT-3', CrtI-Fw 프라이머) 및 서열번호 12(5'-TCAAATCAGATCCTCCAGCATCAA-3', CrtI-Rv 프라이머)의 프라이머를 각각 10pmol를 사용하여 10x Taq 중합효소 버퍼, 250uM MgCl₂ _,100uM dNTP, 1 unit Ex-Taq 중합효소(Takara)를 총 20㎕가 되도록 섞은 후, 94℃ 3분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 30 사이클; 75℃ 5분의 조건으로 수행하여 박테리아 CrtI 유전자를 분리하였다.

증폭된 PCR 반응산물은 PCR 클로닝 전용 벡터인 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 클로닝하였으며, 이를 pGEM-CrtI 벡터라고 하였다.

< 실시예 3>

베타카로틴 생성용 융합 유전자( PAC )의 제조

<3-1> 파이토엔 합성효소 유전자 및 2A 서열의 연결

베타카로틴을 유도하는 PSY와 CrtI 유전자의 다중발현 유전자(PAC)의 제조를 위해 우선 PSY 유전자 말단에 HindIII 및 PstI 인식부위를 다음과 같이 부가하였다. 이를 간략히 설명하면, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 pCR2.1-Psy 벡터를 주형으로 하여 서열번호 13(5'-ccgaagcttATGTCTGTTGCCTTGTT-3', 5H-Psy 프라이머) 및 서열번호 14(5'-ccgctgcagTGTTCTTGTAGAAGGCA-3', 3P-Psy 프라이머)를 각각 10pmol를 사용하여 10x Ex-Taq 중합효소 버퍼, 250uM MgCl₂ _,100uM dNTP, 1 unit Ex-Taq 중합효소(Takara)를 총 50㎕가 되도록 섞은 후, 94℃ 3분; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 30 사이클; 75℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다.

증폭된 DNA 단편을 제한효소 HindIII와 PstI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pBS-st2A(상기 실시예 1 참조)의 st2A 배열 5’ 상위에 클로닝하였고, 이를 pBS-Psy-st2A 벡터라고 하였다.

<3-2> TP 서열의 클로닝

식물 유래 PSY 유전자에는 베타카로틴 생합성 장소(엽록체 및 전분체를 포함하는 plastid 등)로 PSY 효소 단백질을 이동시키는데 필요한 이동 신호인 Tp(transit peptide)를 내재하고 있지만 박테리아 유래 CrtI 유전자는 부가적인 Tp의 연결이 필요하다. 그러므로 벼 rbcS(ribulose biphophate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자의 Tp인 rbcS-Tp(150bp)를 CrtI 유전자의 5’ 상위에 다음과 같이 연결시켰다.

벼 rbcS 유전자를 보유한 플라스미드 pSK-RTG 벡터(Jang et al., 1999, Mol. Breeding, 5:453-461)를 주형으로 하여 Tp 배열 양쪽말단에 특정 제한효소인 PstI와 NcoI 인식부위가 부가된 프라이머 세트인 서열번호 15(5'-ccgctgcagATGGCCCCCTCCGTGAT-3'. 5P-Tp 프라이머) 및 서열번호 16(5'-ccgccatggCCTGCATGCACCTGAT-3', 3Nc-Tp 프라이머)의 프라이머를 이용하여 94℃ 10초, 60℃ 10초, 72℃ 10초의 30 사이클로 간단한 PCR을 실시하였다

증폭된 160bp 크기의 DNA 단편을 제한효소 PstI와 NcoI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 클로닝하였고, 이를 pGEM-Tp라고 하였다.

<3-3> TP 서열과 CrtI 유전자의 연결

Tp 서열 하위에 CrtI 유전자 연결을 위해 다음과 같이 CrtI 유전자 양 말단에 특정 제한효소인 NcoI과 ApaI 인식부위를 부가한 뒤, 이를 pGEM-Tp와 연결하였다. pGEM-CrtI 벡터를 주형으로 하여 서열번호 17(5'-ccgccATGGAACCAACTACGGTAATT-3', 5Nc-CrtI 프라이머) 및 서열번호 18(5'-ccggggcccTCAAATCAGATCCTCCA-3', 3Ap-CrtI 프라이머)의 프라이머를 를 이용하여 박테리아에서 CrtI 유전자를 증폭한 것 과 같은 조건으로 PCR을 실시하였다.

증폭된 1.5kb DNA 단편을 제한효소 NcoI과 ApaI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 플라스미드 pGEM-Tp의 Tp 배열 3’ 하위에 클로닝하였으며, 이를 pGEM-Tp-CrtI라고 하였다.

<3-4> 파이토엔 합성효소 유전자-2A 서열 및 카로틴 불포화 효소 유전자의 연결

pGEM-Tp-CrtI 벡터내의 Tp-CrtI 유전자 단편을 pBS-Psy-st2A 벡터내의 Psy-st2A 유전자의 3’ 하위에 코딩 프레임(coding frame)이 맞도록 삽입하기 위하여 Tp-CrtI 유전자 양 말단에 다음과 같이 SmaI과 XbaI 인식부위를 부가한 뒤, 이를 pBS-Psy-st2A 벡터에 클로닝하였다. 이를 간략히 설명하면, pGEM-Tp-CrtI 벡터를 주형으로 하여, 서열번호 19(5'-ccgcccgggcATGGCCCCCTCCGTGAT-3', 5Sm-TpCrtI 프라이머) 및 서열번호 20(5'-ccgtctagaTCAAATCAGATCCTCCA-3', 3Xb-TpCrtI)의 프라이머를 이용하여 박테리아에서 CrtI 유전자를 증폭한 것과 같은 조건으로 PCR을 실시하였다.

증폭된 1,642bp DNA 단편을 제한효소 SmaI과 XbaI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 pBS-Psy-st2A 벡터의 Psy-st2A 배열 3’ 하위에 클로닝하였고, 이를 pBS- P sy-st2 A -Tp- C rtI, 즉 pBS-PAC 벡터라고 하였다. 이 때 최종 연결된 PAC 융합 유전자의 전체 염기서열은 2,952bp(서열번호 1)이고 최종 융합 상태에서 전체 염기서열 배열을 한 번 더 시퀀싱 하여 확인하였다.

< 실시예 4>

벼 형질전환용 플라스미드 제작 및 아그로박테리움으로의 형질전환

<4-1> 벼 형질전환용 플라스미드의 제작

벼 배유 특이적 발현을 유도하는 벼 형질전환용 플라스미드 제작을 위해 우선, 상기 실시예 3에서 제작한 pBS-PAC을 주형으로 하여 서열번호 21(5'-aaaaagcaggctATGTCTGTTGCCTTGTT-3', PAC-B1 프라이머) 및 서열번호 22(5'-agaaagctgggtgTCAAATCAGATCCTCCA-3', PAC-B2 프라이머)의 프라이머를 각각 10pmol를 사용하여 10x 중합효소 버퍼, 250uM MgCl₂ _,100uM dNTP, 1 unit Pyrobest 중합효소(Takara)를 총 50㎕가 되도록 섞은 후, 94℃ 3분; 95℃ 30초, 60℃ 30초, 68℃ 1분의 30 사이클; 68℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 이 때, 상기 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍은 양 말단에 박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리아 측 특이적 재조합 핵산서열 부위(attB1과 attB2)의 일부(각 12bp 씩)를 포함하면서 PAC 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록 디자인된 것이다.

증폭된 PCR 산물(2,976bp)을 다시 주형으로 하여 서열번호 23(5'- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3', attB1 프라이머) 및 서열번호 24(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3', attB2 프라이머)을 각각 2pmol를 사용하여 10x 중합효소 버퍼, 250uM MgCl₂ _,100uM dNTP, 1 unit Pyrobest 중합효소(Takara)를 총 50㎕가 되도록 섞은 후, 95℃ 3분; 94℃ 30초, 45℃ 30초, 68℃ 2분의 5 사이클; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 68℃ 2분의 20 사이클; 68℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 이 때, 상기 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머쌍은 각각 박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리아 측 특이 재조합 핵산서열 부위(attB1과 attB2) 전체 (각 29bp 씩)를 양쪽 말단에서 포함하도록 디자인된 것이다.

박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리아 측 특이 재조합 핵산서열 부위(attB1과 attB2)를 가지고 증폭된 PCR된 산물은 박테리오파지가 박테리아에 감염될 때 박테리오파지 측 특이 재조합 핵산서열 부위(attP1과 attP2)를 포함하는 pDONR201(Invitrogen) 벡터와 BP clonase enzyme(Invitrogen) 첨가해 25℃에서 한 시간 동안 BP 반응이라고 일컫는 일차 재조합 반응을 거쳐 pENTR-PAC 벡터를 제작하였다.

상기 pENTR-PAC 벡터내의 PAC 유전자를 최종 벼 형질전환 운반체로 이동시키기 위해 명지대학교에서 제작한 pMJ-103 벡터(그린진바이오)와 LR 클로나제 효소(LR clonase enzyme, Invitrogen) 첨가해 25℃에서 한 시간 동안 LR 반응이라고 일컫는 이차 재조합 반응을 거쳐 최종 벼 형질전환용 발현벡터 pGlb-PAC(도 1 참조)을 제작하였다. 이 때 pMJ-103 벡터는 미생물 선발을 위한 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자를 포함하고 있는 super-binary 플라스미드 pSB11 벡터를 백본(backbone)으로 벼 배유특이발현 글로블린(globulin, Glb) 프로모터와 감자 프로테아제 인히비터(protease inhibitor II, PinII)의 터미네이터가 내재되어 있는 일종의 게이트웨이 운반체로서, 식물체 선발인자로 35S 프로모터와 연결된 제초제 저항성 Bar유전자를 포함하는 벡터이다.

<4-2> 아그로박테리움 형질전환

상기 pGlb-PAC 벡터를 벼 형질전환을 위한 아그로박테리움에 도입하기 위하여 통상적인 방법(tri-parental mating)을 이용하였다. 이를 간략히 설명하면, 우선, vir 유전자를 포함하는 슈퍼 바이너리(super-binary) 플라스미드 pSB1이 들어 있는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주를 테트라사이크린(tetracyclin, 10mg/L)이 함유된 고체 AB배지(AB-t)에서 2 내지 3일 동안 배양(28℃)하였다. 아울러, 컨쥬걸 헬퍼(conjugal helper) 플라스미드 pRK2013을 포함하는 대장균 HB101 균주와 pGlb-PAC를 포함하는 대장균 DH-5α 균주를 각각 카나마이신(kanamycin, 50mg/L)과 스펙티노마이신(50mg/L)이 함유된 고체 LB배지에서 하룻밤 배양(37℃)하여 총 3종의 미생물 콜로니(colony)를 준비하였다.

상기 3종의 콜로니를 영양 아가 플레이트(Nutrient Agar plate, Difco)에서 혼합하여 하룻밤 배양(28℃)한 후 혼합배양된 미생물을 스펙티노마이신(50mg/L)과 테트라사이크린(10mg/L)이 포함된 고체 AB배지(AB-st)에 액체배지(또는 물)로 10배 희석하여 단일 세포 분리(single cell isolation)를 위한 스트릭(streak) 접종하여 3일동안 배양(28℃)하였다. AB-st에서 생성된 단일 콜로니를 한 번 더 고체 AB-st에 스티릭 접종하여 3일 동안 배양(28℃)하여 재 생성된 단일 콜로니를 최종 선발하였다(아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404 pGlb-PAC). 선발된 아그로박테리움을 스펙티노마이신(50mg/L)과 테트라사이크린(10mg/L)이 포함된 액체 YEP배지(YEP-st)에 접종하여 2일 동안 진탕배양(28℃)한 후 플라스미드를 분리하고 제한효소 패턴을 분석함으로써 pGlb-PAC유전자의 아그로박테리움 내의 형질전환을 재확인하였으며, 상기 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404 pGlb-PAC를 벼의 형질전환에 이용하였다.

<실시예 5>

아그로박테리움을 이용한 벼 형질전환

벼 형질전환을 위하여 완숙종자를 이용하였다. 먼저 벼 종자(낙동 품종)의 종피를 제거하여 70% 에탄올에 1분간 침지한 후 멸균수로 2 내지 3회 세척하고 2% 차아염소산 나트륨(sodium hypochloride, 시판 ‘락스’) 용액에 20분간 교반하면서 종자 표면을 살균하였다. 이 후 종자를 멸균수로 4 내지 5회 세척하고 멸균 필터 페이퍼(filter paper)로 건조시켜 캘러스 유도배지(N6 기본배지, 500mg/L proline, 500mg/L glutamine, 3% sucrose, 2mg/L 2,4-D, 0.25% phytagel, pH5.8)에 종자를 치상하였다. 치상한 종자를 28℃ 암조건에서 4 내지 5주 배양시키고 생성된 캘러스에서 식물체로 재 분화 할 수 있는 캘러스(부정배 캘러스, embryogenic callus) 만을 선별하여 형질전환 캘러스로 사용하였다.

pGlb-PAC으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시언스 LBA4404 pGlb-PAC(Agrobacterium tumefaciens LBA4404 pGlb-PAC)를 30시간 배양 후 균액의 농도를 AAM 배지(100 mM acetosyringone 포함)로 OD600=1.0 내지 1.2로 희석하여 상기 부정배 캘러스와 15분간 방치하였다. 캘러스를 멸균된 필터 페이퍼로 건조시킨 후 공동배양배지(N6 기본배지, 500mg/L proline, 500mg/L glutamine, 3% sucrose, 2mg/L 2,4-D, 100 mM acetosyringone, 0.25% phytagel)에서 24℃ 암조건, 2 내지 3일간 공동배양(co-culture)하였다.

표면에 잔류하는 아그로박테리아를 제거하기 위하여, 공동배양한 캘러스를 세포탁심(cefotaxime) 250 mg/L가 첨가된 AAM 배지로 세척한 후 멸균된 여과지에 올려 표면의 수분을 제거한 뒤 선별배지(N6 기본배지, 500mg/L proline, 500mg/L glutamine, 3% sucrose, 2mg/L 2,4-D, 0.25% phytagel, 6mg/L phosphinothricin, 250mg/L cefotaxime, pH5.8)에 옮겨서 형질전환된 캘러스만을 유도되도록 하였다. 2주마다 새로운 선별배지로 계대배양하고 5주 경과 후 선발된 캘러스를 식물체 재분화배지(MS 기본배지, 3% sucrose, 0.5mg/L NAA(naphthaleneacetic acid), 2mg/L kinetin, 250mg/L cefotaxime, 3mg/L phosphinothricin, 0.3% phytagel, pH5.8)에서 배양, 식물체 유도 후에 MS 기본배지에서 기내 순화하였다.

각 단계에서 사용된 배지의 조건을 정리하면 하기 표 1과 같다.

품종	캘러스 유도	전배양	Agrobacterium 공동배양	캘러스 선별	식물체유도	기내순화
종자	N6 기본배지 2,4-D 2mg/L	N6 기본배지 2,4-D 2mg/L	N6기본배지 2,4-D 2mg/L acetosyringone 100mM	N6기본배지 2,4-D 2mg/L PPT(DL-phosphinothricin) 6mg/L	MS기본배지 NAA 0.5mg/L kinetin 2mg/L PPT 3mg/L	MS 기본배지
배양 기간	4~5주	2~3일	2~3일	5주	2~4주	1~2주
항생제 조건	없음			cefotaxime 250mg/L	cefotaxime 250mg/L	cefotaxime 250mg/L

일정 크기로 성장한 개체들은 배양병에서 꺼내서 뿌리를 물로 잘 씻어 준 후 논토양으로 채워진 플라스틱 통에 이식하여 온실에서 생육하였다.

< 실시예 6>

형질전환 벼 식물체로부터 수확된 종자의 확인

상기 벼 형질전환을 통하여 확보된 pGlb-PAC 도입 벼 재분화 식물체 10 개체(PAC2-1, 2-2, 4-2, 4-3, 5, 7, 8, 9, 10, 11)는 형질전환 진행상 재분화 시기가 상이한 관계로 PAC2-1, 2-2, 4-2, 4-3 라인은 T3 종자에서, PAC9, 10, 11 라인은 T2 종자에서, PAC5, 7, 8 라인은 T1 종자 세대에서 베타카로틴 생성에 의한 종자 색깔의 황색 정도를 비교하였다.

이 때 성숙 건조 종자로 수확된 각 라인당 종자를 현미기(TR-200 Electromotion rice husker, Kett 제품)를 이용해 종피를 제거한 후 백미기(Pearlest polisher, Kett 제품)를 이용해 호분층이 제거(1분 동안)된 백미끼리 비교하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 육안 관찰시 T2 또는 T3 세대에 관계없이 PAC10, 11, 2-1, 2-2, 4-2(4-3)의 경우 비슷한 황색 정도가 관찰되었고, 동일한 T2 세대에서 비교했을 때 PAC9 라인의 황색이 PAC10, 11 라인보다 상대적으로 약하고, 전체적으로 T1 세대 종자인 PAC5, 7, 8 라인의 황색 정도가 약했다.

< 실시예 7>

형질전환 식물체의 분석

<7-1> PCR 을 이용한 형질전환의 분석

형질전환 벼 식물체 라인 PAC9, 10, 11, 2-1, 2-2, 4-2, 4-3의 잎 조직을 채취한 후 상용의 게놈 DNA 분리용 키트(Genomic DNA Purification Kit, I.J.BIO DNA System)을 이용하여 게놈 DNA를 분리 정제하고 DNA 용출액은 자외선 흡광도 분석기를 이용하여 A260/A280을 측정하여 정량하였다.

분리한 게놈 DNA 100ng을 주형으로 하여 서열번호 25(5'-GAGATCGAAGCCAATGAC-3', Psy-CT-Fw 프라이머) 및 서열번호 26(5'-GAAGCCTGCACCAATTAC-3', CrtI-NT-Rv 프라이머)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(94℃ 2분; 95℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 30초의 30 사이클 및 72℃ 5분).

그 결과, 도 4A에서 보듯이, 본 발명의 형질전환 벼 식물체 라인에서 370bp의 PCR 산물을 확인할 수 있었으며, 따라서 각각의 라인에서 형질전환이 잘 이루어 졌음을 알 수 있었다.

<7-2> 서던 블럿 방법을 이용한 형질전환의 분석

상기 실시예 <7-1>에서 분리한 게놈 DNA을 통상의 서던 블럿 방법에 따라 각 라인 당 5 ㎍씩 XbaI 제한효소로 절단하여 아가로즈젤에 전기영동하였다. 이를 모세관 이전 방법으로 NC(Nitrocellulose) 막에 이전시키고, ³²P로 표지된 1.5kb 크기의 CrtI 유전자를 탐침(probe)으로 이용하여 서던 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 4B(좌측)에서 보듯이, PAC2-2를 제외한 PAC9, 10, 11, 2-1, 4-2, 4-3에서 예상한 4.1kb 크기의 삽입 유전자를 확인하였다.

아울러, 유전자 삽입 카피수(copy number)를 확인하기 위해 동일한 게놈 DNA을 각 라인 당 5 ㎍씩 EcoRI 제한효소로 절단하여 아가로즈 젤에 전기영동 한 후, 이를 NC 막으로 이전시키고, ³²P로 표지된 1.3kb 크기의 Mar 유전자를 탐침으로 이용하여 서던 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 4B(우측)에서 보듯이 PAC4-2와 PAC4-3은 같은 시그널 패턴을 보여 동일 라인일 가능성을 암시하였을 뿐 아니라 이들을 포함하여 PAC10, 11은 Mar 유전자를 탐침으로 이용시 1카피(copy) 유전자 삽입 시 예상되는 패턴과 정확히 일치하는 두 개의 Mar 시그널 밴드(left board에 위치하는 1.3kb Mar 시그널 밴드와 right board에 위치하는 Mar를 포함하여 삽입 위치에 따라 미지의 벼 게놈 DNA의 EcoRI 부위에서 절단되어 다른 크기로 생성된 Mar 시그널 밴드)를 확실히 보여 주었다. 한편, PAC9, 2-1, 2-2의 경우에도 각각 1, 2, 1개의 Mar 시그널 밴드로 볼 때 1카피 삽입이 예상되기는 하나 벼 게놈 DNA 삽입 시 도입 유전자의 재배열(rearrangement)이 발생했을 가능성을 암시함을 알 수 있었다.

< 실시예 8>

형질전환 식물체의 유전자 발현 분석

형질전환 벼에서 수확된 쌀로부터 전체 RNA를 분리하여 삽입 PAC 유전자의 유전자 다중 발현 부위별 발현 특성을 RT-PCR의 방법으로 조사하였다. 전체 RNA의 분리과정을 상세히 설명하면, 각 라인별 쌀 시료 1그램을 약 2시간 정도 물에 불린 후 액체 질소가 담긴 막자사발에서 충분히 마쇄한 다음, 5ml의 RNA 추출 완충액 [200mM Tris-HCl(pH 9.0), 400mM LiCl, 25mM EDTA(pH 8.2), 1% SDS]과 5ml 페놀을 첨가하여 충분히 혼합하였다. 상기 혼합액을 15ml 튜브에 옮긴 다음 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름 1ml과 페놀 1ml를 첨가하여 잘 섞어준 후(vortexing) 다시 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 다시 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮기고 2ml의 클로로포름을 첨가하여 충분히 혼합하고(vortexing) 분리하는 작업을 2회 반복한다. 상등액을 새 튜브에 옮기고 2.5배 부피의 에탄올과 0.1배 부피의 3M 아세트산 나트륨(sodium acetate, pH 5.2)을 첨가해 -20℃에 1시간 보관하였다. 다음, 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 RNA와 DNA 침전물을 2M 리튬클로라이드(LiCl)용액을 첨가하여 용해한 후 -20℃에 2시간 이상 보관하여 RNA만 침전시켰다. 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 얻은 RNA 침전물을 80% 에탄올로 한차례 씻어준 후 수득한 최종 RNA 침전물을 80 내지 100㎕의 DEPC 용액에 녹였다. RNA 추출액은 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A260/A280를 측정하여 정량하여 mRNA 선별 RT-PCR(mRNA selective RT-PCR)에 이용하였다.

추출한 전체 RNA 1㎍을 주형으로 이용하고 상용의 키트(TAKARA mRNA selective RT-PCR kit [1xRT buffer, 5mM MgCl₂, 1mM dNTP, 50μM Oligo dT primer, RNase inhibitor(0.8units/㎕), AMV RTase XL (0.1units/㎕)], Takara, 일본)를 사용하여 30℃에서 10분, 42℃에서 30분 반응시키고, 4℃에서 냉각시켜 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 PSY 유전자 특이 증폭 프라이머 세트(서열번호 9 및 서열번호 10), Tp-CrtI 유전자 특이 증폭 프라이머 세트(서열번호 19 및 서열번호 20), PAC유전자의 st2A 연결 부위에서 370bp의 SL(small-length)을 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트(서열번호 25 및 서열번호 26), PAC유전자를 전체길이(full-length, FL)로 증폭하는 프라이머 세트(서열번호 27(5‘-ATGTCTGTTGCCTTGTTATGGG-3', PAIC-F1 프라이머) 및 서열번호 28(5'-TCAATCAGATCCTCCAGCA-3', PAIC-R1 프라이머))와 주형으로 사용된 RNA의 상대적인 량이 균일함을 증명하기 위한 벼 글루테린 특이 프라이머 세트(서열번호 29(5'-CCGAGCCCAGGTTCAAGT-3', Glu-F2203 프라이머) 및 서열번호 30(5’-AAGAGGATTCCGCCACATTAT-3', Glu-R2552 프라이머)) 각각 10pmol를 사용하여 10x 중합효소 버퍼, 250uM MgCl₂ _,100uM dNTP, 1 unit Pyrobest 중합효소(Takara)를 총 50㎕가 되도록 섞은 후, 94℃ 3분; 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 30 사이클; 68℃ 10분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 이 때 72℃에서 수행되는 유전자 증폭단계는 합성될 유전자 길이에 비례하여 Psy의 경우 1분, Tp-CrtI의 경우 1분 30초, PAC_SL의 경우 30초, PAC_FL의 경우 3분, 글루테린의 경우 30초간 반응하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이 형질전환되지 않은 낙동벼(종자)에서는 Psy, CrtI, PAC_SL, PAC_FL의 전사체 모두가 전혀 검출되지 않은데 비하여, 형질전환된 벼(종자)에서는 Psy, CrtI, PAC_SL, PAC_FL의 전사체가 모두 뚜렷이 예상 크기에서 검출되었다. 대조구로 증폭된 글루테린 유전자의 발현량을 기준으로 라인별로 비교해 본 결과, PAC 형질전환체 중 4가지 상이한 부위에서 증폭된 유전자의 발현도는 약간의 정도 차이는 있지만 비교적 라인 10 > 2-1 > 4-2 > 9 > 11 순으로 강하게 나타남을 알 수 있었다.

< 실시예 9>

형질전환 식물체 종자의 단백질 분리 및 웨스턴 블랏 분석

형질전환 벼에서 수확된 쌀로부터 조단백질을 분리하여 삽입된 PAC 단백질의 번역 및 축적 정도를 조사하였다. 종자 단백질의 분리과정을 상세히 설명하면, 각 라인별 쌀 두 알을 약 2시간 정도 물에 불려 으깬 후, 200㎕의 요소 시료 완충액(urea sample buffer [0.025M Tris(pH8.8), 4.0%(W/V) SDS, 4.0M Urea, 5%(v/v) 2-mercaptoethanol])을 첨가하여 30분간 충분히 혼합한 후(vortexing) 4℃에서 13,000rpm으로 60분간 원심분리하여 상등액 층을 조심스럽게 새 튜브에 옮겨 단백질을 분리하였다.

추출한 단백질을 정량하여 그 중 20μg을 7.5% Gradi-Gel^TM II(엘피스바이오)에 PAGE 전기영동 후, 니트로셀룰로스 막으로 세미드라이(semidry) 방법으로 이전시켜 웨스턴 블랏 반응을 수행하였다. 우선 5% 탈지분유 용액으로 2시간 반응시킨 멤브레인을 1% Tween-20이 포함된 TBS 완충용액[20mM Tris-HCl(pH 7.5), 137mM NaCl]에 항-PSY-폴리클로날 항체(anti-PSY polyclonal antibody, 프랑스 Bile Camara 박사가 분양)를 1000:1으로 희석한 용액에서 4시간 반응하고 TBS 완충용액으로 10분씩 4번 세정하였다. 상기 멤브레인을 알칼라인 포스파타아제-융합 이차 항체(Alkaline phosphatase(AP) -conjugated secondary antibody)를 6000:1로 희석한 용액에서 1시간 반응시키고, 다시 TBS 완충용액으로 4번 세정한 다음 발색을 위해 멤브레인을 플라스틱 백으로 옮겼다. 준비해 둔 기질 반응 시약(Chromogenic substrate mixture(33㎕ of NBT, 16.5㎕ of BCIP in 5㎖ of alkaline phosphatase buffer), Promega)을 멤브레인에 골고루 도포시킨 후 발색 정도를 관찰해 가며 적당한 발색 시점에서 정지액 [200㎕ of 0.5M EDTA(pH8.0) in 50㎖ of TBS]으로 반응을 정지시킨 후 상온에서 말렸다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 도입된 PSY 단백질의 발현은 예상되는 110kDa 부위에서 검출되었고, 그 축적 정도는 PAC2-1번 라인이 약간 높기는 하나 비교적 비슷한 정도의 발현 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

< 실시예 10>

형질전환 식물체 종자의 카로티노이드 함량 분석

<10-1> 형질전환 식물체 종자의 카로티노이드 함량 분석

카로티노이드 추출에서 HPLC에 의한 정량에 이르기까지 과정 전반을 Minguez-Mosquera 등이 사용한 방법(Minguez-Mosquera et al., J. Agric. Food Chem. 41, 1616, 1993)을 일부 수정하여 사용하였다.

카로티노이드와 카로티노이드 에스테르를 추출하기 위하여 일반 낙동벼와 형질전환 벼 PAC 4-2에서 수확된 쌀 3g을 믹서기에 넣고 분쇄한 후 클로로포름(chloroform) 200mL와 3차 증류수 250mL, 1% BHT(Butylated hydroxytoluene in MeOH)용액 1㎖ 및 내부표준물질(SudanⅡ)을 1mL 넣어서 흔들고 여과하였으며 같은 과정을 2 내지 3회 반복하여 추출액을 합하였다. 추출액에 무수 황산나트륨(sodium sulfate anhydrous)을 넣어서 수분을 제거한 후 회전식 증발기(rotary Evaporator)를 이용하여 농축하였으며 농축된 추출물에 50mL 에틸에테르(ethyl ether)를 넣어 재현탁시킨 후 2.5mL 포화 KOH 용액을 가하여 실온에서 16시간 동안 비누화를 시켰다. 투여된 알칼리를 제거하기 위해서 50mL 증류수로 세 번 용매 분획하고, 에틸에테르층에 다시 무수 황산나트륨를 가하여 수분을 제거한 다음 농축하여 1%의 BHT가 함유된 MeOH:TBME(tert-buthl methyl ether)(1:1, v/v)용액 1mL에 용해시키고 0.45μm 필터를 이용하여 여과한 후 바이얼(vial)에 담아 HPLC 시료로 사용하였다.

HPLC는 Shimadzu 10Avp 펌프 및 컨트롤러에 PDA(SPD-M10Avp)와 YMC(3㎛-C₃₀-reversed phase, 250×4.6 mm) 컬럼과 precolumn (Delta-pak C₁₈ 5 ㎛ 100 Å, waters)을 장착하여 사용하였다. 이동상은 A (MeOH-MTBE-water-triethyl amine, 90:6:4:0.1, v/v/v)와 B (MeOH-MTBE-water-triethyl amine, 6:90:4:0.1, v/v/v) 용매에 의한 gradient 조건으로서 15 분까지 변화 없이(isocratic) 용매 A를 100%로 흘려주다가 40 분까지 용매 B가 100% 되게 하였으며 45 분까지 용매 A로 바꿔서 50분 까지 안정화 시켰다. 파장 450 ㎚, 유량 0.8 ml/min, 시료주입은 30 ㎕로 하였으며, 분석결과는 다음 식에 의해 계산되었다.

계산식(단위: ㎍/100g) = (sample area × internal std 사용량 (0.5mg) × conversion factor(100000)) / (Internal std area × 사용한 시료의 양(3g))

이 때, 표준물질조제는 먼저 내부표준물질 sudanⅡ와 α-, β-카로틴carotene(α-, β-carotene , Sigma)을 제외하고는 모두 Extrasynthese사에서 구입하였으며 가능한 한 빛이 없는 어두운 곳에서 조제하였고 모든 용매에 1%의 BHT를 가하여 산화를 방지하여 알미늄막으로 잘 막아서 -20℃에 냉동보관 하면서 사용하였다.

상기의 HPLC 결과, 도 7A의 카로티노이드 스탠다드 물질(루테인, 지아산틴, 베타카로틴 등) 위치에서 PAC4-2(도 7B) 라인의 경우 전체의 74%를 차지하는 베타카로틴 (403㎍/100g 수준)을 포함하여 상당량의 전체 카로티노이드 (548㎍/100g 수준) 성분이 검출되었다.

<10-2> 형질전환 식물체 종자의 카로티노이드 함량 분석

좀 더 객관적인 함량 분석 자료를 얻기 위하여 식품 성분 분석의 공인기관인 한국식품연구원에 일차로 쌀 시료 3점(일반 낙동, PAC2-1, PAC4-2), 2차로 쌀 시료 4점(일반 낙동, PAC4-2, PAC10-3, PAC11-2)에 대한 베타카로틴 분석(식품공전(2006) 미량영양성분분석시험법)을 의뢰하였다.

그 결과, 일반 낙동벼에서는 베타카로틴이 전혀 검출되지 않은 반면, 일차 분석에서 PAC2-1은 0.474㎎/100g, PAC4-2는 0.536㎎/100g 수준의 베타카로틴이 검출되었고, 이차 분석에서는 PAC4-2는 1.271㎎/100g, PAC10-3에서는 1.000㎎/100g, PAC11-2에서는 0.910㎎/100g 수준의 베타카로틴이 검출되어 본 발명의 베타카로틴 생성용 유전자 다중발현 재조합 유전자 PAC의 도입에 의해 형질전환 쌀 100g당 0.5~1.3㎎ 정도의 베타카로틴이 생성됨을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 재조합 벡터는 형질전환된 세포 내에서 안정적으로 파이토엔 합성효소 및 카로틴 불포화 효소를 발현할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드는 베타카로틴 생합성을 위하여 식물체의 대사과정의 조절의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 이로 인해 유용한 대사산물인 베타카로틴의 함량의 증진의 목적으로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 벡터인 pGlb-PAC 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.(LB, left board; RB, right board; Glb, 벼 배유 특이 발현 유도 글로블린 프로모터; Psy, 한국산 고추 녹광 유래 phytoene synthase; st2A, 벼 최적화 2A 배열; Tp, 엽록체 적중 transit peptide; CrtI, 박테리아 유래 carotene desaturase; 유전자; PinII, 감자 protease inhibitor II 터미네이터; P35S, CaMV 35S promotor; Bar, phosphinothricin acetyltransferase; NOS, nopaline synthase 터미네이터; MAR, matrix attachment region)

도 2는 식물에서 베타카로틴을 포함한 카로티노이드 대사과정을 나타낸 것이다.(GGPS, geranylgeranyl pyrophosphate synthase; PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase; ZDS, ζ-carotene desaturase; β-LCY, lycopene-β-cyclase; ε-LCY, lycopene-ε-cyclase; β-CH, β-carotene hydroxylase; ε-CH, ε-carotene hydroxylase; ZE, zeaxanthin epoxydase; VDE, violaxanthin de-epoxidase; NXS, neoxanthin synthase; CCS, capsanthin-capsorubin synthase)

도 3은 본 발명의 형질전환체의 종자를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 형질전환체에서의 형질전환 여부를 PCR(A) 및 서던 블럿(B)으로 확인한 것이다.(M, 1 kb ladder DNA 크기 측정 마커; PC, 플라스미드 pGlb-PAC DNA; NC, 비형질전환 벼(낙동 품종); 9, 10, 11, 2-1, 2-2, 4-2, 4-3, pGlb-PAC 형질전환 벼 식물체 라인)

도 5는 본 발명의 형질전환체에서의 유전자 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 것 이다.

도 6은 본 발명의 형질전환체에서의 단백질 발현 여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.(GF, 고추 청과(GF, green tissue)의 과육; RF, 고추 적과(RF, red fruit)의 과육)

도 7은 본 발명의 형질전환체에서의 베타카로틴 생성 정도를 HPLC로 분석한 것이다.(L, lutein; Z, zeaxanthin; B-C, beta-carotene)

도 8은 본 발명의 재조합 벡터의 구조 및 이를 이용한 형질전환체에서의 베타카로틴 생성을 나타낸 것이다.

<110> Republic of Korea <120> Fusion polynucleotide for biosynthesis of beta-carotene comprising self-cleavage 2A sequence and transformants transformed thereby <130> NP07-0098 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2952 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAC fusion polynucleotide <400> 1 atgtctgttg ccttgttatg ggttgtttct ccttgtgacg tctcaaacgg gacaggattc 60 ttggtatccg ttcgtgaggg aaaccggatt tttgattcgt cggggcgtag gaatttggcg 120 tgcaatgaga gaatcaagag aggaggtgga aaacaaaggt ggagttttgg ttcttacttg 180 ggaggagcac aaactggaag tggacggaaa ttttctgtac gttctgctat cgtggctact 240 ccggctggag aaatgacgat gtcatcagaa cggatggtat atgatgtggt tttgaggcag 300 gcagccttgg tgaagagaca gctgagatcg accgatgagt tagatgtgaa gaaggatata 360 cctattccgg ggactttggg cttgttgagt gaagcatatg ataggtgtag tgaagtatgt 420 gcagagtacg caaagacgtt ttacttagga acgatgctaa tgactccgga gagaagaaag 480 gctatctggg caatatacgt atggtgcagg agaacagacg aacttgttga tggtccgaat 540 gcatcacaca ttactccggc ggccttagat aggtgggaag acaggctaga agatgttttc 600 agtggacggc catttgacat gctcgatgct gctttgtccg acacagtttc caaatttcca 660 gttgatattc agccattcag agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gaggaagtca 720 agatacagaa actttgacga actataccta tattgttatt acgttgctgg tacggttggg 780 ttgatgagtg ttccaattat gggcatcgca cctgaatcaa aggcaacaac ggagagcgta 840 tataatgctg ctttggcttt ggggatcgca aatcagctga ccaacatact tagagatgtt 900 ggagaagatg ccagaagagg aagagtctat ttgcctcaag atgaattagc acaggcaggt 960 ctatccgacg aagacatatt tgctggaaga gtgaccgata aatggagaat cttcatgaag 1020 aaacaaattc agagggcaag aaagttcttt gacgaggcag agaaaggagt gaccgaattg 1080 agcgcagcta gtagatggcc tgtgttggca tctctgctgt tgtaccgcag gatactggac 1140 gagatcgaag ccaatgacta caacaacttc acaaagagag cttatgtgag caaaccaaag 1200 aagttgattg cattacctat tgcatatgca aaatctcttg tgccttctac aagaacactg 1260 cagctcctca acttcgacct cctcaagctc gccggcgacg tcgagagcaa cgacggcccg 1320 ggcatggccc cctccgtgat ggcgtcgtcg gccaccaccg tcgctccctt ccaggggctc 1380 aagtccaccg ccggcatgcc cgtcgcccgc cgctccggca actccagctt cggcaacgtc 1440 agcaatggcg gcaggatcag gtgcatgcag gccatggaac caactacggt aattggtgca 1500 ggcttcggtg gcctggcact ggcaattcgt ctacaagctg cggggatccc cgtcttactg 1560 cttgaacaac gtgataaacc cggcggtcgg gcttatgtct acgaggatca ggggtttacc 1620 tttgatgcag gcccgacggt tatcaccgat cccagtgcca ttgaagaact gtttgcactg 1680 gcaggaaaac agttaaaaga gtatgtcgaa ctgctgccgg ttacgccgtt ttaccgcctg 1740 tgttgggagt cagggaaggt ctttaattac gataacgatc aaacccggct cgaagcgcag 1800 attcagcagt ttaatccccg cgatgtcgaa ggttatcgtc agtttctgga ctattcacgc 1860 gcggtgttta aagaaggcta tctaaagctc ggtactgtcc cttttttatc gttcagagac 1920 atgcttcgcg ccgcacctca actggcgaaa ctgcaggcat ggagaagcgt ttacagtaag 1980 gttgccagtt acatcgaaga tgaacatctg cgccaggcgt tttctttcca ctcgctgttg 2040 gtgggcggca atcccttcgc cacctcatcc atttatacgt tgatacacgc gctggagcgt 2100 gagtggggcg tctggtttcc gcgtggcggc accggcgcat tagttcaggg gatgataaag 2160 ctgtttcagg atctgggtgg cgaagtcgtg ttaaacgcca gagtcagcca tatggaaacg 2220 acaggaaaca agattgaagc cgtgcattta gaggacggtc gcaggttcct gacgcaagcc 2280 gtcgcgtcaa atgcagatgt ggttcatacc tatcgcgacc tgttaagcca gcaccctgcc 2340 gcggttaagc agtccaacaa actgcagact aagcgcatga gtaactctct gtttgtgctc 2400 tattttggtt tgaatcacca tcatgatcag ctcgcgcatc acacggtttg tttcggcccg 2460 cgttaccgcg agctgattga cgaaattttt aatcatgatg gcctcgcaga ggacttctca 2520 ctttatctgc acgcgccctg tgtcacggat tcgtcactgg cgcctgaagg ttgcggcagt 2580 tactatgtgt tggcgccggt gccgcattta ggcaccgcga acctcgactg gacggttgag 2640 gggccaaaac tacgcgaccg tatttttgcg taccttgagc agcattacat gcctggctta 2700 cggagtcagc tggtcacgca ccggatgttt acgccgtttg attttcgcga ccagcttaat 2760 gcctatcatg gctcagcctt ttctgtggag cccgttctta cccagagcgc ctggtttcgg 2820 ccgcataacc gcgataaaac cattactaat ctctacctgg tcggcgcagg cacgcatccc 2880 ggcgcaggca ttcctggcgt catcggctcg gcaaaagcga cagcaggttt gatgctggag 2940 gatctgattt ga 2952 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> self-cleavage 2A amino acid sequence <400> 2 Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A nucleotide sense sequence <400> 3 ctgcagctcc tcaacttcga cctcctcaag ctcgccggcg acgtcgagag caacgacggc 60 ccgggc 66 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A nucleotide antisense sequence <400> 4 gcccgggccg tcgttgctct cgacgtcgcc ggcgagcttg aggaggtgga agttgaggag 60 ctgcag 66 <210> 5 <211> 419 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 5 Met Ser Val Ala Leu Leu Trp Val Val Ser Pro Cys Asp Val Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Gly Phe Leu Val Ser Val Arg Glu Gly Asn Arg Ile Phe Asp 20 25 30 Ser Ser Gly Arg Arg Asn Leu Ala Cys Asn Glu Arg Ile Lys Arg Gly 35 40 45 Gly Gly Lys Gln Arg Trp Ser Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Gly Ala Gln 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Ser Ala Ile Val Ala Thr 65 70 75 80 Pro Ala Gly Glu Met Thr Met Ser Ser Glu Arg Met Val Tyr Asp Val 85 90 95 Val Leu Arg Gln Ala Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu Arg Ser Thr Asp 100 105 110 Glu Leu Asp Val Lys Lys Asp Ile Pro Ile Pro Gly Thr Leu Gly Leu 115 120 125 Leu Ser Glu Ala Tyr Asp Arg Cys Ser Glu Val Cys Ala Glu Tyr Ala 130 135 140 Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Met Leu Met Thr Pro Glu Arg Arg Lys 145 150 155 160 Ala Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val 165 170 175 Asp Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Ala Ala Leu Asp Arg Trp 180 185 190 Glu Asp Arg Leu Glu Asp Val Phe Ser Gly Arg Pro Phe Asp Met Leu 195 200 205 Asp Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Lys Phe Pro Val Asp Ile Gln 210 215 220 Pro Phe Arg Asp Met Ile Glu Gly Met Arg Met Asp Leu Arg Lys Ser 225 230 235 240 Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala 245 250 255 Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro Ile Met Gly Ile Ala Pro Glu 260 265 270 Ser Lys Ala Thr Thr Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gly 275 280 285 Ile Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala 290 295 300 Arg Arg Gly Arg Val Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Ala Gly 305 310 315 320 Leu Ser Asp Glu Asp Ile Phe Ala Gly Arg Val Thr Asp Lys Trp Arg 325 330 335 Ile Phe Met Lys Lys Gln Ile Gln Arg Ala Arg Lys Phe Phe Asp Glu 340 345 350 Ala Glu Lys Gly Val Thr Glu Leu Ser Ala Ala Ser Arg Trp Pro Val 355 360 365 Leu Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Arg Arg Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala 370 375 380 Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val Ser Lys Pro Lys 385 390 395 400 Lys Leu Ile Ala Leu Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser Leu Val Pro Ser 405 410 415 Thr Arg Thr <210> 6 <211> 1260 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 6 atgtctgttg ccttgttatg ggttgtttct ccttgtgacg tctcaaacgg gacaggattc 60 ttggtatccg ttcgtgaggg aaaccggatt tttgattcgt cggggcgtag gaatttggcg 120 tgcaatgaga gaatcaagag aggaggtgga aaacaaaggt ggagttttgg ttcttacttg 180 ggaggagcac aaactggaag tggacggaaa ttttctgtac gttctgctat cgtggctact 240 ccggctggag aaatgacgat gtcatcagaa cggatggtat atgatgtggt tttgaggcag 300 gcagccttgg tgaagagaca gctgagatcg accgatgagt tagatgtgaa gaaggatata 360 cctattccgg ggactttggg cttgttgagt gaagcatatg ataggtgtag tgaagtatgt 420 gcagagtacg caaagacgtt ttacttagga acgatgctaa tgactccgga gagaagaaag 480 gctatctggg caatatacgt atggtgcagg agaacagacg aacttgttga tggtccgaat 540 gcatcacaca ttactccggc ggccttagat aggtgggaag acaggctaga agatgttttc 600 agtggacggc catttgacat gctcgatgct gctttgtccg acacagtttc caaatttcca 660 gttgatattc agccattcag agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gaggaagtca 720 agatacagaa actttgacga actataccta tattgttatt acgttgctgg tacggttggg 780 ttgatgagtg ttccaattat gggcatcgca cctgaatcaa aggcaacaac ggagagcgta 840 tataatgctg ctttggcttt ggggatcgca aatcagctga ccaacatact tagagatgtt 900 ggagaagatg ccagaagagg aagagtctat ttgcctcaag atgaattagc acaggcaggt 960 ctatccgacg aagacatatt tgctggaaga gtgaccgata aatggagaat cttcatgaag 1020 aaacaaattc agagggcaag aaagttcttt gacgaggcag agaaaggagt gaccgaattg 1080 agcgcagcta gtagatggcc tgtgttggca tctctgctgt tgtaccgcag gatactggac 1140 gagatcgaag ccaatgacta caacaacttc acaaagagag cttatgtgag caaaccaaag 1200 aagttgattg cattacctat tgcatatgca aaatctcttg tgccttctac aagaacatga 1260 1260 <210> 7 <211> 492 <212> PRT <213> Erwinia uredovora <400> 7 Met Glu Pro Thr Thr Val Ile Gly Ala Gly Phe Gly Gly Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ala Ile Arg Leu Gln Ala Ala Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Glu Gln 20 25 30 Arg Asp Lys Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Val Tyr Glu Asp Gln Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Asp Ala Gly Pro Thr Val Ile Thr Asp Pro Ser Ala Ile Glu 50 55 60 Glu Leu Phe Ala Leu Ala Gly Lys Gln Leu Lys Glu Tyr Val Glu Leu 65 70 75 80 Leu Pro Val Thr Pro Phe Tyr Arg Leu Cys Trp Glu Ser Gly Lys Val 85 90 95 Phe Asn Tyr Asp Asn Asp Gln Thr Arg Leu Glu Ala Gln Ile Gln Gln 100 105 110 Phe Asn Pro Arg Asp Val Glu Gly Tyr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Ser 115 120 125 Arg Ala Val Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Lys Leu Gly Thr Val Pro Phe 130 135 140 Leu Ser Phe Arg Asp Met Leu Arg Ala Ala Pro Gln Leu Ala Lys Leu 145 150 155 160 Gln Ala Trp Arg Ser Val Tyr Ser Lys Val Ala Ser Tyr Ile Glu Asp 165 170 175 Glu His Leu Arg Gln Ala Phe Ser Phe His Ser Leu Leu Val Gly Gly 180 185 190 Asn Pro Phe Ala Thr Ser Ser Ile Tyr Thr Leu Ile His Ala Leu Glu 195 200 205 Arg Glu Trp Gly Val Trp Phe Pro Arg Gly Gly Thr Gly Ala Leu Val 210 215 220 Gln Gly Met Ile Lys Leu Phe Gln Asp Leu Gly Gly Glu Val Val Leu 225 230 235 240 Asn Ala Arg Val Ser His Met Glu Thr Thr Gly Asn Lys Ile Glu Ala 245 250 255 Val His Leu Glu Asp Gly Arg Arg Phe Leu Thr Gln Ala Val Ala Ser 260 265 270 Asn Ala Asp Val Val His Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Ser Gln His Pro 275 280 285 Ala Ala Val Lys Gln Ser Asn Lys Leu Gln Thr Lys Arg Met Ser Asn 290 295 300 Ser Leu Phe Val Leu Tyr Phe Gly Leu Asn His His His Asp Gln Leu 305 310 315 320 Ala His His Thr Val Cys Phe Gly Pro Arg Tyr Arg Glu Leu Ile Asp 325 330 335 Glu Ile Phe Asn His Asp Gly Leu Ala Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Leu 340 345 350 His Ala Pro Cys Val Thr Asp Ser Ser Leu Ala Pro Glu Gly Cys Gly 355 360 365 Ser Tyr Tyr Val Leu Ala Pro Val Pro His Leu Gly Thr Ala Asn Leu 370 375 380 Asp Trp Thr Val Glu Gly Pro Lys Leu Arg Asp Arg Ile Phe Ala Tyr 385 390 395 400 Leu Glu Gln His Tyr Met Pro Gly Leu Arg Ser Gln Leu Val Thr His 405 410 415 Arg Met Phe Thr Pro Phe Asp Phe Arg Asp Gln Leu Asn Ala Tyr His 420 425 430 Gly Ser Ala Phe Ser Val Glu Pro Val Leu Thr Gln Ser Ala Trp Phe 435 440 445 Arg Pro His Asn Arg Asp Lys Thr Ile Thr Asn Leu Tyr Leu Val Gly 450 455 460 Ala Gly Thr His Pro Gly Ala Gly Ile Pro Gly Val Ile Gly Ser Ala 465 470 475 480 Lys Ala Thr Ala Gly Leu Met Leu Glu Asp Leu Ile 485 490 <210> 8 <211> 1479 <212> DNA <213> Erwinia uredovora <400> 8 atggaaccaa ctacggtaat tggtgcaggc ttcggtggcc tggcactggc aattcgtcta 60 caagctgcgg ggatccccgt cttactgctt gaacaacgtg ataaacccgg cggtcgggct 120 tatgtctacg aggatcaggg gtttaccttt gatgcaggcc cgacggttat caccgatccc 180 agtgccattg aagaactgtt tgcactggca ggaaaacagt taaaagagta tgtcgaactg 240 ctgccggtta cgccgtttta ccgcctgtgt tgggagtcag ggaaggtctt taattacgat 300 aacgatcaaa cccggctcga agcgcagatt cagcagttta atccccgcga tgtcgaaggt 360 tatcgtcagt ttctggacta ttcacgcgcg gtgtttaaag aaggctatct aaagctcggt 420 actgtccctt ttttatcgtt cagagacatg cttcgcgccg cacctcaact ggcgaaactg 480 caggcatgga gaagcgttta cagtaaggtt gccagttaca tcgaagatga acatctgcgc 540 caggcgtttt ctttccactc gctgttggtg ggcggcaatc ccttcgccac ctcatccatt 600 tatacgttga tacacgcgct ggagcgtgag tggggcgtct ggtttccgcg tggcggcacc 660 ggcgcattag ttcaggggat gataaagctg tttcaggatc tgggtggcga agtcgtgtta 720 aacgccagag tcagccatat ggaaacgaca ggaaacaaga ttgaagccgt gcatttagag 780 gacggtcgca ggttcctgac gcaagccgtc gcgtcaaatg cagatgtggt tcatacctat 840 cgcgacctgt taagccagca ccctgccgcg gttaagcagt ccaacaaact gcagactaag 900 cgcatgagta actctctgtt tgtgctctat tttggtttga atcaccatca tgatcagctc 960 gcgcatcaca cggtttgttt cggcccgcgt taccgcgagc tgattgacga aatttttaat 1020 catgatggcc tcgcagagga cttctcactt tatctgcacg cgccctgtgt cacggattcg 1080 tcactggcgc ctgaaggttg cggcagttac tatgtgttgg cgccggtgcc gcatttaggc 1140 accgcgaacc tcgactggac ggttgagggg ccaaaactac gcgaccgtat ttttgcgtac 1200 cttgagcagc attacatgcc tggcttacgg agtcagctgg tcacgcaccg gatgtttacg 1260 ccgtttgatt ttcgcgacca gcttaatgcc tatcatggct cagccttttc tgtggagccc 1320 gttcttaccc agagcgcctg gtttcggccg cataaccgcg ataaaaccat tactaatctc 1380 tacctggtcg gcgcaggcac gcatcccggc gcaggcattc ctggcgtcat cggctcggca 1440 aaagcgacag caggtttgat gctggaggat ctgatttga 1479 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psy-fw primer <400> 9 atgtctgttg ccttgttatg ggtt 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psy-rv primer <400> 10 tcatgttctt gtagaaggca caag 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CrtI-fw primer <400> 11 atgaaaccaa ctacggtaat tggt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CrtI-rv primer <400> 12 tcaaatcaga tcctccagca tcaa 24 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5H-psy primer <400> 13 ccgaagctta tgtctgttgc cttgtt 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3P-Psy primer <400> 14 ccgctgcagt gttcttgtag aaggca 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5P-Tp primer <400> 15 ccgctgcaga tggccccctc cgtgat 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3Nc-Tp primer <400> 16 ccgccatggc ctgcatgcac ctgat 25 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5Nc-CrtI primer <400> 17 ccgccatgga accaactacg gtaatt 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3Ap-CrtI primer <400> 18 ccggggccct caaatcagat cctcca 26 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5Sm-TpCrtI primer <400> 19 ccgcccgggc atggccccct ccgtgat 27 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3Xb-TpCrtI <400> 20 ccgtctagat caaatcagat cctcca 26 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAC-B1 primer <400> 21 aaaaagcagg ctatgtctgt tgccttgtt 29 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAC-B2 primer <400> 22 agaaagctgg gtgtcaaatc agatcctcca 30 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 primer <400> 23 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 primer <400> 24 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psy-CT-Fw primer <400> 25 gagatcgaag ccaatgac 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CrtI-NT-Rv primer <400> 26 gaagcctgca ccaattac 18 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIC-F1 primer <400> 27 atgtctgttg ccttgttatg gg 22 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAIC-R1 primer <400> 28 tcaatcagat cctccagca 19 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-F2203 primer <400> 29 ccgagcccag gttcaagt 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-R2552 primer <400> 30 aagaggattc cgccacatta t 21

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 고추 파이토엔 합성 효소(phytoene synthase), 벼 최적화 FMDV 유래 2A 서열 및 박테리아 카로틴 불포화 효소(carotene desaturase)의 융합 폴리뉴클레오티드.
프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서, 상기 벡터는 도 1에 기재된 개열 지도를 가지는 pGlb-PAC 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제2항 또는 제3항의 벡터로 형질전환된 형질전환 세포.
제4항에 있어서, 상기 형질전환 세포는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefacience) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogene)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포.
제2항 또는 제3항의 벡터가 도입되며, 베타카로틴(β-carotene)을 합성하는 형질전환 식물 세포.
제2항 또는 제3항의 벡터가 도입되며, 베타카로틴을 합성하는 형질전환 식물.
제7항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제7항에 있어서, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마, 생강, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 버즈풋 트레포일, 감자, 개구리밥, 들깨, 비둘기콩 및 완두로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 식물.